Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

कैंसर स्टेम सेल प्रवासन compartmentalizing microfluidic उपकरणों और जीना सेल इमेजिंग का उपयोग का मूल्यांकन

Published: December 23, 2011 doi: 10.3791/3297
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 1,2,3, 3,4
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Materials Science Program, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin-Madison, 4Carbone Comprehensive Cancer Center and Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

कैंसर स्टेम सेल प्रवास की जांच करने के लिए एक compartmentalizing microfluidic युक्ति वर्णित है. इस उपन्यास मंच एक व्यवहार्य सेलुलर microenvironment बनाता है और जीवित कोशिका हरकत के सूक्ष्म दृश्य में सक्षम बनाता है. अत्यधिक गतिशील कैंसर की कोशिकाओं को आक्रामक घुसपैठ के आणविक तंत्र, संभवतः अधिक प्रभावी भविष्य उपचार के लिए अग्रणी का अध्ययन करने के लिए अलग कर रहे हैं.

Protocol

1. BTSC सेल हदबंदी

BTSCs पूर्व मौजूदा सीरम मुक्त neurospheres रूप में स्टेम सेल मध्यम में उगाई संस्कृतियों से निकाली गई है. की संस्कृति है जो पहले 10, 11 में वर्णित है.

  1. सेल निलंबन को BTSC व्युत्पन्न neurospheres से तैयार है. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में BTSC व्युत्पन्न neurospheres एकत्र कर रहे हैं और 5 मिनट के लिए 900 rpm पर centrifuged. तेज़ centrifugation और कतरनी और / या क्षति neurospheres कर सकते हैं. तैरनेवाला aspirated और neurosphere संस्कृति के पूर्व गर्म Accutase के 0.5 मिलीलीटर में resuspended है. यह समाधान 5-10 मिनट के लिए 37 में incubated ° C neurospheres ढीला करने के लिए अनुमति देता है. कोशिकाओं यंत्रवत् एक P100 विंदुक के 10-20 कोमल स्ट्रोक और तो स्टेम सेल मध्यम के 1.5 मिलीलीटर कोशिकाओं को जोड़ा गया है के लिए Accutase बेअसर साथ बाधित कर रहे हैं.
  2. - BTSCs फिर 5 मिनट के लिए 1300 rpm पर centrifuged, और स्टेम सेल मध्यम के 1 मिलीलीटर में resuspended.
  3. एक 50 μl अशेष भाजक suspens से निकाल दिया जाता हैआयन और सेल गिनती के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में रखा जाता है. 50 μl trypan नीले Eppendorf ट्यूब से जोड़ा जाता है और निलंबन सेल गिनती के लिए एक hemocytometer में रखा गया है.
  4. यदि सेल गिनती के बाद आवश्यक, अतिरिक्त स्टेम सेल के माध्यम BTSC 20,000 जीवित कोशिकाओं / μl मीडिया के एक सेल घनत्व दे निलंबन करने के लिए जोड़ा है.

2. द्वि स्तरित सु 8 मास्टर और PDMS स्टांप की ढलाई का निर्माण (1 आंकड़ा देखें)

हम ऑप्टिकल लिथोग्राफी और नरम लिथोग्राफी का उपयोग करने के लिए बनाना सु-8 मास्टर और PDMS स्टाम्प, जो microfluidic उपकरणों की विधानसभा के लिए आवश्यक हैं. 12 मानक प्रक्रिया से थोड़ा अलग है, हमारे सु 8 मास्टर दो परतों से बना है. 3 मीटर लंबा microchannels / 1 नीचे की प्रक्रिया में पहले परत में casted हैं, जबकि 250 मीटर लंबा बोने और प्राप्त कक्षों 2 / ऊपरी परत में हैं. आदेश में दो संस्कृति डिब्बों (microchannel के बीच सही कनेक्शन के लिएऔर कक्षों), दो परतों के लिए सही स्थिति में गठबंधन किया जाना है. हालांकि, दूसरी परत की मोटाई अस्पष्टता काफी बड़े के लिए नीचे सुविधाओं तक पहुँचने से aligner / मापकला ऑप्टिकल ब्लॉक हैं. यहाँ हम मापकला मार्करों दूर तैनात किया जा रहा है के साथ मास्क डिजाइन. इस प्रकार, पहली परत में इन मार्करों चुनिंदा जा सकता है, जबकि दूसरी परत कताई परिरक्षित कर सकते हैं. नतीजतन, सुविधाओं की दोनों परतों एक मास्टर में बना रहे हैं और बस PDMS टिकट के राहत में ढलाई के लिए तैयार है.

  1. डिजाइन और दो फोटो मास्क तैयार. एक मुखौटा दो विश्वस्त मार्करों और microchannels की पहली परत के लिए एक सरणी (400 मीटर लंबी और 10-50 सुक्ष्ममापी चौड़ा) के होते हैं. एक और मुखौटा बोने और दूसरी परत के लिए कक्षों (2 मिमी लंबी और 600 मीटर चौड़ी) प्राप्त होते हैं. दोनों मास्क Illustrator (एडोब, कैलिफोर्निया) में तैयार कर रहे हैं, पारदर्शिता (पतला धातु पार्ट्स, कोलोराडो) फिल्मों, isopropanol और हवा सूखे के साथ साफ पर लेजर छपी.
  2. पहली परत के साथ बनाओसु 8 (MICROCHEM, मैसाचुसेट्स) photoresist आपूर्तिकर्ता से उत्पाद मैनुअल के अनुसार. सबसे पहले, स्पिन कोट सु-8 (5) के photoresist 3 सुक्ष्ममापी मोटी के साथ संभाल वफ़र (WRS सामग्री, कैलिफोर्निया) नरम - पाक द्वारा पीछा किया. photoresist तो है पराबैंगनी उजागर और करीबी संपर्क में इसी मुखौटा, पोस्ट - पाक और विकासशील द्वारा पीछा के साथ इलाज.
  3. स्पिन - कोट 250 सुक्ष्ममापी मोटी सु 8 (2100) के साथ दूसरी परत. आदेश में पहली परत से मापकला मार्करों अवरुद्ध से मोटी photoresist को रोकने के लिए, हम स्कॉच टेप के साथ दूसरी परत के स्पिन कोटिंग करने के लिए पूर्व में इन क्षेत्रों को कवर किया. टेप फिर से खुली है संरेखण उद्देश्य के लिए मार्कर प्रकट.
  4. यूवी 2 नकाब के साथ 2 परत बेनकाब. साथ मार्करों संरेखण से पता चला है, यह स्पष्ट है उन्हें दूसरा ऑप्टिकल मुखौटा aligner का उपयोग नकाब में लोगों के लिए पंक्ति. photoresist की दूसरी परत है तो पराबैंगनी उजागर और करीब संपर्क में इलाज, पोस्ट - पाक और विकासशील द्वारा पीछा किया./ Li>
  5. विरोधी छड़ी परिणामस्वरूप मास्टर कोट. ठीक PDMS निकालने में सहायता, सु 8 वाष्प सतह कोटिंग nonstick प्रकार बयान के माध्यम से मास्टर silanized जा सकता है. बस यह एक desiccator में trichloro की कई बूँदें (1h, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) के तहत निर्वात silane समाधान के साथ कम से कम एक घंटे के लिए जगह है,.
  6. गुरु के साथ PDMS ढालना. मिक्स prepolymer आधार है और अच्छी तरह से 10:01 अनुपात में PDMS 184 Sylgard (डॉव Corning, मिशिगन) की संसाधक. यह निर्वात degassing के लिए एक desiccator में रखें जब तक कोई हवाई बुलबुले में देखा जाता है. मुखौटा और degas पर मिश्रण डालो फिर अगर नए हवाई बुलबुले शुरू की है. 90 सी पर 2 घंटे के लिए एक स्तर hotplate पर मोल्ड चिकित्सा के बाद यह कमरे के तापमान पर ठंडा है, धीरे PDMS टिकट जारी. इस प्रकार, संवर्धन चैनलों PDMS में उत्कीर्ण हैं और डिवाइस के विधानसभा के लिए तैयार है. मास्टर ढलाई के लिए पुन: प्रयोज्य है जब तक यह फटा है या पहना. विरोधी छड़ी कोटिंग के लिए फिर से प्रदर्शन किया जा सकता है जब चिपचिपाहट आएगा की जरूरत है.

3.Microfluidic उपकरणों और कोशिका संवर्धन के विधानसभा (2 आंकड़ा)

संस्कृति कोशिकाओं को आदेश में, सुविधा उत्कीर्ण PDMS स्टांप एक गिलास coverslip संलग्न चैनलों के रूप में जुड़ा हुआ है. Inlets और दुकानों संस्कृति / मीडिया को लोड करने के लिए बनाया जाता है. इस बीच, गिलास सब्सट्रेट और PDMS स्टांप सफाई और अन्य प्रक्रियाओं सेल संगतता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं.

  1. PDMS स्टांप बायोप्सी छेद छेद करनेवाला यंत्र का उपयोग कर के माध्यम से जलाशयों करें. हम उनके 6 मिमी व्यास के लिए चुनते हैं. इन जलाशयों दो उद्देश्यों के लिए की सेवा. एक सेल के विकास के लिए अतिरिक्त पोषक तत्व पकड़ है. अन्य विंदुक लोड हो रहा है और वैक्यूम आकांक्षा के उपयोग के लिए है.
  2. भिगोएँ इथेनॉल के 70% में 30 मिनट के लिए PDMS टिकट और फिर एक और 10 मिनट के लिए de-ionized पानी के साथ कुल्ला. उद्देश्य संभावित जैविक निर्माण प्रक्रिया के दौरान शुरू की है, और PDMS संदूषण uncrosslinked बच स्पष्ट है. अधिक तीव्र और पूरी तरह से जैविक 13 निकासी के रूप में सफाई प्रक्रियाओं 14 निष्कर्षण अन्यत्र इस्तेमाल किया गया. हालांकि, हम यह BTSC संस्कृति में अनावश्यक पाया.
  3. आटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस, 35 मिनट) का उपयोग PDMS स्टांप जीवाणुरहित. यह कदम आगे crosslink PDMS की प्रतिक्रिया से पूरा करती है. इस कदम से शुरू कर रहा है और 3.6 कदम जब तक सभी प्रक्रियाओं को बाँझ तरीके से लिया जाता है.
  4. PDMS स्टांप तो एक गिलास coverslip, जो पहले पाली एल Lysine साथ लेपित है पर रखी 15-17 डिवाइस है तो चैनल 37 पर laminin रातोंरात समाधान के साथ डिग्री सेल्सियस भरने laminin साथ लेपित Laminin डिवाइस से aspirated है और इस उपकरण में स्टेम सेल के माध्यम से धोया जाता है.
  5. जलाशयों और चैनलों में 1 कदम से सेल निलंबन लोड. Dissociated कोशिकाओं के 11 μl एक बोने जलाशय में रखा जाता है. वैक्यूम आकांक्षा को बोने के चेंबर में कोशिकाओं को मजबूर, यदि आवश्यक हो तो किया जाता है. कोशिकाओं के एक अतिरिक्त 7 μl आसपास के बोने जलाशय रखा जाता है. नोट: औसत घनत्व सेल 20,000 कोशिकाओं / μl मीडिया है. पिछाड़ीपाँच मिनट, बोने और प्राप्त जलाशयों एर मीडिया के साथ पानी भर रहे हैं.
  6. एक 0.5-1 मिमी पूर्व autoclaved शीर्ष पर PDMS चादर प्लेस. स्वाभाविक रूप से हुई दो PDMS टुकड़ों के बीच सतह आसंजन सेल संस्कृति सील और परिवहन ऊष्मायन, और सूक्ष्म इमेजिंग के लिए तैयार कर देगा.

4. लंबी अवधि के BioStation आईएम (Nikon उपकरण इंक, Melville, संयुक्त राज्य अमरीका) साथ समय चूक BTSC प्रवास के इमेजिंग के.

कैमरा संयोजन, सॉफ्टवेयर और इनक्यूबेटर सब एक बॉक्स में, इस सूक्ष्म प्रणाली दिनों के लिए कोई अशांति के साथ छवि सेल संस्कृति के लिए संभव बनाता है. इसके अलावा, अपनी अनूठी मोटर डिजाइन उद्देश्य लेंस चलता रहता है और नमूना मंच सुविधा बिंदु पर जाकर में स्थिर रहता है. यह छवि समानांतर उच्च throughput परख में प्रयोगों के लिए और ट्रैक सेल हरकत व्यावहारिक बनाता है.

  1. पूर्व 45 मिनट के लिए Biostation आईएम समभार बनाना तापमान, नमी और हवा की आपूर्ति को स्थिर. कई पानी cont के अलावानमूना कक्ष में ained व्यंजन उचित नमी बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. माइक्रोस्कोप का नमूना कक्ष में डिवाइस सेल निहित लोड, और केन्द्र सूक्ष्म चिमटी का उपयोग कर.
  3. ध्यान केंद्रित, Biostation सॉफ्टवेयर में स्थिति अंक समय अंक निर्धारित करें और समय चूक शुरू.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

दृश्य निरीक्षण और compartmentalizing microfluidic डिवाइस का उपयोग करके कैंसर सेल प्रवास के लक्षण वर्णन के उदाहरण चित्रा 3 और 4 चित्र में सचित्र हैं. सेल लाइन BTSC है. हमारे मौजूदा सेटअप के साथ, सेल संस्कृति के चरण छवियों लगातार 5 दिन (चित्रा 3) के रूप में लंबे समय के रूप में हर 2 सेकंड (चित्रा 4) के रूप में अक्सर के रूप में दर्ज किया जा सकता है. 5 दिनों के अलावा, संस्कृति मीडिया पोषक पुनःपूर्ति और अपशिष्ट हटा के लिए जगह की जरूरत है. हमारी लंबी अवधि के समय व्यतीत हो जाने के अपने प्रवास के दौरान morphological परिवर्तन के आधार पर छह चरणों के सेल एक परिक्रामी अनुक्रम को पहचानती है. Illus के रूप मेंचित्रा 3 में trated, हम उन्हें (i) पूर्व पलायन (ii), दीक्षा (iii) पथ - अन्वेषण (iv) मंडरा, (v) गंतव्य exloration और (vi) के बाद प्रवास के रूप में वर्णन. प्राप्त चैंबर में, धुरी के आकार कोशिकाओं थोक ट्यूमर है कि विकसित करने के लिए, विभाजन और धीरे - धीरे ओर पलायन कर रहे हैं में के रूप में मंच (i) में रहते हैं. जैसा कि वे microchannel प्रवेश द्वार दृष्टिकोण, कुछ कोशिकाओं के लिए मंच के लिए आगे बढ़ना (ii) जब वे का विस्तार करने के लिए और चिपकने वाला फलाव उत्पन्न करते हैं. उनमें से केवल एक के लिए प्रवेश द्वार पर कब्जा और चरण (iii) जो माइग्रेशन दिशा का पता लगाने कर सकते हैं आगे बढ़ना करने में सक्षम है. एक बार सेल प्रवास दिशा निर्धारित करता है, यह मंच पर आय (iv) क्रूज के लिए एक स्थिर और उच्च गति है, जो पूरे microchannel के माध्यम से किया जाता है में microchannel के माध्यम से. Microchannel, सेल आय के अंत में (v) चरण के लिए चैम्बर प्राप्त की खुली जगह का पता लगाने के लिए, और फिर मंच (vi). Microchannel में, सत्ता ओर पलायन ज्यादातर गतिविधि blebbing के रूप में 4 चित्र में सचित्र उत्पन्न होता है, अमीबाभ cel के समानएल. सेल blebbing और झिल्ली विरूपण पूरी तरह से यहाँ दर्ज हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 microfluidic डिवाइस के निर्माण के Schematics. पूरी प्रक्रिया एक सिलिकॉन 3 इंच संभाल वफ़र पर नरम लिथोग्राफी का एक संशोधित तकनीक के माध्यम से किया जाता है. 3 मीटर लंबा microchannels और संरेखण मार्करों पहली परत के रूप में बना रहे हैं. फिर 250-सुक्ष्ममापी मोटी सु 8 स्पिन लेपित है, जबकि मार्करों संरेखण स्कॉच टेप के साथ आते हैं, ऐसी है कि वे बाद में मोटी photoresist द्वारा दृष्टि अवरुद्ध बिना aligner मुखौटा सुलभ हो सकता है. इस प्रकार, कक्ष सुविधाओं दूसरी परत के रूप में बनाया जा सकता है और सही पहली परत के लिए गठबंधन किया है. PDMS स्टांप अंततः बंद परिणामस्वरूप मास्टर ढाला है.

चित्रा 2
चित्रा 2 विधानसभा डिवाइस और सेल बोने प्रक्रिया के schematics. PDMS और जीएल द्वारा संलग्नगधा coverslip, 3 डी संवर्धन अंतरिक्ष कक्षों, जलाशयों और microchannels से बना है. बोने चैम्बर सेल संस्कृति से भरा है, जबकि प्राप्त चैम्बर शुरू में सेल से मुक्त मीडिया के साथ भरा है. microchannels है कि उन दोनों के बीच कनेक्ट बोने की ओर से प्राप्त करने के लिए पक्ष सेल ओर पलायन निशान प्रदान करते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. Microchannel के माध्यम से BTSC प्रवास. ऊपरी: समय चूक की फोटो दिखाने के लिए एक एकल (हरे रंग में हाइलाइट) सेल 400 सुक्ष्ममापी पर बोने की ओर से प्राप्त करने की ओर migrates. पूरी यात्रा के बारे में 2 दिन लगते हैं, सेल morphological परिवर्तन के एक दृश्य शामिल हैं. पैमाने बार 40 सुक्ष्ममापी है. छह चरणों के प्रवास एक कार्टून प्रतिनिधित्व: कम. पूर्व प्रवास (i): बोने कक्ष में, धुरी के आकार और विभाज्य कोशिकाओं को धीरे - धीरे एक दूसरे के साथ विस्थापित. सेल शरीर और ई ध्रुवीकरण से एक दूसरे के साथ microchannel प्रवेश दौड़ निकट कोशिकाओं lamellipodia फलाव xerting. शुरूआत (ii): उच्चतम क्षमता के साथ प्रवासी सेल चैनल प्रवेश द्वार में रह रहे हैं, जबकि अपने प्रतियोगियों को पीछे हटना होगा. पथ - अन्वेषण (iii): थोड़ा polarity के साथ एक अमीबाभ मोड प्रवासी सेल परिवर्तन. इस माइग्रेशन मोड अत्यंत गतिशील है और सभी दिशाओं में छोटे झिल्ली protrusions blebbing द्वारा पथ का पता लगाने में सक्षम है. मंडरा (iv): एक बार प्रवास पथ निर्धारित किया जाता है, सेल एक अतिरिक्त बड़े फलाव आगे शीर्षक को बनाए रखने के द्वारा एक अनुकूलित अमीबाभ मोड में बदल देती है. इस तरह, सेल एक उच्च गतिशीलता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक स्थिर गति और दिशा की पुष्टि की. गंतव्य अन्वेषण (v): पथ के अंत होने पर, सेल धीमा और filopodias विकसित करने के लिए किसी भी आक्रमण लक्ष्य के लिए प्राप्त कक्ष का पता लगाने. (Vi) पोस्ट प्रवास: प्राप्त चैम्बर में प्रवेश करने के बाद, स्टार के आकार का सेल में बदल जाता है और उच्च गतिशीलता लेकिन कोई निर्धारित दिशा को बरकरार रखे हुए है.

"/>
(एबी): समय चूक की चित्रा 4 फोटो एक BTSC की गतिविधि और झिल्ली विरूपण blebbing के चक्र दिखा. दीक्षा, (बी). विस्तार, (लोमो). त्याग. तीर और वक्र लाइनों झिल्ली विरूपण की दिशा और स्थान, क्रमशः का प्रतिनिधित्व करते हैं. फोटो हर 8 सेकेंड एकत्र कर रहे हैं.

Discussion

microfluidic डिवाइस और छवि रिकॉर्डिंग तकनीक यहाँ प्रस्तुत सेलुलर आकारिकी प्रवास के दौरान एक दृश्य विशेषताओं में सक्षम बनाता है. मौजूदा पारंपरिक तरीकों की तुलना में, मंच microfluidic लागत प्रभावशीलता और उच्च throughput, डिजाइन लचीलापन लाभ. प्रस्तुत सूक्ष्म दृश्य प्रणाली और लंबे समय तक रहते सेल प्रवास के अध्ययन रिकॉर्डिंग परमिट. लेंस सुविधा मोटर चालित यह करने के लिए एक उच्च संकल्प छवि में नमूना परेशान करने के बिना कई प्रवास पथ को ट्रैक करने के लिए संभव बनाता है.

डिवाइस की सभा के दौरान, PDMS स्टांप गैर स्थायी रूप से PDL कोटिंग की सुविधा (3.4 कदम) के लिए कांच coverslip बंधुआ है. यह इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक अच्छा मुहर हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण है. या सब्सट्रेट पर धूल मलबे / टिकट में हवाई बुलबुले के रूप में उपकरण निर्माण, से शुरू संदूषण संबंध और लीक द्रव में परिणाम को ख़तरे में डालना कर सकते हैं. इसलिए treati,धूल से मुक्त तरीके में डिवाइस एनजी युक्ति विफलता को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. PDL कोटिंग करने के लिए पहले, कांच coverslips इलाज नाइट्रिक एसिड और PDL समाधान / धूल मलबे को खत्म करने के लिए centrifuged है. हम स्कॉच टेप मिल जाए, शराब कुल्ला, और पानी का स्नान बहुत PDMS टिकट से धूल / मलबे को हटाने में मददगार है, अगर एक साफ कमरे सुलभ नहीं है. PDMS स्टांप कांच coverslip के साथ संपर्क बनाने के बाद, मुहर टिकट चिमटी के साथ धीरे दोहन की सुविधा.

BTSCs स्टेम सेल के माध्यम में संस्कृति क्षेत्र, सामान्य तंत्रिका स्टेम सेल 10 की संस्कृति के लिए इसी तरह की के माध्यम से मानव ऑपरेटिंग कमरे नमूनों से समृद्ध किया जा सकता है. इस तरीके में समृद्ध BTSCs (CD133, nestin) स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति, एकाधिक तंत्रिका प्रजातियों (glial और neuronal) भेदभाव, और के रूप में 100 के रूप में कुछ के साथ एक orthotopic immunodeficient माउस मॉडल में ट्यूमर दीक्षा के रूप में स्टेम सेल की तरह गुण, प्रदर्शन 18 कोशिकाओं. हालांकि कुछ बहस के बारे में मौजूद purifiकटियन और 1 BTSCs, 19-21 के रखरखाव, क्षेत्र के विकसित BTSCs बेहतर बनाए रखने के और माता पिता 22-24 ट्यूमर के phenotype जीनोटाइप.

compartmentalized अंतरिक्ष सेल प्रवास के लिए शारीरिक पर्यावरण mimics. हमारे डिवाइस में BTSC सेलुलर आकारिकी विनियमन द्वारा एक आकार विवश अंतरिक्ष के माध्यम से एक प्रवास की मजबूत क्षमता दिखा रहे हैं. सेल morphological परिवर्तन की हमारी लक्षण वर्णन है कि एक संभव आसन्न मस्तिष्क के BTSC आक्रमण के नए विस्तृत वर्णन मॉडल हो सकता है एक छह चरण अनुक्रम में मोड परिवर्तनों को इंगित करता है. प्रारंभिक दौर में, कोशिकाओं polarity के एक महत्वपूर्ण राशि हासिल करने के लिए और चिपकने वाला protrusions उत्पन्न करने के लिए प्रभावी ढंग से खुद को microchannel अंदर लंगर. एक बार microchannel अधिभोग में सेल की स्थापना की है, यह एक cruising मोड में धर्मान्तरित और एक microchannel के माध्यम से पूरी यात्रा के लिए इस मोड रखता है. इस स्तर पर, BTSC उच्च गतिशीलता और लगातार दिशा को बनाए रखने, लेकिन ऊर्जा संरक्षण. मेंterestingly, यह प्रतीत होता है कि एक समय में एक microchannel एक मंडरा सेल करने के लिए प्रतिबंधित है, ऐसा है कि जब इस मंच पर एक एकल कोशिका आय, microchannel अन्य कोशिकाओं से पीछे हटने. इस तंत्र की संभावना ट्यूमर के प्रसार का प्रभाव सुनिश्चित करता है और microchannel में पोषक तत्वों की overconsumption को रोकता है. Microchannel भर में पलायन को पूरा करने के बाद, एक सेल multidirectional protrusions और आक्रमण लक्ष्य या नया माइग्रेशन पथ के लिए आगे की खोज के लिए अपनी प्रवृत्ति आएगा. compartmentalizing microfluidic डिवाइस प्रदान करता है इन विट्रो में एक उपन्यास मस्तिष्क पैरेन्काइमा BTSC घुसपैठ का अध्ययन करने के लिए एक microenvironment बनाने का मतलब है.

इस विधि को आसानी से कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) और प्रवासी सेल अन्य प्रकार के ट्यूमर से प्राप्त लाइनों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. Microfluidic डिवाइस में संवर्धन कोशिकाओं किसी भी आधुनिक जीव विज्ञान प्रयोगशाला है कि एक मशीन और टिशू कल्चर विशेषज्ञता के साथ सुसज्जित है में किया जा सकता है. एक सु 8 मास्टर, PDMS से लैसकास्टिंग और विधानसभा डिवाइस नरम लिथोग्राफी में कुछ बुनियादी प्रशिक्षण के साथ संभव हैं. इसके अलावा, इस मंच भी ढाल मिक्सर, सतह patterning, तरल पदार्थ नियंत्रण और microelectrode जैसे अन्य कार्यात्मक मॉड्यूल को एकीकृत के साथ अन्य अनुप्रयोगों के लिए बढ़ाया जा.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

पीएसी आंशिक रूप से विस्कॉन्सिन स्टेम सेल ट्रेनिंग प्रोग्राम (PA क्लार्क) के विश्वविद्यालय एक NIH T32 अनुदान के द्वारा समर्थित है. जेएसके HEADRUSH ब्रेन ट्यूमर अनुसंधान प्रोफेसरशिप, रोजर Loff मेमोरियल जीबीएम रिसर्च फंड, और UW फाउंडेशन / न्यूरोसर्जरी ब्रेन ट्यूमर रिसर्च एंड एजुकेशन फंड द्वारा आंशिक रूप से समर्थन किया था. JCW और YH NIH अनुदान NIBIB 1R01EB009103-01 आंशिक रूप से समर्थन कर रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose GIBCO, by Life Technologies 11965 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Ham’s F12 GIBCO, by Life Technologies 31765 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
B27 supplement minus vitamin A GIBCO, by Life Technologies 12587-010 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Antibiotic-Antimycotic (PSA) GIBCO, by Life Technologies 15240 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant GIBCO, by Life Technologies PHG0313 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant GIBCO, by Life Technologies PHG0021 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H1027-250KU Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Laminin (natural mouse) GIBCO, by Life Technologies 23017-015 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Accutase EMD Millipore SCR005 Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Stem cell medium
  • 30 % Hams F12
  • 70% DMEM
  • 1% antibiotic-antimycotic
  • 2% B27 without vitamin A
  • EGF (20 ng/mL) and bFGF/heparin (20 ng/mL bFGF, 5 mg/ml heparin) Mix ingredients and sterile filter before use
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin
  • Aliquot concentration 20 μg/ml
  • For 25 μg: Add 1.25 mL of 5mg/mL Heparin to 25 μg bFGF.
  • For 250 μg: Add 1 mL 5mg/mL Heparin to 250 μg bFGF. Transfer to 15 mL conical and add 11.5 mL 5 mg/mL Heparin to conical.
  • Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
Epidermal Growth Factor (EGF)
  • Aliquot concentration 20 μg/ml
  • For 200 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 15 mL conical and add 9 mL DMEM.
  • For 500 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 50 mL conical and add 24 mL DMEM.
  • Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
Heparin
  • Aliquot concentration 5 mg/ml
  • Weigh out 100 mg heparin.
  • Add 100 mg heparin to 20 mL (70%)DMEM-(30%)F12-(1%)PSA (14 mL DMEM, 6 mL F12, 200 μL PSA)
  • Sterile filter
  • Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C
su-8 photoresist MicroChem Corp.
Silicon handle wafer WRS Materials 3P01-5SSP-INV
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
laminin BD Biosciences 50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration
Biostation IM Nikon Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carke, M. F. Cancer Stem Cells-Perspectives on Current Status and Future Directions. AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research. 66, 9339-9344 (2006).
  2. Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352, 987-996 (2005).
  3. Sahai, E. Mechanisms of cancer cell invasion. Current Opinion in Genetics & Development. 15, 87-96 (2005).
  4. Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E. R., Morrison, S. J. Heterogeneity in Cancer: Cancer Stem Cells versus Clonal Evolution. Cell. 138, 822-829 (2009).
  5. Karnoub, A. E. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449, 557-557 (2007).
  6. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based Devices: New Tools for Studying Cancer and Cancer Stem Cell Migration. Biomicrofluidics. 5, (2011).
  7. Rolli, C. G., Seufferlein, T., Kemkemer, R., Spatz, J. P. Impact of Tumor Cell Cytoskeleton Organization on Invasiveness and Migration: A Microchannel-Based Approach. Plos One. 5, (2010).
  8. Chung, S. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a Chip. 9, 269-275 (2009).
  9. Irimia, D., Toner, M. Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement. Integrative Biology. 1, 506-512 (2009).
  10. Svendsen, C. N. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 85, 141-152 (1998).
  11. Clark, P. A. Glioblastoma cancer stem cells exhibit decreased dependence on exogenous growth factors for proliferation and survival. , Forthcoming Forthcoming.
  12. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37, 551-575 (1998).
  13. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab on a Chip. 7, 987-994 (2007).
  14. Regehr, K. J. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab on a Chip. 9, 2132-2139 (2009).
  15. Dent, E. W. Filopodia are required for cortical neurite initiation. Nature Cell Biology. 9, 1347-1347 (2007).
  16. Hu, X. D., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. Activity-Dependent Dynamic Microtubule Invasion of Dendritic Spines. Journal of Neuroscience. 28, 13094-13105 (2008).
  17. Vitzthum, L. Study of Na(+)/H(+) exchange-mediated pH(i) regulations in neuronal soma and neurites in compartmentalized microfluidic devices. Integrative Biology. 2, 58-64 (2010).
  18. Clark, P. A., Treisman, D. M., Ebben, J., Kuo, J. S. Developmental signaling pathways in brain tumor-derived stem-like cells. Developmental Dynamics. 236, 3297-3308 (2007).
  19. Chen, R. H. A Hierarchy of Self-Renewing Tumor-Initiating Cell Types in Glioblastoma. Cancer Cell. 17, 362-375 (2010).
  20. Pollard, S. M. Glioma Stem Cell Lines Expanded in Adherent Culture Have Tumor-Specific Phenotypes and Are Suitable for Chemical and Genetic Screens. Cell Stem Cell. 4, 568-580 (2009).
  21. Lobo, N. A., Shimono, Y., Qian, D., Clarke, M. F. The biology of cancer stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 675-699 (2007).
  22. Singh, S. K. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  23. Lee, J. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
  24. Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Research. 64, 7011-7021 (2004).

Tags

चिकित्सा अंक 58 BTSC ट्यूमर कैंसर स्टेम सेल सेल प्रवास microfluidics glioblastoma मल्टीफार्मी जीबीएम chemotaxis अमीबाभ mesenchymal haptotaxis PDMS
कैंसर स्टेम सेल प्रवासन compartmentalizing microfluidic उपकरणों और जीना सेल इमेजिंग का उपयोग का मूल्यांकन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P.… More

Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297, doi:10.3791/3297 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter