MISSIE LentiPlex Gepoolde shRNA Library Screening in zoogdiercellen

Summary

Hier gebruiken we een menselijke LentiPlex samengevoegde bibliotheek en traditionele sequencing methoden om gen-doelstellingen het bevorderen van overleving van de cel te identificeren. Laten we zien hoe op te zetten en deconvolute een LentiPlex scherm en valideren van de resultaten.

Abstract

RNA-interferentie (RNAi) is een intrinsieke cellulair mechanisme voor de regulatie van genexpressie. Het aanwenden van de aangeboren kracht van dit systeem stelt ons in staat om knockdown genexpressie niveaus in het verlies van gen-functie studies.

Er zijn twee belangrijke methoden voor het uitvoeren van RNAi. De eerste is het gebruik van kleine interfererende RNA's (siRNA's), die chemisch zijn gesynthetiseerd, en de tweede maakt gebruik van korte-hairpin RNA (shRNAs) gecodeerd in plasmiden ^1. De laatste kan worden getransfecteerd in cellen die direct of verpakt in replicatie incompetent lentivirale deeltjes. De belangrijkste voordelen van het gebruik van lentivirale shRNAs is het gemak van binnenkomst in een grote verscheidenheid van celtypes, hun vermogen om stabiel te integreren in het genoom voor de lange termijn-gen knockdown en selectie, en hun effectiviteit in het uitvoeren van high-throughput verlies van functie schermen. Om dit te vergemakkelijken hebben we de LentiPlex gepoolde shRNA bibliotheek.

Het MISSION LentiPlex Human shRNA Gepoolde Library is een genoom-brede geproduceerd met behulp van lentivirale zwembad een gepatenteerd proces. De bibliotheek bestaat uit meer dan 75.000 shRNA construeert uit de TRC-collectie richt 15.000 + menselijke genen ^2. Elke bibliotheek is getest voor shRNA vertegenwoordiging voor product vrij te geven aan uitgebreide bibliotheek dekking te verzekeren. De bibliotheek wordt geleverd in een kant-en-klare lentivirale formaat met titers van ten minste 5 x 10 ⁸ TU / ml via p24 test en is vooraf verdeeld in tien subpools van zo'n 8.000 shRNA bouwt elk. Amplificatie en sequencing primers zijn ook voorzien voor downstream target identificatie.

Eerdere studies is een synergetische antitumor activiteit van TRAIL in combinatie met paclitaxel in A549-cellen, een humane longcarcinoom cellijn ^{3, 4.} In deze studie tonen we de toepassing van een gepoolde LentiPlex shRNA bibliotheek om snel te voeren een positieve selectie scherm voor genen die betrokken zijn bij de cytotoxiciteit of A549 cellen bij blootstelling aan TRAIL en Paclitaxel. Een barrière die vaak ondervonden met high-throughput-schermen zijn de kosten en moeite met het deconvolutie, hebben we ook uitvoerig een kosten-effectieve aanpak van polyklonaal gebruik te maken van traditionele sequencing.

Protocol

LentiPlex Samengevoegde Scherminstelling

Te identificeren shRNA sequenties van belang, is het essentieel om het scherm zodanig dat de meerderheid van de cellen ontvangen slechts een shRNA bouwen. Door het gebruik van een lage MOI (multipliciteit van infectie), is de kans van meerdere integranten per cel sterk verminderd. Echter, transductie efficiëntie, en dus de gewenste MOIS, sterk afhankelijk van de doelcel type. Daarom is het noodzakelijk dat de bepaling van de optimale MOI wordt uitgevoerd voordat het scherm in een nieuwe cel type.

1. Transductie van Target Cellen met de missie LentiPlex Pooled shRNA Bibliotheek

1. De werkelijke MOI gebruikt zal variëren voor de verschillende celtypes. Indien repliceert gewenst zijn dan is het aantal platen moeten dienovereenkomstig worden verhoogd. Daarnaast, meestal is het niet voordelig zijn om de verschillende subpools combineren. Het bijhouden van de subpools elkaar te scheiden zal helpen bij de deconvolutie proces. Zorgen voor proper etikettering van elke weefselkweek schotel met het subpool nummer dat is toegepast tijdens transductie. Een lage MOI wordt geadviseerd om de waarschijnlijkheid van meerdere integranten per cel te verminderen.
2. Dag 1 - Seed het juiste aantal van 60-mm gerechten met genoeg cellen tot ~ 70% confluentie te verkrijgen over de volgende dag (10 zwembaden in totaal, elk in drievoud uitgevoerd = 30 gerechten in totaal). Voor onze studie werden 60 mm gerechten bezaaid met 6 x 105 A549 cellen tot een confluentie van 70% voorafgaand aan de transductie. Dit zorgt ervoor dat cellen nog in de exponentiële groeifase. Groeicijfers is afhankelijk van celtype en moet worden bepaald voordat het scherm.
3. Laat cellen om zich te houden door incubatie overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde incubator in een atmosfeer van 5% CO _2.
4. (Optioneel) Inclusief twee extra 60-mm gerechten voor transductie met negatieve controle shRNAs. Het etiket van de gerechten "Control A" voor SHC001H en "Control B" voor SHC002H.
5. Dag 2 - transduceren ee-cellen met de LentiPlex virale deeltjes. Op de dag van transductie, dooi de lentivirale deeltjes op het ijs.
6. Breng de ontdooide deeltjes om een ​​laminaire stroming kap en blijf op het ijs als niet onmiddellijk wordt gebruikt.
7. Bereken hoeveel van elke individuele virale sub-pool toe te voegen aan de cellen naar de MOI van een te krijgen in alle celcultuur gerechten.
   1. Voorbeeld: 1 x 10 ⁶ cellen / schaaltje; virale titer = 5 x 10 ⁸ TU / ml; een gewenste MOI van 1. i.) 1 x 10 ⁶ cellen / schaaltje x (MOI van 1) = 1 x 10 ⁶ transducerende units (TU) nodig ii.) 1 x 10 ⁶ TU / (5,0 x 10 ⁸ TU / ml), verkregen uit de C van A = 2 pi van lentivirale stockoplossing moet worden toegevoegd aan het juiste gerecht. Verdun de berekende hoeveelheid van het virus in 100-300 pi van complete media om een ​​betere spreiding van het virus wanneer toegevoegd aan de celkweek gerecht te verzekeren.
8. Verwijder het afdrukmateriaal uit de pre-geënte cellen. Voeg complete media containing hexadimethrine bromide oplossing voor elk gerecht. De aanbevolen uiteindelijke concentratie van hexadimethrine bromide in de media is 8 pg / ml. Gebruik minder hexadimethrine bromide als je het te giftig zijn voor uw doelgroep cellen.
9. Voeg shRNA lentivirale deeltjes passende gerechten in overeenstemming met de vooraf bepaalde experimentele opzet. Zwenk de platen aan het virus gelijkmatig verdelen over cellen.
10. Incubeer 18-20 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator in een atmosfeer van 5% CO _2.
11. (Optioneel) Herhaal drie tot acht op de identieke MOI met SHC001H (lege vector shRNA Control) in Control Dish A en SHC002H (scrambled shRNA controle) in Control Dish B. identiek deze gerechten Behandel de experimentele gerechten gedurende het experiment.
12. Dag 3 - Verander de media. Aspireren virus-bevattende media en voeg verse compleet media (zonder hexadimethrine bromide). Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende de nacht.

2. Behandel verguldecellen met therapeutische component / reagens

1. Dag 4 - Zuig media van putten en voeg verse media met therapeutische component op de optimale concentratie. Net als bij kweekomstandigheden, zullen behandelingen variëren en de juiste concentraties en duur moet vooraf worden bepaald. In onze studie gebruikten we 100 ng / mL van TRAIL en 1 uM van paclitaxel. Cellen werden behandeld gedurende 48 uur.
2. Overlevende cellen opnieuw worden gezaaid in de T75 kolven en toegestaan ​​om uit te breiden tot bijna 100% confluent.
3. (Optioneel) Aan het einde van de selectie, te inspecteren Controle Schotel A en Control Schotel Schotel B. A en B, moet elke schotel minder kolonies dan ten minste een van de samengevoegde bibliotheek gerechten. Als er een onverwacht hoog aantal kolonies in Dish A, dan ofwel de transductie-proces heeft beïnvloed een weg met betrekking tot de gewenste fenotype of de selectieve druk is niet voldoende sterk en re-optimalisatie van de test kan worden verlangd. Als Dish B bevat te veel kolonies, Dan is de expressie van shRNA en de betrokkenheid van de RNAi pathway kan een effect hebben op het fenotype van belang. Als dit het geval is herhalen met SHC001H, om ervoor te zorgen dat het effect niet specifiek is voor SHC002H.

3. Deconvolutie van een polyklonaal celpopulatie

1. Oogst de heterogene populatie van cellen van elk subpool en isoleren genomisch DNA. In ons onderzoek werden cellen kort gewassen in PBS en getrypsiniseerd voordat genomisch DNA werd geïsoleerd met behulp van de GenElute zoogdieren Genomic Miniprep kit en geleverd protocol (Sigma-Aldrich, G1N70). Als alternatief kan een andere genomische zuivering kits die momenteel beschikbaar zijn op de markt worden gebruikt voor DNA-isolatie. Het is belangrijk om aanbevelingen op te volgen protocol voor het basisbedrag van gekweekte cellen.
2. PCR-amplificatie van targets. De shRNA template recovery procedure maakt versterking van de gehele pool van shRNA inserts van de geselecteerde cel bevolking, of het ophalen van de individueledual shRNA sjablonen van kolonies die individueel werden geplukt en uitgebreid. Na de versterking van shRNA inserts van controle en geselecteerde doelcellen, kan de PCR-producten worden gesequenced.
3. Deze PCR-amplificatie stap werd geoptimaliseerd met behulp van Sigma Readymix, Catalog No P2893. Andere reagentia kunnen worden gebruikt voor versterking, maar de fiets-voorwaarden en / of magnesium concentratie moet mogelijk worden aangepast voor een succesvolle versterking. Amplificatieprimers bij de concentratie 20 mm zijn meegeleverd met de LentiPlex kit.
4. Het opzetten van de PCR-reactie zoals beschreven in Tabel 1. Voeg de componenten in de aangegeven volgorde. De beschreven bedragen zijn voor een 50 pi reactie. Voor meer reacties, schaal van de master mix componenten door het gewenste aantal reacties en inclusief 10% overmaat. De hoeveelheid DNA-template te raden is 50-100 ng.
5. Het wordt sterk aanbevolen dat voor een reactie van de template bestaat uit de MISSION shRNA Human positieve controle Vector verdund tot de approprIATE concentratie. Succesvolle versterking met deze sjabloon geeft aan dat de PCR-test componenten en fietsen omstandigheden adequaat zijn. LET OP: Om te voorkomen dat overdracht besmetting van experimentele monsters en reagentia, wordt gesuggereerd dat de positieve controle worden verdund in een andere locatie dan waar de volgende PCR-reacties zijn ingesteld.
6. Sla het PCR-programma vermeld in tabel 2 in uw thermocycler.
7. Voor elk monster, combineer drie pi PCR-reactie met een pi van kleurstof en electrophorese samen met 5 pi van DirectLoad ™ PCR-100 bp Low Ladder, Catalogusnummer D3687 op een 1% agarose gel om de aanwezigheid van een 309 bp amplicon te bevestigen.
8. Subklonering van PCR amplicons: PCR-producten werden TOPO gekloond met behulp van de TOPO-TA klonering kit, volgende protocol van de fabrikant (Invitrogen, K4575-01). Het resultaat is dat een PCR-product wordt opgenomen in elke vector.
9. 250 Individuele bacteriële kolonies (elk met een individuele PCR-amplicon) werden geïsoleerd en groeienn in 2 ml culturen van LB met 100 mg / ml ampicilline. Plasmide DNA werd vervolgens geëxtraheerd met behulp van de GenElute Plasmide Miniprep kit (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. Gezuiverde plasmide DNA werd geknipt met EcoRI en elektroforese om de aanwezigheid van de insert te bevestigen.
11. Plasmide DNA monsters werden vervolgens sequentie bepaald en de shRNA plaats geïdentificeerd met behulp van de LentiPlex shRNA Sequence Zoek databank die bij de LentiPlex bibliotheek.

4. Target identificatie en validatie

1. De shRNA volgorde initieert met 5'-GAAACACCGG-3 '. Geef ten minste de komende tien, maar minder dan 21 nucleotiden als de query sequentie in het vak Zoeken op de meegeleverde shRNA Sequence Zoek Access-database te vormen.
2. Kies de soort van de gepoolde shRNA. Optioneel, selecteert u de subpool waarvan de sequentie werd gevonden.
3. Klik nu op "Zoek Potential Hits" knop om de zoekopdracht uit te voeren. Dit moet welke de overeenkomstige TRC shRNA sequentie (s) die overeenkomen met ee sequencing data. Meer informatie over de TRC shRNA sequentie (s) geïdentificeerd en de bijbehorende gen doelen kunnen gemakkelijk worden gevonden bij Sigma-Aldrich is jouw favoriete Gene: http://www.sigma.com/yfg
4. Geïdentificeerde doelwitgenen dient te worden gevalideerd door het herhalen van de oorspronkelijke screeningstest met de originele TRC kloon vermeerderd met ten minste twee extra shRNAs dat hetzelfde gen met behulp van een een shRNA tot een goed format doel. Echte hits zullen weer hetzelfde fenotype in een meerderheid van de putten.

5. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van een LentiPlex gepoolde scherm workflow wordt gedetailleerd beschreven in figuur 1. Getransduceerde cellen die verspreidden zich in de aanwezigheid van TRAIL en Paclitaxel mochten om uit te breiden tot de flessen werden confluent. Genomic DNA werd geoogst en onderworpen aan de PCR-amplificatie en klonen zoals geïllustreerd in figuur 1 A, alvorens te worden ingediend voor sequencing en shRNA identificatie, zoals beschreven in FIGUre een C. 250 klonen werd de sequentie van deze 25 waren vertegenwoordigd door meerdere klonen en de overige 225 werden vertegenwoordigd door slechts een kloon en waren niet nagestreefd op dit moment.

Zoals weergegeven in figuur 2, werden verscheidene kandidaat-genen waaronder TBX3, PPP2CA, en AKT2 vertegenwoordigd door meerdere klonen. De T-box transcriptiefactor, TBX3 verscheen in een totaal vier klonen en is betrokken bij tumor migratie ^5. PPP2CA downregulatie is aangetoond dat de groei van LNCaP cellen gekweekt in androgeen gebrekkige omstandigheden te behouden door het verlichten van de androgeen-ontbering-geïnduceerde cel cyclus arrest en het voorkomen van apoptose ^6. AKT2 is een EVC-bèta serine / threonine-proteïne kinase en vermeende oncogen aangetoond dat verschillende rollen te spelen in de ontwikkeling van kanker ^{zeven, acht.}

* Definitieve concentratie van Mg ^{2 +} in de oplossing zal 3 mm;1,5 mM is bijdrage van het Taq Readymix en 1,5 mm van de magnesium chloride-oplossing.
Tabel 1. Lentiplex PCR-reactie-omstandigheden

Tabel 2. Lentiplex PCR amplificatie Program

Figuur 1. (A) LentiPlex gepoolde scherm (B) Polyklonale deconvolutie workflow, en (C) de identificatie van shRNA doelen.

A. LentiPlex gepoolde scherm. Eerste Seed cellen vervolgens, shRNA subpools toe te voegen, (10 zwembaden in totaal, elk in drievoud uitgevoerd, voor 30 gerechten in totaal). Vervolgens behandelen met therapeutische component / reagens (in ons geval, TRAIL en Paclitaxel, respectievelijk). Dan, overlevende cellen reseed in flesjes en laat uit te breiden. Oogst heterogene populatie van cellen van elk subpool en isoleren genomisch DNA.

B. Polyklonale deconvolutie. Voer PCR voor DNA dat de shRNA insert versterken. Het PCR-product is uniform in grootte, maar polyklonale in de juiste volgorde, omdat de template gDNA was ook polyklonale. PCR-product wordt gekloneerd in de vector en vervolgens getransformeerd in competente bacteriën.

C. Identificatie van shRNA targets. Individuele kolonies worden geïsoleerd en plasmide DNA wordt gewonnen. Elke kloon bevat de kloneringsvector met een individuele PCR-fragment. Plasmide DNA wordt verteerd om de aanwezigheid van de insert en gesequenced bevestigen. De shRNA insert wordt geïdentificeerd met behulp van de LentiPlex shRNA Sequence Search database.

Figuur 2. Geïdentificeerd kandidaat Genen. 25 kandidaat-genen geïdentificeerd die had meerdere hits. 225 kandidaat-genen had slechts een hit en werden niet voortgezet. Zie Aanvullende tabel 1 voor een overzicht van de individuele klonen per kandidaat gen.

Aanvullende Tabel 1. Individuele TRC Bibliotheek klonen geïdentificeerd uit Polyclonal Sequencing Gene ID Hits gedetecteerd Clones.

Discussion

In deze studie presenteren we een genoom-brede scherm om genen die betrokken zijn bij cytotoxiciteit van A549 cellen volgende paclitaxel / TRAIL behandeling te identificeren. Het gebruik van een gepoolde aanpak in een genoom-brede scherm vermindert de tijd, kosten en investeringen in outillage normaal geassocieerd met conventionele gehuld schermen. Cruciaal voor het succes van het scherm zijn optimalisatie van experimenten op voorhand uitgevoerd. Transductie voorwaarden en MOI moeten empirisch worden bepaald.

De selectie methode moet het mogelijk maken voor robuuste selectie van cellen die de weergave van de gewenste fenotype (bijvoorbeeld, overleving, oppervlakte-eiwit expressie, enz.). Optimaliseren van deze parameters zal het aantal ontdekte valse positieven.

Hier werd gDNA geoogst uit de totale populatie van de geselecteerde cellen en vervolgens TOPO gekloond om individuele shRNA inserts te identificeren. Een mogelijke verbetering voor dit experiment zou zijn geweest om te selecteren op levende cellen met behulp van FACS om ervoor te zorgendat alleen levende cellen worden verzameld. Aan de vastgestelde doelstellingen zullen worden gevalideerd door transductie met target-specifieke shRNAs in een screeningstest. Echte hits zullen weer het fenotype in een meerderheid van de putten.

De LentiPlex Gepoolde Bibliotheek is flexibel in de toepassing ervan. Het is compatibel met een breed scala aan afgeleide toepassingen en kan worden gebruikt met een positieve of negatieve selectie strategieën. Afhankelijk van de screening voorwaarden, deconvolutie van de shRNA inserts wordt bereikt via PCR / klonen, microarray, of next-generation sequencing ^{9, 10.} Terwijl de kracht en de snelheid van deze technieken om RNAi schermen deconvolute goed ingeburgerd is, een concern met microarray en next-generation sequencing methoden is de beschikbaarheid van bio-informatica middelen en kennis die nodig is om correct te analyseren en de experimentele resultaten te interpreteren. De kosten verbonden aan deze technieken kunnen vaak tijden worden een belemmering voor de onderneming van genoom-wijde schermen. APCR / klonen gebaseerde aanpak, terwijl het niet zo krachtig als microarrays en next-generation sequencing is een effectief en goedkoper alternatief.

Agilent biedt nu een aangepaste reeks op basis van de TRC shRNA bibliotheek om verdere steun in LentiPlex schermen. Deze opties kunnen de onderzoekers om LentiPlex te gebruiken om een ​​breed scala van cellulaire functies te bestuderen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LentiPlex Pooled Array	Sigma-Aldrich	SHPH01
A549 Cells	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	T5694
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Cloning Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893
GenElute Plasmid Miniprep kit	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine bromide	Sigma-Aldrich	H9268