Summary
Dispositivo compartimentazione microfluidi staminali per studiare la migrazione delle cellule tumorali è descritto. Questa nuova piattaforma crea un microambiente vitale cellulare e consente la visualizzazione microscopica di locomozione cellule vive. Altamente mobili le cellule tumorali sono isolate per lo studio dei meccanismi molecolari di infiltrazione aggressivi, che possono portare a terapie più efficaci in futuro.
Abstract
Negli ultimi 40 anni, gli Stati Uniti hanno investito più di 200 miliardi di dollari per la ricerca sul cancro, causando solo una diminuzione del 5% del tasso di mortalità. Uno dei principali ostacoli per migliorare i risultati dei pazienti è la scarsa comprensione dei meccanismi alla base della migrazione cellulare associato a cellule di cancro aggressiva invasione, metastasi e la resistenza terapeutica 1. Glioblastoma Multiforme (GBM), la più diffusa maligno primitivo tumore al cervello adulto 2, esemplifica questa difficoltà. Nonostante standard di chirurgia, radioterapia e chemioterapia, il paziente sopravvivenza media è di soli quindici mesi, a causa di infiltrazioni GBM aggressiva nel cervello adiacente e recidiva tumorale rapida 2. Le interazioni di meccanismi cellulari aberranti migratori e il microambiente tumorale probabile differenziare il cancro dalle cellule normali 3. Pertanto, migliorando approcci terapeutici per GBM richiedono una migliore comprensione dei meccanismi di migrazione di cellule tumorali. Un recente lavoro suggerisce thata piccola sottopopolazione di cellule all'interno GBM, il tumore cerebrale cellule staminali (BTSC), può essere responsabile della resistenza terapeutica e recidiva. I meccanismi alla base BTSC capacità migratoria stanno solo cominciando a essere caratterizzati 1,4.
A causa di una limitazione di ispezione visiva e la manipolazione geometrica, saggi di migrazione convenzionali 5 sono limitato a quantificare popolazioni cellulari in generale. Al contrario, i dispositivi microfluidici consentire l'analisi singola cellula a causa della compatibilità con la microscopia moderna e il controllo micro-ambiente 6-9.
Vi presentiamo un metodo per la caratterizzazione dettagliata della migrazione BTSC utilizzando compartimentare dispositivi microfluidici. Questi dispositivi PDMS-made lanciare l'ambiente coltura di tessuti in tre compartimenti collegati: semina camera, camera di ricevimento e bridging microcanali. Abbiamo adattato il dispositivo in modo che entrambe le camere contengono supporti sufficienti per sostenere BTSC vitali per 4-5 days senza supporto di scambio. BTSCs altamente mobili inizialmente introdotti nella camera di semina sono isolati dopo la migrazione se bridging microcanali paralleli alla camera ricevente. Questa migrazione simula cancro diffusione cellulare attraverso gli spazi interstiziali del cervello. Le immagini di fase diretta di morfologia cellulare durante la migrazione sono registrati nell'arco di diversi giorni. BTSC altamente migratorie può quindi essere isolato, recultured, e analizzato ulteriormente.
Microfluidica compartimentazione può essere una piattaforma versatile per studiare il comportamento migratorio degli BTSCs e di altre cellule staminali del cancro. Grazie alla combinazione di generatori di pendenza, la gestione dei fluidi, micro-elettrodi e altri moduli di microfluidica, questi dispositivi possono essere utilizzati anche per lo screening di stupefacenti e la diagnosi delle malattie 6. Isolamento di una sottopopolazione di cellule migratorie aggressiva possono consentire lo studio di meccanismi molecolari alla base.
Protocol
1. Cella BTSC di dissociazione
BTSCs sono derivati da preesistenti colture coltivate in terreno privo di siero cellule staminali come neurosfere. cultura di cui è descritto in precedenza 10, 11.
- Preparare sospensione di cellule derivate da BTSC neurosfere. BTSC derivati neurosfere sono raccolti in una provetta conica da 15 ml e centrifugati a 900 rpm per 5 minuti. Più veloce centrifugazione può taglio e / o danneggiare il neurosfere. Supernatante viene aspirato e cultura neurosfere viene risospeso in 0,5 ml di pre-riscaldato Accutase. Questa soluzione è incubata per 5-10 minuti a 37 ° C consentendo alle neurosfere per allentare. Le cellule sono meccanicamente perturbato con 10-20 movimenti delicati di una pipetta P100 e poi 1,5 ml di mezzo sulle cellule staminali è aggiunto alle cellule di neutralizzare l'Accutase.
- Le BTSCs viene poi centrifugato a 1300 rpm per 5 minuti e risospese in 1 ml di mezzo di cellule staminali.
- A 50 microlitri aliquota viene rimosso dalle suspension e posta in una provetta da microcentrifuga per la conta cellulare. 50 pl di trypan blu viene aggiunto alla provetta Eppendorf e la sospensione viene posto in un emocitometro per la conta cellulare.
- Se richiesto dopo il conteggio delle cellule, cellule staminali ulteriore mezzo viene aggiunto alla sospensione BTSC dare una densità cellulare di 20.000 cellule vive / media pl.
2. Fabbricazione di bi-strati SU-8 master e stampaggio di timbro PDMS (vedi figura 1)
Usiamo litografia ottica e litografia morbida per fabbricare SU-8 master e PDMS timbro, che sono essenziali per il montaggio dei dispositivi microfluidici. Leggermente diversa rispetto alla procedura standard 12, la SU-8 master è composto da due strati. Le 3-micron-alte microcanali sono fusi nel primo / basso livello precoce del processo, mentre i 250 micron-alte camere di semina e la ricezione sono nel secondo strato / superiore. Al fine di un corretto collegamento tra due compartimenti coltura (microcanalis e camere), i due strati devono essere accuratamente allineati in posizione. Tuttavia, lo spessore e l'opacità del secondo strato sono grandi abbastanza per bloccare il fiducial / ottica allineatore di accedere alle caratteristiche del fondale. Qui progettiamo le maschere con marker fiduciali in remoto posizionato. Così, questi marcatori nel primo strato può essere selettivamente schermati, mentre gira il secondo strato. Come risultato, entrambi gli strati di caratteristiche sono realizzati in un master e pronto per lo stampaggio in bassorilievo del timbro PDMS.
- Progettare e preparare due foto-maschere. Una maschera consiste di due marker fiduciali e una serie di microcanali (400 micron di lunghezza e 10-50 micron di larghezza) per il primo strato. Un'altra maschera consiste di semina e ricezione camere (2 mm di lunghezza e 600 micron di larghezza) per il secondo strato. Entrambe le maschere sono state progettate in Illustrator (Adobe, California), laser stampato su lucidi (parti metalliche sottili, Colorado), puliti con isopropanolo e aria secca.
- Fare il primo strato conSU-8 photoresist (MicroChem, Massachusetts) in base al manuale del prodotto dal fornitore. Primo, spin-coat wafer maniglia (Materiali WRS, California) con 3-micron di spessore di photoresist SU-8 (5), seguito da soft-cottura. Il photoresist è quindi ultravioletta-esposta e curata con la maschera corrispondente in stretto contatto, seguito da post-cottura e di sviluppo.
- Spin-coat il secondo strato di 250 micron di spessore su-8 (2100). Per evitare photoresist di spessore da bloccare i marker fiduciali dal primo strato, copriamo queste aree con nastro adesivo nella prima spin-coating del secondo strato. Il nastro viene poi staccata per rivelare i marcatori per scopo l'allineamento.
- UV-esporre il secondo strato con la seconda maschera. Con i segni di allineamento ha rivelato, è semplice per allinearli a quelli della seconda maschera con allineatore ottico maschera. Il secondo strato di fotoresist viene quindi ultravioletta-esposta e curate in stretto contatto, seguito da post-cottura e sviluppo. </ Li>
- Anti-stick mano il master risultato. Per aiutare nella rimozione di PDMS indurito, il SU-8 master può essere silanizzate tramite deposizione di vapore per rendere la superficie di un rivestimento antiaderente tipo. Semplicemente posto in un essiccatore per almeno un'ora, con alcune gocce di tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano soluzione sotto vuoto.
- Mold PDMS con il master. Mix di base prepolimero e curatore di PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) in rapporto 10:1 accuratamente. Metterla in un essiccatore per degasaggio sotto vuoto fino a quando non bolla d'aria si vede. Versare il composto sulla maschera e degassare ancora se nuova bolla d'aria viene introdotta. Curare lo stampo su una piastra di livello per 2 ore a 90 C. Una volta raffreddata a temperatura ambiente, lentamente rilasciare il timbro PDMS. Così, i canali coltura sono incisi in PDMS e pronto per il montaggio del dispositivo. Il master è riutilizzabile per lo stampaggio fino a quando non è rotto o usurato. Il rivestimento antiaderente deve essere eseguita di nuovo quando la viscosità riacquista.
3.Assemblaggio dei dispositivi microfluidici e coltura cellulare (figura 2)
Per cellule di coltura, caratteristica inciso timbro PDMS è attaccato ad un vetrino coprioggetto per formare canali chiusi. Ingressi e le uscite vengono creati per il caricamento della cultura / media. Nel frattempo, la pulizia e altre procedure per il substrato di vetro e il timbro PDMS sono necessarie per garantire la cellula-compatibilità.
- Fai serbatoi attraverso il timbro PDMS con perforatrice biopsia. Abbiamo scelto il loro diametro pari a 6 mm. Questi serbatoi servono per due scopi. Uno è quello di tenere nutriente supplementare per la crescita cellulare. L'altro è per l'accesso di carico pipetta e aspirazione a vuoto.
- Immergere il timbro PDMS in 70% di etanolo per 30 minuti e poi risciacquate con acqua deionizzata per 10 min. Lo scopo è quello di eliminare eventuali residui organici introdotti durante il processo di fabbricazione, e non reticolato contaminazione PDMS. Processi di pulizia più intensa e profonda come l'estrazione organica 13 14 sono stati utilizzati altrove. Tuttavia, abbiamo trovato inutile nella cultura BTSC.
- Sterilizzare il timbro PDMS con autoclave (121 ° C, 35 min). Questo passaggio completa ulteriormente la reazione di reticolazione di PDMS. Partendo da questo punto e fino passo 3,6, tutte le procedure sono prese in modo sterile.
- Il timbro PDMS, viene applicata su un vetrino di vetro, che viene preventivamente rivestito con poli-L-lisina. 15-17 Il dispositivo viene quindi rivestito con laminina riempiendo il canale con soluzione laminina notte a 37 ° C. Laminina viene aspirato dal dispositivo e il dispositivo viene lavato con supporto di cellule staminali.
- Caricare sospensione cellulare dal punto 1 in serbatoi e canali. 11 microlitri di cellule dissociate sono collocati in un serbatoio semina. Aspirazione a vuoto viene utilizzato per forzare le cellule nella camera di semina, se necessario. Un ulteriore 7 microlitri di cellule sono collocati il serbatoio adiacente semina. Nota: la densità delle cellule medio è di 20.000 cellule / media pl. A poppaer cinque minuti, la semina e serbatoi che ricevono sono inondati con i media.
- Inserire un 0,5-1 mm pre-sterilizzato foglio PDMS sulla parte superiore. Il coefficiente di aderenza in natura si è verificato tra due pezzi PDMS farà la coltura cellulare sigillato e pronto per il trasporto, l'incubazione e di imaging microscopico.
4. A lungo termine time-lapse imaging di BTSC migrazione con BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, USA).
Combinando fotocamera, software e incubatore in un unico pacchetto, questo sistema microscopico permette di cultura dell'immagine cella senza disturbo per giorni. Inoltre, il suo design unico motore sposta la lente obiettivo e mantiene fase stazionaria campione nel punto in visita funzione. Questo lo rende pratico per esperimenti immagine parallele e cellule locomozione traccia in saggio ad alta prestazione.
- Pre-equilibrare la IM Biostation per 45 minuti per stabilizzare la temperatura di mandata, l'umidità e l'aria. Aggiunta di diversi acqua-CONTpiatti ained in camera del campione viene utilizzato per mantenere l'umidità adeguata.
- Caricare il cellulare ad alimentazione nella camera campione di microscopio, e centrarlo con una pinzetta micro.
- Impostare le posizioni di messa a fuoco, punti e tempo-punti nel software Biostation e avviare il time-lapse.
5. Rappresentante dei risultati:
Esempi di ispezione visiva e caratterizzazione della migrazione delle cellule tumorali, utilizzando un dispositivo microfluidico compartimentazione sono illustrati nella Figura 3 e Figura 4. La cellula-line è BTSC. Con la nostra configurazione attuale, immagini fase di coltura cellulare può essere registrata in continuo per il tempo 5 giorni (Figura 3) e frequente come ogni 2 secondi (Figura 4). 5 giorni solo, terreni di coltura devono essere sostituiti per il rifornimento dei nutrienti e rifiuti rimossi. La nostra lunga time-lapse identifica una sequenza di rotazione di sei fasi cellulari durante la sua migrazione in base ai cambiamenti morfologici. Come illustrati nella figura 3, li descrivono come (i) pre-migrazione, (ii) l'iniziazione, (iii) percorso di esplorazione, (iv) di crociera, (v)-destinazione exloration e (vi) post-migrazione. Nella camera di ricezione, cellule fusiformi rimanere nello stadio (i), come nei tumori sfusi che sono in grado di crescere, dividere e migrano gradualmente. Mentre si avvicinano all'entrata microcanali, alcune cellule procedere alla fase (ii) quando si espandono e generano protrusione adesivo. Solo uno di essi è in grado di occupare l'ingresso e procedere alla fase (iii), che può esplorare la direzione di migrazione. Una volta che la cella determina la direzione di migrazione, si procede alla fase (iv) per crociera attraverso il microcanale in una velocità costante ed elevata, che viene effettuata attraverso l'intera microcanali. Alla fine di microcanali, procede cellule allo stadio (v) per esplorare lo spazio aperto della camera di ricevimento, e quindi alla fase (vi). A microcanali, potenza migrazione è principalmente generata da blebbing attività come illustrato in figura 4, simile a quella di ameboide cell. Blebbing cellulare e deformazione della membrana sono registrati integralmente qui.
Figura 1. Schema di fabbricazione del dispositivo microfluidica. L'intero processo viene eseguito su un 3-inch wafer di silicio manico attraverso una tecnica modificata di litografia morbida. 3-micron-alti microcanali e marcatori di allineamento sono come nel primo strato. Poi 250-micron di spessore su-8 è spin-rivestito, mentre i segni di allineamento sono coperti con nastro adesivo, in modo tale che essi possono poi essere accessibile a mascherare allineatore senza vista-blocco da photoresist di spessore. Pertanto, le caratteristiche della camera può essere fatto come secondo strato e accuratamente allineato al primo strato. Timbro PDMS viene infine stampato fuori il maestro risultante.
Figura 2. Schema di montaggio del dispositivo e semina processo cellulare. Circondata da PDMS e glcoprioggetto culo, lo spazio di coltura 3D è composto da camere, serbatoi e microcanali. La camera di semina è riempito con colture cellulari, mentre la camera di ricezione è inizialmente riempito con cellule libere media. I microcanali che collegano tra di loro fornire sentiero cella migrazione da parte semina a lato per ricevere.
Figura 3. BTSC migrazione attraverso microcanali. Tomaia: istantanee di time-lapse mostra una singola cella (evidenziato in verde) migra oltre 400 micron dal lato semina al lato ricevente. L'intero percorso è di circa 2 giorni, che coinvolge una serie di cambiamenti morfologici delle cellule. La barra della scala è di 40 micron. Bassa: una rappresentazione del fumetto di sei fasi di migrazione. Pre-migrazione (i): In camera di semina, le cellule fusiformi e divisibile gradualmente migrare lungo l'altro. Le cellule vicino race ingresso microcanali con l'altro di polarizzazione corpo cellulare e e xerting sporgenza lamellipodi. Apertura (ii): La cella migratorio con la maggiore capacità occupa l'ingresso del canale mentre i suoi concorrenti si ritirerà. Path-esplorazione (iii): Le alterazioni cellulari migratori verso una modalità ameboide con polarità poco. Questa modalità di migrazione è estremamente mobili e capaci di esplorare percorso in tutte le direzioni da blebbing piccole sporgenze membrana. Crociera (iv): Una volta che il percorso di migrazione è determinato, la cellula si trasforma in una modalità ameboide adattato mantenendo una sporgenza complementare intestazione grande avanti. In questo modo, sostiene una motilità cellulare elevata nonché una direzione e velocità costante. Destinazione-esplorazione (v): Al percorso-end, il cellulare rallenta e si sviluppa filopodias per esplorare la camera di ricezione per qualsiasi destinazione invasione. Post-migrazione (vi): Dopo essere entrati nella camera ricevente, si trasforma in cellula a forma di stella e mantiene alta la motilità, ma senza una direzione determinata.
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. Istantanee Figura 4 su time-lapse mostrano il ciclo di blebbing deformazione attività e membrana di un BTSC: (AB). iniziazione; (BD). Espansione; (DF). Svincolo. Le frecce e la curva-linee rappresentano la direzione e la posizione della deformazione della membrana, rispettivamente. Le istantanee vengono raccolti ogni 8 secondi.
Discussion
Il dispositivo microfluidico e registrazione dell'immagine tecnica qui presentata consente una caratterizzazione visiva di morfologia cellulare durante la migrazione. Rispetto ai metodi convenzionali esistenti, la piattaforma microfluidica offre vantaggi di costo-efficacia, ad alta velocità e flessibilità di progettazione. Il sistema presentato permette visualizzazione microscopica studio e registrazione di lungo termine migrazione cellulare vivo. L'obiettivo motorizzato funzione consente di monitorare i percorsi di migrazione più in una immagine ad alta risoluzione senza disturbare il campione.
Durante l'assemblaggio del dispositivo, il timbro PDMS è non permanentemente legato alla coprioggetto per la comodità di rivestimento PDL (passo 3.4). E 'fondamentale per ottenere una buona tenuta per il successo di questo protocollo. Contaminazione introdotta dalla fabbricazione del dispositivo, quali bolle d'aria nella timbro o polvere / detriti sul substrato, può compromettere il legame e causare fuoriuscita di liquido. Pertanto, TREATIng il dispositivo in un locale senza polvere modo è importante per evitare guasti al dispositivo. Prima della PDL-coating, i vetrini sono acido nitrico e la soluzione trattata PDL viene centrifugata per eliminare la polvere / detriti. Troviamo scotch, alcool risciacquo, e bagno di acqua molto utile nella rimozione di polvere / detriti dal timbro PDMS, se una camera pulita non è accessibile. Dopo il timbro PDMS in contatto con il coprioggetto di vetro, toccando il timbro delicatamente con una pinzetta facilita la tenuta.
BTSCs può essere arricchito da campioni umani sala operatoria attraverso la cultura sfera nel mezzo delle cellule staminali, simile alla cultura delle normali cellule staminali neurali 10. BTSCs arricchiti in questo modo dimostrano di cellule staminali proprietà simili, come ad esempio l'espressione di marcatori di cellule staminali (CD133, nestina), la differenziazione a più linee neurali (gliale e neuronale), e l'iniziazione tumorale in un modello di topo ortotopico immunodeficienti con un minimo di 100 cellule 18. Anche se alcuni dibattito esiste riguardo depurazionezione e manutenzione di BTSCs 1, 19-21, sfera coltivate BTSCs meglio mantenere il fenotipo e genotipo del tumore parentale 22-24.
Lo spazio compartmentalized riproduce l'ambiente fisiologico per la migrazione cellulare. Nel nostro dispositivo, BTSC mostrano una forte capacità di migrazione attraverso una dimensione spazio-vincolata regolando morfologia cellulare. La caratterizzazione dei cambiamenti morfologici delle cellule indica la modalità-trasformazioni in una sequenza fase sei che possono modellare un eventuale nuova descrizione dettagliata di invasione BTSC del cervello adiacenti. Nelle prime fasi, le cellule guadagnare una quantità significativa di polarità e generare sporgenze adesive efficacemente si ancorano all'interno del microcanale. Una volta che l'occupazione cella nella microcanale è stabilito, lo converte in una modalità crociera e mantiene questo modo per tutto il percorso attraverso un microcanali. In questa fase, BTSC mantenere alta la motilità e la direzione coerente, ma risparmiare energia. Interestingly, sembra che uno microcanale è limitato a una cella crociera alla volta, in modo che quando una cella singola procede a questa fase, altre cellule ritirata dal microcanali. Questo meccanismo garantisce probabile efficacia di tumore impedisce la diffusione e consumo eccessivo di sostanze nutritive in microcanali. Dopo aver completato la migrazione attraverso il microcanali, una cellula ritrova la sua propensione per le sporgenze multidirezionali e un'ulteriore esplorazione per gli obiettivi di invasione o di nuovi percorsi di migrazione. Il dispositivo di compartimentazione microfluidica offre un romanzo in vitro mezzi di creare un microambiente per studiare BTSC infiltrazione del parenchima cerebrale.
Questo metodo può essere facilmente adattato per lo studio delle cellule staminali del cancro (CSC) e linee cellulari derivate da migratori altri tipi di tumore. Coltura di cellule nel dispositivo microfluidico può essere eseguita in qualsiasi laboratorio biologia moderna che è dotato di un incubatore e coltura tissutale competenze. Dotato di un su-8 master, PDMScasting e montaggio del dispositivo sono realizzabili con una formazione fondamentale nella litografia soft. Inoltre, questa piattaforma può anche essere esteso per altre applicazioni con integrazione di altri moduli funzionali come mixer gradiente, patterning superficie, controllo dei fluidi e microelettrodo.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
PAC è parzialmente sostenuto da una sovvenzione del NIH T32 a Università degli Studi di cellule staminali di formazione Wisconsin (PA Clark). JSK è stato in parte sostenuto dalla cattedra Headrush Brain Research Tumor, Roger Loff Memorial GBM Fondo di ricerca, e la Fondazione UW / Brain Research Neurochirurgia del tumore e Education Fund. JCW e YH sono parzialmente supportati dalla sovvenzione del NIH NIBIB 1R01EB009103-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Ham’s F12 | GIBCO, by Life Technologies | 31765 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| B27 supplement minus vitamin A | GIBCO, by Life Technologies | 12587-010 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Antibiotic-Antimycotic (PSA) | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | GIBCO, by Life Technologies | PHG0313 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant | GIBCO, by Life Technologies | PHG0021 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H1027-250KU | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Laminin (natural mouse) | GIBCO, by Life Technologies | 23017-015 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Stem cell medium |
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| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin |
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||
| Epidermal Growth Factor (EGF) |
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| Heparin |
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| su-8 photoresist | MicroChem Corp. | ||
| Silicon handle wafer | WRS Materials | 3P01-5SSP-INV | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| laminin | BD Biosciences | 50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration | |
| Biostation IM | Nikon Instruments |
References
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