Utvärdering av cancer Stem Cell Migration Använda Compartmentalizing mikroflödessystem enheter och levande cell imaging

Summary

En compartmentalizing mikroflödessystem enhet för att utreda cancer migrering stamceller beskrivs. Denna nya plattform skapar en livskraftig cellulär mikromiljö och möjliggör mikroskopisk visualisering av levande celler förflyttning. Mycket rörliga cancerceller isoleras för att studera molekylära mekanismer för aggressiv infiltration, vilket kan leda till mer effektiv framtida behandlingar.

Abstract

Under de senaste 40 åren investerat i USA över 200 miljarder dollar på cancerforskning, vilket resulterar i endast en 5% minskning av dödligheten. Ett stort hinder för att förbättra behandlingsresultaten är dåliga förståelsen av mekanismerna bakom cellulär migrering i samband med aggressiv cancer cell invasion, metastasering och terapeutisk motstånd ^1. Glioblastoma multiforme (GBM), den vanligaste primära maligna vuxen hjärntumör ^2, exemplifierar denna svårighet. Trots vanlig kirurgi, strålning och kemoterapi, är patienten medianöverlevnad endast femton månader, beroende på aggressiv GBM infiltration i intilliggande hjärnan och snabb cancer återkommer ^2. Samspelet mellan avvikande cell vandrande mekanismer och tumören mikromiljön skilja sannolikt cancer från normala celler ^3. Därför förbättrar terapeutiska metoder för GBM kräver en bättre förståelse av migration cancercellinjer mekanismer. Senaste arbete tyder THAta små subpopulation av celler i GBM, kan hjärntumör stamceller (BTSC) ansvara för terapeutisk motstånd och återfall. Mekanismerna bakom BTSC vandrande kapacitet först nu börjar att präglas ^1,4.

På grund av en begränsning i visuell inspektion och geometriska manipulation, konventionella analyser migration ⁵ är begränsade till kvantifiera totala cellpopulationer. Däremot mikrofluidikanordningar tillåter en enda cell analys på grund av kompatibilitet med moderna mikroskopi och kontroll över mikromiljö ^6-9.

Vi presenterar en metod för detaljerad karakterisering av BTSC migrering med compartmentalizing mikroflödessystem enheter. Dessa PDMS-tillverkade enheter kastar miljön vävnadsodling i tre anslutna fack: sådd kammare, mottagningskammare och överbrygga mikrokanaler. Vi skräddarsydda anordningen så att båda kamrarna har tillräckliga medier för att stödja livskraftig BTSC i 4-5 days utan media utbyte. Mycket rörliga BTSCs ursprungligen införts i sådd kammaren isoleras efter migreringen men överbrygga mikrokanaler till den parallella mottagningskammaren. Denna migrering simulerar cancer cellulära sprids genom mellanrummen i hjärnan. Fas levande bilder av cellmorfologi under migrering registreras under flera dagar. Långvandrande BTSC kan därför vara isolerade, återodlades och analyseras vidare.

Compartmentalizing mikrofluidik kan vara en mångsidig plattform för att studera flyttande beteende BTSCs och andra cancer stamceller. Genom att kombinera lutning generatorer, flödeshantering, mikro-elektroder och andra mikroflödessystem moduler, kan dessa enheter också användas för läkemedel screening och sjukdomsdiagnos ^6. Isolering av en aggressiv subpopulation av flyttande celler kommer att möjliggöra studier av underliggande molekylära mekanismer.

Protocol

1. BTSC cell dissociation

BTSCs härrör från tidigare kulturer odlade i serumfritt stamceller medium som neurosfärer. kultur av vilken tidigare beskrivits ^{10, 11.}

1. Förbered cellsuspension från BTSC-härledda neurosfärer. BTSC-härledda neurosfärer samlas i ett 15 ml koniskt rör och centrifugerades vid 900 rpm under 5 minuter. Snabbare centrifugering kan skjuvning och / eller skada neurosfärer. Supernatanten aspirerades och neurosfären kultur återsuspenderades i 0,5 ml förvärmd Accutase. Denna lösning inkuberas under 5-10 minuter vid 37 ° C, låta neurosfärema att lossa. Cellerna mekaniskt sönderdelas med 10-20 försiktiga rörelser av en P100 pipett och därefter 1,5 ml stamceller medium sätts till cellerna för att neutralisera Accutase.
2. De BTSCs centrifugeras sedan vid 1300 rpm under 5 minuter och återsuspenderades i 1 ml stamcellmedium.
3. En 50 pl alikvot avlägsnas från Suspensjon och placerades i ett mikrocentrifugrör för cellräkning. 50 il trypanblått sättes till Eppendorf-rör och suspensionen placeras i en hemocytometer för cellräkning.
4. Om så krävs efter cellräkning, är ytterligare stamceller medium till den BTSC suspensionen för att ge en celldensitet av 20.000 levande celler / il media.

2. Tillverkning av bi-lager SU-8 master och gjutning av PDMS stämpel (se figur 1)

Vi använder optisk litografi och mjuk litografi för att tillverka SU-8 master och PDMS stämpel, som är nödvändiga för montering av de mikroflödessystem enheter. Något annorlunda än den vanliga proceduren ^12, är vår SU-8 mästare sammansatt av två skikt. De 3-um-höga mikrokanaler är gjutna i det första / bottenskiktet tidigare i processen, medan 250-um-höga sådd och ta emot kammare är i det andra / övre skiktet. För att korrekt anslutning mellan två kultur fack (mikrokanals och kammare), de två skikten måste noggrant inriktad i position. Emellertid, tjocklek och opacitet hos det andra skiktet är tillräckligt stora för att blockera utgångsreferensen / optiska aligner från att komma åt bottenfunktioner. Här har vi designar maskerna med referenspunkter markörer är distans placerade. Sålunda kan dessa markörer i det första skiktet selektivt avskärmad samtidigt snurrar det andra skiktet. Som ett resultat, är båda skikten av funktioner som görs i en master och klar för formning i relief av PDMS stämpeln.

1. Designa och förbereda två foto-masker. En mask består av två referenspunkter markörer och en mängd mikrokanaler (400 nm lång och 10-50 um breda) för det första lagret. Annan mask består av ympning och mottagande kammare (2 mm lång och 600 | im breda) för det andra skiktet. Båda maskerna är designade i Illustrator (Adobe, Kalifornien),-laser tryckt på OH-film (Tunna metalldelar, Colorado), rengjorda med isopropanol och lufttorkas.
2. Gör det första lagret medSU-8 fotoresist (MICROCHEM, Massachusetts) enligt produkthandboken från leverantör. Först, spinn-beläggning handtaget skivan (WRS Material, Kalifornien) med 3-im tjock fotoresist för SU-8 (5), följt av mjuk-bakning. Fotoresisten är då ultraviolett exponerade och botas med motsvarande mask i nära kontakt, följt av post-bakning och utvecklande.
3. Spin-coat det andra skiktet med 250 | im tjocka su-8 (2100). För att förhindra tjock fotoresist från att blockera de referenspunkter markörerna från det första lagret, täcker vi dessa områden med tejp i före spin-beläggning av det andra lagret. Tejpen sedan skalas av för att avslöja markörerna för uppriktning ändamål.
4. UV-exponera det andra skiktet med den andra masken. Med anpassningen markörerna visade, är det enkelt att anpassa dem till de i den andra masken med hjälp av optisk mask Aligner. Det andra skiktet av fotoresist är då ultraviolett exponerade och härdas i nära kontakt, följt av post-bakning och utvecklas. </ Li>
5. Anti-stick belägga resulterade master. För att bistå i avlägsnandet av härdad PDMS, kan SU-8 Master kan silaniseras genom ångavsättning för att göra ytan en nonstick-typ beläggning. Helt enkelt placera den i en torkapparat under minst en timme, med flera droppar triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl) silanlösning under vakuum.
6. Mold PDMS med befälhavaren. Blanda prepolymer bas och curer av PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) i 10:1 förhållande grundligt. Lägg den i en torkapparat för vakuumavgasning tills ingen luftbubbla syns. Häll blandningen på masken och avgasa igen om nya luftbubbla införs. Härda formen på en nivå värmeplatta i 2 timmar vid 90 C. Efter det kyls till rumstemperatur, försiktigt släpper PDMS stämpeln. Således är odling kanaler ingraverat i PDMS och redo för montering av anordningen. Befälhavaren kan återanvändas för gjutning tills det är sprucken eller sliten. Anti-stick beläggning måste utföras igen när klibbighet återfår.

3.Montering av mikrofluidanordningar och cellodling (figur 2)

För att odla celler, är funktionsrika graverad PDMS stämpel bifogas ett täckglas för att bilda slutna kanaler. Inlopp och utlopp skapas för att ladda kultur / media. Samtidigt sanering och andra förfaranden till glassubstratet och PDMS stämpel är nödvändiga för att säkerställa cell-kompatibilitet.

1. Gör reservoarer genom PDMS stämpel med biopsi hålslaget. Vi väljer deras diameter är 6 mm. Dessa reservoarer sitta i två syften. En är att hålla extra näringsämne för celltillväxt. Det andra är att tillgång pipett lastning och vakuumaspiration.
2. Blötlägg PDMS stämpeln i 70% etanol i 30 minuter och skölj sedan den med avjoniserat vatten för en annan 10 minuter. Syftet är att rensa eventuella organiska rester introduceras under tillverkningsprocessen, och icke tvärbunden PDMS föroreningar. Mer intensiva och noggrann rengöring processer som organisk extraktion ¹³ 14 användes på annat håll. Men vi fann det onödigt i BTSC kultur.
3. Sterilisera PDMS stämpel med autoklav (121 ° C, 35 minuter). Detta steg fullbordar ytterligare tvärbindningar reaktion av PDMS. Med utgångspunkt från detta steg och fram steg 3,6, alla förfaranden tas i sterilt sätt.
4. PDMS stämpeln lägges därefter på ett täckglas, som tidigare belagts med poly-L-lysin. Beläggs sedan med laminin genom att fylla kanalen med laminin lösning över natten vid 37 ° C. ^15-17 Enheten Laminin sugs från anordningen och anordningen tvättas med stamcellmedium.
5. Fyll cellsuspension från steg 1 till reservoarer och kanaler. 11 pl av dissocierade celler placeras i en sådd reservoar. Vakuumaspiration används för att tvinga celler in i kammaren sådd, om nödvändigt. En ytterligare 7 il celler placerade angränsande sådd reservoaren. Obs: Genomsnittlig celltätheten är 20.000 celler / mikroliter media. AftER fem minuter, sådd och mottagande reservoarer är översvämmade med media.
6. Placera en 0,5-1 mm före autoklaverade PDMS blad på toppen. Den naturligt inträffade yta vidhäftning mellan två PDMS bitar kommer att göra cellodling förseglade och redo för transport, inkubation och mikroskopisk avbildning.

4. Långsiktig time-lapse avbildning av BTSC migration BioStation IM (Nikon Instruments Inc., Melville, USA).

Kombinera kamera, mjukvara och inkubator allt i en låda, gör detta mikroskopiska system som man image cellodling med inga störningar i flera dagar. Dessutom flyttar sin unika motorkonstruktion objektivlinsen och håller provet skede stilla i punkt-besök funktionen. Detta gör det praktiskt att image parallella experiment och spåra celler rörelseproblem i hög genomströmning analys.

1. Pre-jämvikta Biostation IM för 45 minuter för att stabilisera temperaturen, fuktighet och lufttillförsel. Tillsats av flera vatten-fortsained rätter i provkammaren används för att bibehålla riktig fuktighet.
2. Fyll den cell-anordning som i provkammaren av mikroskop, och centrera den med mikro pincett.
3. Ställ in fokus, position-poäng och tidpunkter i Biostation programvara och starta tidsintervaller.

5. Representativa resultat:

Exempel på visuell inspektion och karakterisering av cancer cellmigration genom att använda en compartmentalizing mikrofluidikanordning illustreras i figur 3 och figur 4. Den cellinje är BTSC. Med vår nuvarande setup, kan fas bilder av cellodling kontinuerligt registreras så länge som 5 dagar (figur 3) och så ofta som var 2 sekunder (Figur 4). Bortom 5 dagar, odlingsmedier måste ersättas för näringsämnen påfyllning och bort avfall. Vårt långsiktiga tidsförlopp identifierar en roterande sekvens av sex celler stadier under sin migrering baserat på morfologiska förändringar. Enligt bildtrerad i figur 3 beskriver vi dem som (i) före migrering, (ii) initiering, (iii) bana-prospektering, (iv) cruising, (v) destination-exloration och (vi) efter migrering. I mottagningskammaren, spindel-formade celler stannar i steg (i) som i bulk tumörer som kan växa, dela och gradvis migrera. När de närmar sig mikrokanalen entrén, några celler vidare till steg (ii) när de expanderar och generera självhäftande utstick. Endast en av dem är i stånd att uppta ingången och fortsätt till steg (iii), som kan utforska migreringen riktning. När cellen bestämmer migration riktning, fortsätter den till steg (iv) kryssning genom mikrokanalplatta i en stadig och hög hastighet, vilket genomgå hela mikrokanalen. Vid slutet av mikrokanalstrukturer, cell vidare till steg (v) att undersöka det öppna utrymmet för mottagningskammaren, och därefter till steg (vi). I mikrokanalen, migrerar ström mestadels genereras genom blåsbildning aktivitet som visas i figur 4, som liknar amoeboid cell.. Cell blåsbildning och membran deformation är fullt upp här.

Figur 1. Schema för tillverkning av mikroflödessystem enhet. Hela förfarandet utförs på en 3-tums kiselhanteringsskivan genom en modifierad teknik för mjuk litografi. 3-im-höga mikrokanaler och markörer anpassning görs som i det första skiktet. Sedan 250-um tjock SU-8 är spinn-belagd, medan anpassning markörerna är täckta med tejp, så att de senare kan vara tillgänglig för att maskera Aligner utan syn-blockering av tjock fotoresist. Sålunda kan kammaren funktioner göras som det andra skiktet och exakt anpassas till det första skiktet. PDMS stämpel är slut formas av den resulterande master.

Figur 2. Schema av enhetens montering och cellsådd processen. Omges av PDMS och GLröv täckglas är 3D odling rymd som består av kammare, reservoarer och mikrokanaler. Den sådd Kammaren är fylld med cellodling, medan den mottagande kammaren är initialt fylld med cellfria medier. De mikrokanaler som ansluter mellan dem ger cellen migrerar spår från sådd sida till mottagarsidan.

Figur 3. BTSC migration genom mikrokanalen. Övre: ögonblicksbilder av tidsförlopp visar en enda cell (markerad i grönt) vandrar över 400 nm från sådd sidan till den mottagande sidan. Hela resan tar ca 2 dagar, med en sekvens av celler morfologiska förändringar. Skalan baren är 40 um. Sänk: en tecknad representation av sex migration stadier. Pre-migrering (i): I sådd kammare, spindel-formade och delbar celler migrerar gradvis längs med varandra. Cellerna i närheten mikrokanalplatta entré ras med varandra genom polariserande cellkroppen och e xerting lamellipodia utstick. Inledande (ii): Den vandrande cellen med den högsta kapaciteten upptar kanalen ingången medan konkurrenterna kommer att retirera. Path-prospektering (iii): De vandrande cellförändringar till en amoeboid läge med lite polaritet. Denna migration läget är extremt rörliga och kunna utforska väg i alla riktningar genom blåsbildning små membran utsprång. Cruising (iv): När migreringsväg bestäms, förvandlar cellen i en anpassad amoeboid läge genom att upprätthålla en extra stor utskjutande väg framåt. På detta sätt, upprätthåller cellen en hög motilitet samt en jämn riktning och hastighet. Destination-prospektering (v): Vid väg slut saktar cellen ner och utvecklar filopodias att utforska den mottagande kammaren för någon invasion mål. Post-migrering (VI): Efter att den mottagande kammaren blir cell i stjärnformade och behåller hög motilitet men ingen bestämd riktning.

"/>
. Figur 4 Ögonblicksbilder av tidsförlopp visar cykeln av blåsbildning aktivitet och membran deformation av en BTSC: (AB). initiering, (BD). Expansion, (DF). Indragning. Pilarna och kurva-linjer representerar riktningen och placeringen av membranets deformation, respektive. De ögonblicksbilder samlas in vart 8 sekunder.

Discussion

Den mikroflödessystem enhet och bildregistreringskvalitet teknik som presenteras här ger en visuell karakterisering av cellulär morfologi under flyttningen. Jämfört med befintliga konventionella metoder, har mikroflödessystem plattformen fördelar kostnadseffektivitet, hög genomströmning och design flexibilitet. Den presenterade mikroskopiska visualisering system möjliggör studier och registrering av långsiktiga live cellmigration. Linsen-motoriserade funktionen gör det möjligt att spåra flera migration vägar i en hög bild-upplösning utan att störa provet.

Under montering av anordningen, är PDMS stämpel icke-permanent bunden till täckglas för att underlätta för PDL beläggning (steg 3,4). Det är viktigt att uppnå en god tätning för framgången av detta protokoll. Kontaminering införes från anordningens tillverkning, såsom luftbubbla i stämpel eller damm / skräp på substratet, kan äventyra bindningen och resultera i vätska läcker. Därför, TREATIng anordningen i en dammfri sätt är viktig för att förhindra fel på anordningen. Före PDL-beläggningen, de täckglas är salpetersyra behandlas och PDL lösningen centrifugeras för att eliminera damm / skräp. Vi finner tejp, alkohol skölj och vattenbad till stor hjälp i att ta bort damm / skräp från PDMS stämpeln om ett rent rum är inte tillgänglig. Efter PDMS stämpel i kontakt med täckglas, trycka på stämpeln försiktigt med pincett underlättar tätningen.

BTSCs kan berikas av prover från människa operationssalen genom sfär kultur i stamceller medium liknande kultur av normala neurala stamceller ^10. BTSCs berikade på detta sätt visa stamceller-liknande egenskaper, såsom uttryck av markörer stamceller (CD133, nestin), differentiering till flera neurala linjer (gliaceller och neuronala) och tumör initiering i en orthotopic immunodeficient musmodell med så få som 100 celler ^18. Även viss debatt finns om reningning och underhåll av BTSCs ^{1, 19-21,} sfär odlade BTSCs upprätthålla bättre fenotyp och genotyp av föräldrarnas tumören ^22-24.

Den fack utrymme efterliknar fysiologiska miljön för cellmigration. I vår enhet, BTSC uppvisar en stark kapacitet av migration genom en storlek begränsad yta genom att reglera cellulär morfologi. Vår karakterisering av cellen morfologiska förändringar indikerar Mode-transformationer i sex steg sekvens som kan modellera en eventuell ny detaljerad beskrivning av BTSC invasion av intilliggande hjärna. I tidiga stadier, cellerna får en betydande mängd av polaritet och generera adhesiva utsprång att effektivt förankra sig inuti mikrokanalen. När cellen beläggning i mikrokanalen är etablerad, omvandlar den till en cruising läge och upprätthåller detta läge för hela resan genom en mikrokanal. I detta skede BTSC hålla en hög motilitet och konsekvent riktning men spara energi. Iterestingly, verkar det som en mikrokanalen är begränsad till en cruising cell i taget, så att när en enda cell vidare till detta stadium, andra celler reträtt från mikrokanalen. Denna mekanism säkerställer troliga effektiviteten av tumör spridning och förhindrar överkonsumtion av näringsämnen i mikrokanalen. Efter avslutad migration över mikrokanalen, återfår en cell dess benägenhet för Vävstolar utskott och ytterligare prospektering efter invasionen mål eller nya vägar migration. Den compartmentalizing mikroflödessystem enheten erbjuder en ny in vitro innebär att skapa en mikromiljö för att studera BTSC infiltration av hjärnparenkymet.

Denna metod kan lätt anpassas till studiet av cancer stamceller (CSC) och flyttande cellinjer härledda från andra tumörtyper. Odling av celler i mikrofluidanordningen kan utföras i alla moderna biologin laboratorium som är utrustad med en inkubator och vävnadsodling expertis. Utrustad med en SU-8 master, PDMSgjutning och anordningsenheten är möjliga med några grundläggande utbildning i mjuk litografi. Dessutom kan denna plattform även förlängas för andra applikationer med att integrera andra funktionella moduler såsom lutning mixer, yta mönstring, flytande kontroll och mikroelektrod.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose	GIBCO, by Life Technologies	11965	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Ham’s F12	GIBCO, by Life Technologies	31765	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
B27 supplement minus vitamin A	GIBCO, by Life Technologies	12587-010	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Antibiotic-Antimycotic (PSA)	GIBCO, by Life Technologies	15240	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant	GIBCO, by Life Technologies	PHG0313	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant	GIBCO, by Life Technologies	PHG0021	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H1027-250KU	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Laminin (natural mouse)	GIBCO, by Life Technologies	23017-015	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Accutase	EMD Millipore	SCR005	Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies
Stem cell medium			30 % Hams F12 70% DMEM 1% antibiotic-antimycotic 2% B27 without vitamin A EGF (20 ng/mL) and bFGF/heparin (20 ng/mL bFGF, 5 mg/ml heparin) Mix ingredients and sterile filter before use
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin			Aliquot concentration 20 μg/ml For 25 μg: Add 1.25 mL of 5mg/mL Heparin to 25 μg bFGF. For 250 μg: Add 1 mL 5mg/mL Heparin to 250 μg bFGF. Transfer to 15 mL conical and add 11.5 mL 5 mg/mL Heparin to conical. Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
Epidermal Growth Factor (EGF)			Aliquot concentration 20 μg/ml For 200 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 15 mL conical and add 9 mL DMEM. For 500 μg: Add 1 mL sterile DMEM (Gibco 11965-118) to 200 μg EGF. Transfer to 50 mL conical and add 24 mL DMEM. Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C.
Heparin			Aliquot concentration 5 mg/ml Weigh out 100 mg heparin. Add 100 mg heparin to 20 mL (70%)DMEM-(30%)F12-(1%)PSA (14 mL DMEM, 6 mL F12, 200 μL PSA) Sterile filter Store as 50 μl or 250 μl aliquots at -80°C
su-8 photoresist	MicroChem Corp.
Silicon handle wafer	WRS Materials	3P01-5SSP-INV
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS Sylgard 184	Dow Corning
laminin	BD Biosciences		50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration
Biostation IM	Nikon Instruments