Summary
ここでは、細胞の生存を促進する遺伝子標的を同定するために人間のLentiPlexプールされたライブラリと伝統的なシーケンシングメソッドを使用します。我々はセットアップとdeconvolute LentiPlexの画面を表示し、結果を検証する方法を示します。
Abstract
RNA干渉（RNAi）は遺伝子発現の調節のための本質的な細胞メカニズムです。活用するこのシステムの生来のパワーは、遺伝子機能研究の損失でノックダウンの遺伝子の発現レベルを可能にしています。
RNAi実験を行うための2つの主要な方法があります。最初は化学的に合成される低分子干渉RNA（siRNA）の使用です、2番目はプラスミド1内のエンコードされたショートヘアピンRNA（shRNA）を利用しています。後者は、直接細胞にトランスフェクションまたは複製無能なレンチウイルス粒子にパッケージすることができます。レンチウイルスshRNAを使用する主な利点は、細胞型、安定的に長期の遺伝子ノックダウンと選択のためのゲノムに統合する能力、および機能の画面の高スループットの損失を行う上でその有効性の多種多様に導入が容易であることです。これを容易にするために我々はshRNAライブラリーをプールされたLentiPlexを作成しました。
MISSIONのLentiPlex人間のshRNAのプールライブラリは、独自のプロセスを使用して生成したゲノムワイドなレンチウイルスのプールです。ライブラリは15,000をターゲットにTRCのコレクションから75000以上のshRNAコンストラクト+ヒト遺伝子2で構成されています。各ライブラリは、堅牢なライブラリのカバレッジを確保するため、製品のリリース前に、shRNAの表現のためにテストされています。ライブラリは、P24アッセイを介して少なくとも5 × 10 8 TU / mlの力価ですぐに使用できるレンチウイルス形式で提供していますされ、事前分割約8,000 shRNAの十サブプールにそれぞれを構築する。増幅とシークエンシングプライマーはまた、下流のターゲットを識別するために提供されています。
A549細胞は、ヒト肺癌細胞株3、4におけるパクリタキセルと組み合わせると、これまでの研究では、エクストレイルの相乗抗腫瘍活性を設立。本研究では、プールされたLentiPlexのshRNAライブラリのアプリケーションは急速に細胞毒性Oに関与する遺伝子の正の選択画面を実施する方法を示しますF A549細胞TRAILとパクリタキセルにさらされる。頻繁に高スループットのスクリーンで遭遇する一つの障壁はコストとデコンボリューションすることが困難であり、我々はまた、詳細伝統的なシーケンシングを利用したコスト効率の高いポリクローナルなアプローチを。
Protocol
LentiPlexプールされた画面のセットアップ
興味のshRNA配列を識別するには、それは細胞の大部分は1つだけshRNAをコンストラクトを受け取るように画面を設定することが重要です。 （感染多重度）低MOIを使用して、セルごとに複数のintegrantsの確率が大幅に減少している。しかし、形質導入効率、したがって、目的の湿気は、標的細胞の種類に強く依存する。したがって、最適なMOIの判断は、新しい細胞のタイプの画面を起動する前に実施されることが不可欠です。
1。 shRNAのライブラリプールされたミッションのLentiPlexと標的細胞の伝達
- 使用されるMOI実際には、異なる細胞タイプごとに異なります。望まれる複製場合は、プレートの数はそれに応じて増やす必要があります。さらに、一般的にそれは別のサブプールを組み合わせることは有益ではないことになります。サブプールを別に持つことでデコンボリューション処理に役立ちます。 propeを確認してください伝達の間に適用されるサブプール番号と各組織の培養皿のrのラベリング。低MOIは、セルごとに複数のintegrantsの確率を低減することをお勧めします。
- 1日目 - 翌日（合計で10のプール、= 30皿合計3回の反復実験を行い、それぞれ）で〜70％コンフルエントを取得するために十分な細胞を60 - mmディッシュのシードを適切な数。私たちの研究のために、60 mmの培養ディッシュは、前の情報伝達〜70％のコンフルエンシーを達成するために6 × 105 A549細胞を播種した。これは、細胞が対数増殖期に残っていることを保証します。成長率は、細胞のタイプによって異なりますし、画面を起動する前に決定しなければならない。
- 細胞は37℃で一晩インキュベートCの加湿インキュベーター中で5％CO 2の雰囲気の中でで付着することができます。
- （省略可能）ネガティブコントロールshRNAの持つ形質導入のための二つの追加、60 mmディッシュを含めます。ラベル料理はSHC001HとSHC002Hのための"コントロールB"のために"制御"。
- 2日目 - 形質導入目LentiPlexウイルス粒子と電子の細胞。トランスダクションの日に、氷の上でレンチウイルス粒子を解凍。
- 層流フードへの融解粒子を移し、すぐに使用されていない場合は氷上に置きます。
- 計算どのくらいのすべての細胞培養皿全体にMOI 1を取得するセルに追加する個々のウイルスのサブプールの。
- 例：1 × 10 6細胞/ディッシュ、ウイルス力価= 5 × 10 8 TU / mlに、所望のMOI 1。 I.）1 × 10 6細胞/皿×（MOI 1）= 1 × 10 6形質導入ユニット（TU）は、Cから得られるII。）1 × 10 6 TU /（5.0 × 10 8 TU / ml）を必要とレンチウイルスストック溶液の= 2μLの適切な皿に追加する必要があります。細胞の培養皿に追加されたウイルスのより良い流通を確保するために、完全なメディアの100〜300μLでウイルスの計算量を希釈する。
- 事前に播種した細胞からメディアを取り外します。完全なメディアコンタを追加します。各皿にiningヘキサジメトリンブロマイド溶液。メディアのヘキサジメトリン臭の推奨最終濃度が8μg/ mlのです。あなたはそれがあなたの標的細胞に有毒であることが判明した場合少ないヘキサジメトリンブロマイドを使用してください。
- 所定の実験設計に従って適切な料理にしたshRNAレンチウイルス粒子を追加。優しくスワールプレートが均等に細胞全体にウイルスを配布する。
- 37℃で18-20時間のインキュベート℃、5％CO 2の大気中の加湿インキュベーター中C。
- コントロールディッシュBのとSHC002Hが（スクランブルshRNAを対照）実験を通して、実験皿と同じようにこれらの料理を扱うコントロールディッシュで（空のベクターのshRNAコントロール）SHC001HとMOI同一で（省略可）3-8。
- 3日目 - メディアを変更します。ウイルスを含む培地を吸引除去し、新鮮な完全培地を（臭化ヘキサジメトリンなし）に追加します。 37℃で一晩細胞をインキュベートする。
2。メッキ扱う治療コンポーネント/試薬で細胞
- 4日目 - 井戸から吸引メディアと最適濃度の治療成分を含む新鮮な培地を加える。培養条件と同様に、治療法は変わるし、適切な濃度と持続時間を事前に決定されるべきである。私たちの研究では、パクリタキセルのTRAILおよび1μMの100 ng / mLを使用。細胞を48時間処理した。
- 生存細胞をT75フラスコに再播種し、ほぼ100％コンフルエントになるまで拡大して許可する必要があります。
- （オプション）選択の最後に、皿とコントロールディッシュB.皿と皿のBを制御検査は、プールされた各ライブラリの料理の少なくとも一つより少ないコロニーを持つ必要があります。皿のコロニーが予想外に高い数値がある場合は、どちら伝達プロセスが所望の表現型や選択圧に関連する経路に影響を与えているよりも、アッセイの十分に強いと再最適化ではないが必要になることがあります。皿Bは、あまりにも多くのコロニーが含まれている場合、その後、RNAi経路のshRNAのと婚約の式は、関心の表現型に影響を及ぼす可能性があります。これはSHC001Hの場合の繰り返しの場合、効果がSHC002Hに固有のものでないことを確認します。
3。ポリクローナル細胞集団からデコンボリューション
- 各サブプールから不均一な細胞集団を収穫し、ゲノムDNAを分離する。ゲノムDNAがGenElute哺乳類のゲノムミニプレップキットと付属のプロトコール（シグマアルドリッチ、G1N70）を用いて分離される前に、我々の試験では、細胞をPBSで軽く洗浄し、トリプシン処理した。また、現在市場で入手可能なその他のゲノム精製キットは、DNAの分離に使用することができます。培養細胞の開始量のためにプロトコルの勧告に従うことが重要です。
- ターゲットのPCR増幅。 shRNAのテンプレートのリカバリ手順は、選択された細胞集団からのshRNAが挿入さのプール全体の増幅、またはINDIVIの検索を可能にします個々に選ばれ、拡張されたコロニーからデュアルのshRNAテンプレート。コントロールと選択された標的細胞からのshRNAのインサートの増幅後、PCR産物の配列を決定することができます。
- このPCR増幅ステップはシグマReadyMix、カタログ番号P2893を使用して最適化されていました。他の試薬は、増幅のために使用することができますが、サイクリングの条件及び/またはマグネシウムの濃度は、良好な増幅のために変更する必要があります。濃度の20mMで増幅プライマーは、LentiPlexのキットに同梱されています。
- 表1に記載したようにPCR反応をセットアップします。記載されている順序でコンポーネントを追加します。に記載の金額は、1つの50μLの反応のためのものです。より多くの反応の場合、反応の希望数によってマスターミックス成分をスケーリングし、10％の超過などがあります。 DNAテンプレートの量が推奨さは50-100 ngのです。
- それは強くつの反応のためのテンプレートがapproprに希釈したMISSION shRNAの人間のポジティブコントロールベクターで構成されていることをお勧めします。濃度をiate。このテンプレートを使用して成功した増幅はPCRのアッセイ成分とサイクリングの条件が適切であることを示しています。注意：実験試料と試薬のキャリーオーバーコンタミネーションを防ぐために、それをポジティブコントロールは、その後のPCR反応が設定されている場所とは別の場所に希釈されることが示唆された。
- あなたのサーモサイクラー中に表2に記載されているPCRプログラムを保存します。
- 各サンプルについて、DirectLoadの5μLと一緒に染料及び電気泳動させるの1μLで3μLのPCR反応™PCRは100bp低ラダー、カタログ番号D3687 1％アガロースゲル上で309 bpのアンプリコンの存在を確認することを組み合わせる。
- PCR増幅産物のサブクローニング：PCR産物は、TOPOは、製造者のプロトコール（Invitrogen社、K4575 - 01）に続く、TOPO - TAクローニングキットを用いてクローニングした。結果は、1つPCR産物をそれぞれのベクトルに含まれていることです。
- 250個々の細菌コロニーは、（それぞれが個々のPCRアンプリコンを含む）を単離し、成長した100 mg / mLのアンピシリンを含むLB 2mLの培養におけるn。プラスミドDNAをGenEluteプラスミドミニプレップキット（Sigma - Aldrich社、PLN70）を用いて抽出した。
- プラスミドDNAを精製することをEcoRIで消化し、インサートの有無を確認するために電気泳動した。
- プラスミドDNAのサンプルを、配列決定し、shRNAが挿入はLentiPlexライブラリで提供さLentiPlex shRNA配列検索データベースを用いて同定した。
4。ターゲットの同定とバリデーション
- shRNA配列は、5' - GAAACACCGG - 3'で開始します。同封のshRNA配列の検索のAccessデータベースのフォームの検索ボックスにクエリ配列として、少なくとも10の次が21未満のヌクレオチドを入力してください。
- プールされたshRNAの種を選択します。に応じて、シーケンスが発見されたからサブプールを選択します。
- 今すぐ検索を実行するには、"潜在的なヒットを検索"ボタンをクリックしてください。これは、番目に一致する、対応するTRC shRNA配列（複数可）を特定する必要がありますeはデータをシーケンシング。 TRC shRNA配列の詳細については（複数可）を識別し、対応する遺伝子標的を容易にシグマアルドリッチのお気に入りの遺伝子で見つけることができる。 http://www.sigma.com/yfg
- 同定された標的遺伝子は、元のTRCのクローンに1を加えたウェルフォーマットに1 shRNAを使用して同じ遺伝子をターゲットに少なくとも2つの追加のshRNAを、元のスクリーニングアッセイを繰り返して検証する必要があります。真のヒットは、井戸の大半で同じ表現型を表示します。
5。代表的な結果
LentiPlexプールされた画面のワークフローの例を図1に詳述されています。 TRAILとパクリタキセルの存在下で増殖している形質細胞がフラスコがコンフルエントになるまで拡大させた。ゲノムDNAを回収し、PCR増幅及びクローニングを図1に示すように、シーケンシングおよびshRNAの識別のために提出される前のようなふぃぎゅで記述されていたRE 1 C. 250クローンは、これら25の、配列決定した複数のクローンで表され、残りの225は唯一の1クローンで表され、この時点で追求されていなかった。
図2に示すように、TBX3、PPP2CA、およびAKT2を含むいくつかの候補遺伝子は、複数のクローンで表されていました。 T -ボックス転写因子、TBX3は4つのクローンの合計で登場し、腫瘍の移行5に関与している。 PPP2CAのダウンレギュレーションは、6アポトーシスアンドロゲン欠乏で誘導される細胞周期停止と予防を緩和することにより、アンドロゲン欠乏条件で培養したLNCaP細胞の成長を維持するために実証されています。 AKT2は、癌の開発7、8でいくつかの役割を果たすことが実証RAC -βセリン/スレオニンプロテインキナーゼと推定される癌遺伝子である。
のMg 2 *最終濃度+溶液中では3 mmとなります。1.5mMのを 、Taq ReadyMixとマグネシウムの塩化物溶液から1.5 mMから貢献しています。
表1。Lentiplex PCRの反応条件
表2。Lentiplex PCR増幅プログラム
図1。画面をプールされた（A）LentiPlex、（B）ポリクローナルデコンボリューションのワークフロー、およびshRNAのターゲットの（C）同定。
A.のLentiPlexは、画面をプールした。まず、シードの細胞は、その後（合計で10のプール、3回の反復実験を行い、それぞれ、合計で30皿用）、shRNAのサブプールを追加。次に、治療成分/試薬（私たちの場合は、TRAILおよびPAで扱うそれぞれclitaxel、）。その後、フラスコ内で生存細胞を再シードし、拡大することが可能。収穫は、異種の各サブプールからの細胞の人口およびゲノムDNAを分離する。
B.ポリクローナルデコンボリューションは。shRNAを挿入物を含むDNAを増幅するPCRを実施する。テンプレートgDNAをもポリクローナル頃からPCR産物のサイズは均一ですが、シーケンス中のポリクローナルです。 PCR産物をベクターにクローニングし、有能な細菌に変換されます。
shRNAのターゲットのC.同定個々のコロニーを単離しているとプラスミドDNAが抽出される。各クローンは、一人の個人のPCR断片とクローニングベクターが含まれています。プラスミドDNAを挿入し、配列の存在を確認するために消化される。 shRNAのインサートはLentiPlex shRNA配列検索データベースを使用して識別されます。
図2。できる識別didate遺伝子。25の候補遺伝子は、複数のヒットがあったことを同定した。 225の候補遺伝子は1つだけヒットしていたし、追求されませんでした。候補遺伝子ごとに個々のクローンの内訳については補足表1を参照してください。
補足表1。ポリクローナルシーケンシング遺伝子IDから識別される個々のTRCライブラリのクローンが検出されたクローンをヒット。
Discussion
本研究では、我々は、パクリタキセル/ TRAIL治療後のA549細胞の細胞毒性に関与する遺伝子を同定するゲノムワイド画面を提示する。ゲノムワイドな画面で、プールされたアプローチの使用は、通常、従来のアレイの画面に関連付けられている時間、コスト、および設備投資を削減。画面の成功に不可欠事前に実行される最適化の実験です。伝達条件とMOIを経験的に決定する必要があります。
選択方法は、所望の表現型（例えば、生存、表面のタンパク質発現、等）を提示する細胞の堅牢な選択を許可する必要があります。これらのパラメータの最適化は、検出された偽陽性の数が削減されます。
ここでは、ゲノムDNAは、選択された細胞の大部分母集団から収穫した後、TOPOは、個々のshRNAが挿入を識別するために、クローニングした。この実験のための一つの可能な改善が確実にFACSを用いて生細胞のために選択するだけだ唯一生きている細胞を回収すること。特定されたターゲットは、スクリーニングアッセイでターゲット固有のshRNAの持つ伝達によって検証されます。真のヒットは、井戸の大多数の表現型が表示されます。
LentiPlexプールされたライブラリは、そのアプリケーションに柔軟性があります。それは、下流のアプリケーションの広範な互換性があり、正または負のどちらか選択の戦略で使用することができます。スクリーニングの条件に応じて、shRNAを挿入のデコンボリューションは、PCR /クローニング、マイクロアレイ、または次世代シーケンシング9、10を介して達成される。RNAiスクリーニングをdeconvoluteにこれらの技術のパワーとスピードが十分に確立されている間、マイクロアレイでの関心事と次世代シーケンシングの方法は、バイオインフォマティクスのリソースや知識を正しく分析し、実験結果を解釈するために必要なの可用性です。これらの技術に関連する費用は、しばしば、ゲノムワイド画面の事業への障壁になることができます。 APCR /クローニングベースのアプローチ、マイクロアレイや次世代シーケンシングほどは強力で効果的かつ低コストの代替手段です。
アジレントはLentiPlex画面のさらなる支援にTRC shRNAのライブラリに基づいてカスタムアレイを提供しています。これらのオプションは、研究者が細胞機能の多様な範囲を勉強するLentiPlexを使用することができます。
Disclosures
マシューJ. Coussens、コートニーコーマン、アシュリーL.フィッシャー、ジャックサゴ、そしてジョンスウォーザウトは、この記事で使用するツールや試薬を作るSigma - Aldrich社、によって雇用されている。
Acknowledgments
MISSIONは、シグマアルドリッチバイオテクノロジーLPの登録商標です。
LentiPlexは、シグマアルドリッチバイオテクノロジーLPの商標です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LentiPlex Pooled Array |  Sigma-Aldrich |
SHPH01 | |
| A549 Cells | ATCC | CCL-185 | |
| TRAIL | Sigma-Aldrich |
T5694 | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich |
T7402 | |
| Topo TA Cloning Kit | Invitrogen | K4575-01 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich |
P2893 | |
| GenElute Plasmid Miniprep kit | Sigma-Aldrich |
PLN70 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich |
H9268 |
References
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