MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliotek Screening i pattedyrceller

Summary

Her bruger vi et menneskeligt LentiPlex samlet bibliotek og traditionelle sekventering metoder til at identificere genet mål at fremme celle overlevelse. Vi viser hvordan du opsætter og deconvolute en LentiPlex skærm og validere resultaterne.

Abstract

RNA-interferens (RNAi) er en iboende cellulære mekanisme for regulering af genekspression. Udnyttelse af den medfødte kraft af dette system gør os i stand til at Knockdown genekspression niveau i tab af genfunktion undersøgelser.

Der er to primære metoder til at udføre RNAi. Den første er brugen af små interfererende RNA (siRNAs), som er kemisk syntese, og det andet benytter korte hårnål RNA (shRNAs) indkodet i plasmider ^1. Sidstnævnte kan transficeret ind i cellerne direkte eller pakket ind i replikation inkompetente lentiviral partikler. De væsentligste fordele ved at bruge lentiviral shRNAs er lette indføring i en bred vifte af celletyper, deres evne til at stabilt integreret i genomet for en langsigtet gen Knockdown og udvælgelse, og deres effektivitet i at gennemføre high-throughput tab af funktion skærme. For at lette dette har vi skabt LentiPlex poolede shRNA bibliotek.

Den MISSION LentiPlex Menneskelige shRNA Pooled Bibliotek er et genom-dækkende lentiviral produceret pool hjælp af en egenudviklet proces. Biblioteket består af over 75.000 shRNA konstruktioner fra TRC kollektionen målrette 15.000 menneskelige gener ^2. Hvert bibliotek er testet for shRNA repræsentation, før produktet slip for at sikre en robust bibliotek dækning. Biblioteket er fastsat i en klar-til-brug lentiviral format med titre på mindst 5 x 10 ⁸ TU / ml via p24 analysen og er på forhånd inddelt i ti subpools af cirka 8.000 shRNA konstruerer hver. Forstærkning og sekventering primere er også for downstream-target identifikation.

Tidligere undersøgelser etableret en synergistisk antitumor aktivitet TRAIL når det kombineres med paclitaxel i A549 celler, en menneskelig lungekræft celle linie ^{3, 4.} I denne undersøgelse har vi demonstrere anvendelsen af ​​en poolet LentiPlex shRNA bibliotek til hurtigt at gennemføre en positiv selektion screene for gener involveret i cytotoksicitet of A549 celler, når de udsættes for TRAIL og paclitaxel. En barriere ofte mødt med high-throughput skærme er omkostningerne og vanskelighederne i deconvolution, vi også detaljer en omkostningseffektiv polyklonale tilgang udnytte traditionel sekvensering.

Protocol

LentiPlex Pooled SKÆRMINDSTILLING

At identificere shRNA sekvenser af interesse, er det afgørende at sætte op på skærmen, således at hovedparten af ​​cellerne får kun ét shRNA konstruere. Ved at bruge en lav MOI (mangfoldigheden af ​​infektion), er sandsynligheden for flere integrants per celle i høj grad faldet. Men transduktion effektivitet, og derfor ønskede Mois, stærkt afhænger af målet celletype. Derfor er det bydende nødvendigt, at fastlæggelsen af ​​den optimale MOI udføres, før du starter skærmen i en ny celletype.

1. Transduktion af target-celler med missionen LentiPlex Pooled shRNA Bibliotek

1. Den egentlige MOI anvendes, vil variere for forskellige celletyper. Hvis replikater ønskes dernæst antallet af pladerne skal øges tilsvarende. Derudover er det typisk ikke vil være en fordel at kombinere de forskellige subpools. Holde subpools separate vil støtte i deconvolution processen. Sørg proper mærkning af hver vævskultur skål med subpool nummer, der er anvendt under transduktion. En lav MOI er rådes til at reducere sandsynligheden for flere integrants per celle.
2. Dag 1 - Seed det passende antal 60-mm retter med nok celler til at opnå ~ 70% confluency den følgende dag (10 bassiner i alt, hver udført i tre eksemplarer = 30 retter i alt). For vores undersøgelse blev 60 mm retter tilsået med 6 x 105 A549 celler for at opnå en confluency på 70% inden transduktion. Dette sikrer, at cellerne er stadig i den eksponentielle vækstfase. Vækstraterne vil variere fra celletype og skal fastlægges, inden du starter skærmen.
3. Tillad celler til at overholde ved at inkubere natten over ved 37 ° C i en befugtet inkubator i en atmosfære af 5% CO _2.
4. (Valgfrit) Medtag yderligere to 60-mm retter til transduktion med negativ kontrol shRNAs. Mærk retter "Control A" for SHC001H og "Control B" for SHC002H.
5. Dag 2 - transduce the celler med LentiPlex viruspartikler. På dagen for transduktion, tø lentiviral partikler på is.
6. Overfør optøede partikler til et laminar flow hætte og holde på is, hvis det ikke bliver brugt med det samme.
7. Beregn hvor meget af hver enkelt viral sub-pulje til at tilføje til cellerne for at få MOI på 1 på tværs af alle cellekultur retter.
   1. Eksempel: 1 x 10 ⁶ celler / fad; viral titer = 5 x 10 ⁸ TU / ml; en ønsket MOI på 1. i.) 1 x 10 ⁶ celler / fad x (MOI af 1) = 1 x 10 ⁶ transducing enheder (TU) nødvendig ii.) 1 x 10 ⁶ TU / (5,0 x 10 ⁸ TU / ml) fremstillet ved C A = 2 μL af lentiviral stamopløsning bør føjes til den relevante fadet. Fortynd den beregnede mængden af ​​virus i 100-300 μL af komplette medier med henblik på at sikre en bedre fordeling af virus, når føjet til cellekultur parabol.
8. Fjern medie fra præ-seedede celler. Tilføj fuldstændige medium contalingen hexadimethrine bromid løsning på hver tallerken. Den anbefalede endelige koncentration af hexadimethrine bromid i medierne er 8 mg / ml. Brug mindre hexadimethrine bromid hvis du finder det for at være giftige for din target-cellerne.
9. Tilføj shRNA lentiviral partikler til relevante retter i overensstemmelse med forudbestemte eksperimenterende design. Vend forsigtigt pladerne for at jævnt distribuere virus i cellerne.
10. Inkubér 18-20 timer ved 37 ° C i en befugtet inkubator i en atmosfære af 5% CO _2.
11. (Valgfrit) Gentag 3-8 på identiske MOI med SHC001H (tom vektor shRNA Control) i Kontrolpanel parabol A og SHC002H (røræg shRNA kontrol) i Kontrolpanel parabol B. behandle disse retter identisk med den eksperimenterende retter i løbet af eksperimentet.
12. Dag 3 - Skift medierne. Aspirer virus-holdige medier og tilføje frisk fuldstændige medium (uden hexadimethrine bromid). Inkuber cellerne ved 37 ° C natten over.

2. Forkæl forgyldtceller med terapeutisk komponent / reagens

1. Dag 4 - Aspirer medier fra brønde og tilføj nye medier, der indeholder terapeutisk bestanddel på det optimale koncentration. Som med dyrkningsbetingelser, vil behandlinger variere og rette koncentrationer og varigheder bør fastlægges på forhånd. I vores undersøgelse har vi brugt 100 ng / ml TRAIL og 1 μM af paclitaxel. Cellerne blev behandlet i 48 timer.
2. Overlevende celler bør re-seedede i T75 kolber og lov til at udvide, indtil næsten 100% sammenflydende.
3. (Valgfrit) I slutningen af ​​selektion, inspicere kontrol parabol A og Kontrol parabol B. parabol A og parabol B skulle hver have færre kolonier end mindst én af de samlede bibliotek retter. Hvis der er et uventet stort antal kolonier i parabol A, end både transduktion processen har påvirket en sti relateret til den ønskede fænotype, eller det selektive pres, er ikke tilstrækkelig stærk og re-optimering af analysen kan være nødvendig. Hvis Dish B indeholder for mange kolonier, Så er udtryk for shRNA og engagement af RNAi pathway kan have en effekt på fænotype af interesse. Hvis dette er tilfældet, gentages med SHC001H at sikre, at effekten ikke er specifik for SHC002H.

3. Deconvolution fra et polyklonalt cellepopulation

1. Høst heterogen population af celler fra hver subpool og isolere genomisk DNA. I vores undersøgelse var cellerne vasket kortvarigt i PBS og trypsinized før genomisk DNA blev isoleret ved hjælp af GenElute Mammalian Genomisk Miniprep kit og medfølgende protokol (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativt kan enhver anden genomisk rensning kits, der i øjeblikket findes på markedet, skal bruges til DNA isolation. Det er vigtigt at følge protokol anbefalinger til grundbeløbet for dyrkede celler.
2. PCR-amplifikation af mål. Den shRNA skabelon inddrivelsesproceduren gør forstærkning af hele puljen af ​​shRNA indsætter fra den markerede celle population, eller hentning af enkeltedobbelt shRNA skabeloner fra kolonier, der var individuelt plukket og udvidet. Efter forstærkning af shRNA skær fra kontrol og udvalgte target-cellerne, kan PCR-produkterne blive sekventeret.
3. Denne PCR amplifikation skridt blev optimeret ved hjælp af Sigma ReadyMix, katalognr No P2893. Andre reagenser kan bruges til forstærkning, men cyklisternes forhold og / eller magnesium koncentration kan være nødvendigt at blive ændret for vellykket forstærkning. Forstærkning primere ved koncentrationen 20 mM er inkluderet med LentiPlex kit.
4. Opsæt PCR-reaktion som beskrevet i tabel 1. Tilføj komponenterne i den viste rækkefølge. De beskrevne beløb er for en 50 μL reaktion. Til flere reaktioner, skalere Master Mix komponenter ved det ønskede antal reaktioner og med 10% overskud. Mængden af ​​DNA-skabelon anbefales er 50-100 ng.
5. Det anbefales kraftigt, at for en reaktion skabelonen består af missionen shRNA Menneskelige Positiv kontrol Vector fortyndet til approprIATE koncentration. Vellykket forstærkning med denne skabelon angiver, at PCR-analysen komponenter og cyklisternes forhold er tilstrækkelige. BEMÆRK: For at forhindre overførsel forurening af eksperimentelle prøver og reagenser, foreslås det, at den positive kontrol fortyndes i et separat sted, hvorfra de efterfølgende PCR-reaktioner er sat op.
6. Gem PCR-programmet, der er anført i tabel 2 i din thermocycler.
7. For hver prøve, kombinere 3 μL PCR reaktion med 1 ml af farvestof og electrophorese sammen med 5 mikroliter af DirectLoad ™ PCR 100 bp Lav Ladder, katalognummer D3687 på en 1% agarosegel at bekræfte tilstedeværelsen af ​​en 309 bp amplikonet.
8. Subcloning af PCR amplikationsprodukter: PCR-produkter blev TOPO klonet ved hjælp af TOPO-TA kloning kit, efter fabrikantens protokol (Invitrogen, K4575-01). Resultatet er, at man PCR-produkt er indeholdt i hver vektor.
9. 250 individuelle bakteriekolonier (der hver indeholder en enkelt PCR-amplikon) blev isoleret og voksen i 2 ml kulturer af LB med 100 mg / mL ampicillin. Plasmid DNA blev derefter ekstraheret ved hjælp af GenElute Plasmid Miniprep kit (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. Renset plasmid DNA blev fordøjet med EcoRI og electrophoresed at bekræfte tilstedeværelsen af ​​indsatsen.
11. Plasmid DNA-prøver blev derefter sekventeret og shRNA indsætte identificeret ved hjælp af LentiPlex shRNA Sequence Søg database, med LentiPlex biblioteket.

4. Target Identifikation og validering

1. Den shRNA sekvens indleder med 5'-GAAACACCGG-3 '. Indtast mindst de næste 10, men mindre end 21 nukleotider, som forespørgslen sekvens i boksen Søg på vedlagte shRNA Sequence Søg Access-database form.
2. Vælg arter af poolede shRNA. Du kan også markere den subpool hvorfra sekvens blev fundet.
3. Klik nu på "Find Potentielle Hits"-knappen for at udføre søgningen. Dette bør identificere den tilsvarende TRC shRNA sekvens (er), der svarer the sekventering data. Yderligere oplysninger om TRC shRNA sekvens (er) identificeret, og de ​​tilsvarende gen mål kan let findes på Sigma-Aldrich er dit foretrukne Gene: http://www.sigma.com/yfg
4. Identificerede målgener bør valideres ved at gentage den oprindelige screening assay med den oprindelige TRC klon plus mindst to yderligere shRNAs, der er målrettet det samme gen ved hjælp af en 1 shRNA til 1 boringen format. Ægte hits vil vise den samme fænotype i et flertal af brønde.

5. Repræsentative resultater

Et eksempel på en LentiPlex poolet skærm workflow er nærmere beskrevet i figur 1. Transduced celler, der bredte sig i overværelse af TRAIL og paclitaxel fik lov til at udvide, indtil kolber var sammenflydende. Genomisk DNA blev høstet og underkastes den PCR-forstærkning og kloning som vist i figur 1 A, før de forelægges til sekvensering og shRNA identifikation som beskrevet i FiguAd 1 C. 250 kloner blev sekventeret, af disse 25 blev repræsenteret af flere kloner og de resterende 225 var repræsenteret af kun 1 klon, og de blev ikke forfulgt på dette tidspunkt.

Som vist i figur 2, var der flere kandidatgener herunder TBX3, PPP2CA og AKT2 repræsenteret af flere kloner. T-box transskription faktor, TBX3 dukkede op i alt fire kloner og har været involveret i tumor migration ^5. PPP2CA nedregulering har vist sig at fastholde væksten i LNCaP celler dyrket i androgen mangelfulde forhold ved at fritage androgen-afsavn-induceret celle-cyklus anholdelse og forhindre apoptose ^6. AKT2 er en RAC-beta serin / threonin-protein kinase og formodede oncogene påvist at spille flere roller i udviklingen af kræft ^{7, 8.}

* Endelig koncentration af Mg ^{2 +} i opløsning, vil være 3 mm;1,5 mm er bidraget fra Taq ReadyMix og 1,5 mm fra Magnesiumchlorid løsning.
Tabel 1. Lentiplex PCR reaktionsbetingelser

Tabel 2. Lentiplex PCR-amplifikation Program

Figur 1. (A) LentiPlex poolet skærm, (B) Polyklonale deconvolution workflow, og (c) identifikation af shRNA mål.

A. LentiPlex pooled skærmen. Først Seed celler, derefter tilføje shRNA subpools, (10 pools i alt, hver udført i tre eksemplarer, i 30 retter i alt). Dernæst behandles med terapeutiske komponent / reagens (i vores tilfælde, trail og Paclitaxel, henholdsvis). Derefter reseeder overlevende celler i kolber og tillade at ekspandere. Harvest heterogen population af celler fra hver subpool og isolere genomisk DNA.

B. Polyklonale deconvolution. Udfør PCR til at forstærke DNA indeholder shRNA indsætte. PCR-produktet er ensartet i størrelse, men polyklonale i rækkefølge, da skabelonen gDNA var også polyklonale. PCR-produkt er klonet ind i vektor og derefter omdannet til kompetente bakterier.

C. Identifikation af shRNA mål. Individuelle kolonier er isolerede og plasmid DNA ekstraheres. Hver klon indeholder kloning vektor med en enkelt PCR fragment. Plasmid DNA er fordøjet at bekræfte tilstedeværelsen af ​​insert-og sekventeret. Den shRNA Indsatsen er identificeret ved hjælp af LentiPlex shRNA Sequence Search database.

Figur 2. Identificerede Cankandidat Gener. 25 kandidatgener blev identificeret, der havde flere hits. 225 kandidatgener havde kun 1 hit og blev ikke forfulgt. Se venligst Supplerende tabel 1 for en opdeling af de enkelte kloner per kandidat genet.

Supplerende Tabel 1. Individuelle TRC Bibliotek kloner identificeres ud fra Polyklonale Sequencing Gene ID Hits opdaget Clones.

Discussion

I denne undersøgelse præsenterer vi et genom-dækkende skærmen for at identificere gener involveret i cytotoksicitet A549 celler efter paclitaxel / TRAIL behandling. Brugen af ​​en samlet tilgang i et genom-wide screen reducerer den tid, omkostninger og udstyr investering normalt forbindes med konventionel klædt skærme. Afgørende for succes på skærmen, er optimeringen eksperimenter udført på forhånd. Transduktion betingelser og MOI skal være empirisk bestemmes.

Valget metode skal give mulighed for robust markering af celler vise den ønskede fænotype (fx overlevelse, overflade protein udtryk osv.). Optimering af disse parametre vil reducere antallet af falske opdaget positiver.

Her blev gDNA høstet af den samlede population af udvalgte celler og derefter TOPO klonede for at identificere individuelle shRNA skær. En mulig forbedring for dette eksperiment ville have været at vælge for levende celler ved hjælp af FACS at sikreat kun levende celler er indsamlet. De identificerede mål vil blive valideret af transduktion med target-specifikke shRNAs i en screening assay. Ægte hits vil vise fænotype i et flertal af brønde.

Den LentiPlex Pooled Bibliotek er fleksibel i sin anvendelse. Den er kompatibel med en bred vifte af downstream applikationer og kan anvendes med enten positive eller negative valg strategier. Afhængigt af screening betingelser, deconvolution af shRNA skær er opnået via PCR / kloning, microarray, eller næste generation sekventering ^{9, 10.} Mens kraft og hastighed af disse teknikker til at deconvolute RNAi skærme er veletableret, en bekymring med microarray og næste generation sekventering metoder er tilgængeligheden af ​​bioinformatik ressourcer og viden er nødvendig for at korrekt analysere og fortolke eksperimentelle resultater. Omkostningerne forbundet med disse teknikker kan ofte være en barriere for virksomheden af ​​genomet brede skærme. APCR / kloning tilgang, mens ikke så kraftig som microarrays og næste generation sekventering er en effektiv og billigere alternativ.

Agilent tilbyder nu en tilpasset række baseret på TRC shRNA biblioteket til yderligere støtte i LentiPlex skærme. Disse muligheder give forskere til at bruge LentiPlex at studere en bred vifte af cellulære funktioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LentiPlex Pooled Array	Sigma-Aldrich	SHPH01
A549 Cells	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	T5694
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Cloning Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893
GenElute Plasmid Miniprep kit	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine bromide	Sigma-Aldrich	H9268