Summary
我々は、マイコバクテリアの列挙に別のアプローチを説明します
Abstract
機能アッセイは、長い間、特定のワクチンの免疫原性を測定する際に重要な役割を果たしてきました。これは、従来、血清殺菌力価として表されます。幼年期のワクチンへの応答における血清殺菌力価の研究は、防御免疫応答と、カットオフのためにカットオフレベルを開発し、検証するために私たちを有効にしているルーチンを使用しています。そのようなアッセイは、このような結核ワクチンなどのエフェクターT細胞応答の形で主に細胞性免疫を誘導するワクチンのルーチン評価に前方に取られている。動物モデルでは、与えられたワクチン候補のパフォーマンスは、日常的に標準化された殺菌アッセイで評価され、現在のすべての小説TB -ワクチン候補は、1人間の臨床試験を段階的に廃止する前に、彼らの評価では、この工程に供されています。免疫原性とそのため新規抗結核ワクチンの予防効果の可能性の評価は、理想的に殺菌アッセイで測定を含む、現在は人間のモデルに類似した段階的な評価を受けるべきである。
結核ワクチン研究の文脈における殺菌アッセイは、既によく、それらが潜在的に有望なワクチン候補をスクリーニングするために適用される動物モデル、年に設立されています。免疫原性の読み出しメインとして様々な臓器の機能の細菌負荷の低減。しかし、そのようなアッセイは、これまでの新規抗結核ワクチンの臨床試験に組み込まれていません。
ヒトマクロファージ内部のマイコバクテリアの死滅につながる正確なメカニズムについての不確実性が依然としてあるものの、抗酸菌とマクロファージとT細胞の相互作用が明らかに必要です。このホワイトペーパーに記載のアッセイは、それらの相対的な個々の貢献についての仮定を行うことなく、全血中に存在するすべての他の細胞性および体液性因子とそのような重要な細胞成分の研究を可能にする殺菌アッセイの小説世代を表します。私たちのグループによって記述されるアッセイは、全血の少量を使用し、既に結核流行の設定で、大人と子供の研究で用いられている。我々は、BCGワクチンの免疫原性を示すHIV陽性患者におけるマイコバクテリアの成長だけでなく、in vitroでの抗酸菌の生存に対する抗レトロウイルス療法とビタミンDの効果を増加している。ここでは、方法論を要約し、そしてこの比較的単純な、低コストとフィールドフレンドリーなモデルを使用して、私たちの再現性のデータを提示する。
注：定義/略語
BCG ルクス = M.ウシ型 BCG、モントリオールの株は、抗酸菌のGroEL（HSP60）のプロモーターの制御下で、 ビブリオharveyiからluxAB遺伝子を有するシャトルプラスミドpSMT1で形質転換。
CFU =コロニー形成単位（マイコバクテリア生存率の測定）。
Protocol
1。 BCG ルクスレポーターマイコバクテリア株の調製
- BCGを育てるルクスミドル7H9ブロス0.2％グリセロール、0.05％ツイーン80および10％のADCの濃縮を含むで中期対数期に200rpmで振盪しながら（シャトルプラスミドpSMT1で形質転換されたM.ボビス BCGモントリオール株）。
- 重複のルミノメーターチューブに滅菌PBSでBCG ルクス文化（900μlPBS +100μlのBCG ルクス文化）の1:10希釈液1mlの準備。
- マシンの後ろにN -デシルアルデヒド（ルシフェラーゼ酵素の基質）を含むチューブをロードして蓋を所定位置に固定し、チューブをされていることを確認します。
- ルミノメーターに配置された3空のプライミング管のそれぞれに100 UCL × 3を注入するように設定プライムプログラム、を介して基板との内閣総理ルミノメーターインジェクタ。
- ルミノメーターに2チューブをロードし、各チューブに基質の100 UCLを注入することで設定されたプログラムを介して測定値を取ると1秒間隔で20秒間お読みください。
- 株価が1 × 10 8 RLU / mlに2 × 10 8 RLU / mlを（これは成長の3〜4日ほどかかります）に達したときは、50ミリリットルファルコンチューブに培養液に滅菌30％グリセロールを等量を加え、穏やかに混合する。
- -80℃でラベルの付いた2ミリリットルのスクリューキャップ付きマイクロチューブや店舗℃に分注し1.5ミリリットルボリュームを
2。アリコートの株式RLU / CFU相関と内容の決定
- ベントキャップと200ミリリットルの三角フラスコ〜10％のADCサプリメントでミドル7H9培養液の15ミリリットルを追加。
- 20％のTweenのハイグロマイシンおよび30μlのの15μlを追加。
- 安全キャビネット内の室温（RT）での冷凍庫と除霜からBCG ルクスのバイアルを取り外します。培地にバイアルの内容を追加し、キャップを締めます。
- 4日間、37℃で200rpmで振盪しながらインキュベートする。
- それぞれの日に、CFU決定のためにシリアル10倍希釈して（1:10、1:100、1:1000、1:10,000及び1:100,000）を構成します。
- 並行して同一の希釈を設定し、（ 一部1.2から1.6を参照 ）発光を判断するために複製。
- ミドル7H11寒天（0.5％グリセロール、10％OADCサプリメント、20％のTweenおよびハイグロマイシンを1 ml 1 mlを含有する液体培地1リットル）の2つの3コンパートメントプレートを準備します。
- 個々の室に均等に液体を分配する別のスプレッダーを用いて各プレートのセグメント上に各希釈液100μl、外板。
- 各パラフィルムでプレート、滅菌したプラスチック製の袋に入れて、オートクレーブテープでシールをシールし、下向きにふたで2週間、37℃でインキュベートする。
- 外装フィルムは、（2-3週間）表示されるまで定期的に検査する。
- コロニーをカウントするには、インキュベーターとコロニーカウンター上の場所からプレートを取り外します。重複したプレートから各希釈液の平均値を計算する。
- 各希釈に相当するRLUとCFUカウントを使用してRLU / CFU比を計算する。比は3と5 RLU / CFUの間でなければなりません。
3。全血への接種のためのBCG ルクス文化の調製
- ベントキャップと200ミリリットルの三角フラスコ〜10％のADCサプリメントでミドル7H9培養液の15ミリリットルを追加。
- 20％のTweenのハイグロマイシンおよび30μlのの15μlを追加。
- 安全キャビネット内で室温で冷凍庫、デフロストからBCG ルクスのバイアルを取り外します。培地にバイアルの内容を追加し、キャップを締めます。
- 2〜4日、37℃で200rpmで振盪しながらインキュベートする。
- 重複のルミノメーターチューブに滅菌PBSでBCG ルクス文化（900μlPBS +100μlのBCG ルクス文化）の1:10希釈液1mlの準備。
- 首相優しく渦基板とのルミノメーター（上述）、ルミノメーターに2チューブと負荷と測定値を（上記のように）取る。
- 7 × 10 6 RLUと同等のものを（これはの単球数を想定し、約1:1の単球に2 × 10約5 CFU / mlの血液とBCGの比の接種材料を与える与えるためにPBSで文化を希釈するために、この測定値を使用血液1ml当たり4 × 10 5〜2 × 10約5球）。
4。全血の調製
- 防腐剤フリーのヘパリンを含むチューブに静脈血5mlのに3を取る。
- 50ミリリットルファルコンチューブに血液を移し、グルタミンおよび25mMのHEPES（ 無ペン/連鎖球菌）を含むRPMI 1640の等量で希釈する。
- 。0hrs 3と96hrs 3必要に応じて、追加のタイムポイントのために追加のチューブを設定：。たびにポイントの滅菌ビジューチューブ（合計で6本に三連で希釈した血液のアリコートを900μl
- の10％ADCサプリメント+50μg/mlハイグロマイシン（BCG ルクス文化に使用したのと同じ培地）とミドルブルックス7H9培地のアリコート900μlの成長のコントロールのために複製。
- 血液の各チューブに希釈BCG ルクス 100μlのを追加し、2成長制御にチューブ。
- よく混和して、37℃で96時間の時間ポイントとロッキングインキュベーターで彼らの側に2成長コントロールのための3 bijousを配置° C、20回転/分（CO 2は必須ではありません）。
5。測定ルミネッセンス（0hrと96hrsで）
- 10分間2000グラムで3 bijousを遠心分離します。
- 注意深く-80フリーズする2ミリリットルのスクリューキャップ付きマイクロチューブにペレットと場所を乱すことなく清の300μl除去° C、その後のサイトカインの分析のため。
- 削除された上清の量を交換する各宝石にPBSの300μlを追加。
- 対応する50ミリリットルファルコンチューブにそれぞれ宝石の内容を吸引し、各試験管に8ミリリットルの蒸留水を加えます。 10分のタイマーを開始します。
NB：これは時間に敏感なステップであり、このインキュベーションは、細胞が最初に水と接触したときから始まり、10分よりも長くてはならない。 - 対応するファルコンチューブに転倒する前に5秒のための蒸留水と渦の2ミリリットルでそれぞれ宝石をすすいでください。
- 10分間のインキュベーションの終わりに、10分間2000グラムで、ファルコンチューブを遠心してください。
- Surfaniosの消毒剤にデカントで上澄み。
- 各ペレットとボルテックスにいくつかのガラスビーズを追加。
- 各チューブとボルテックスに滅菌PBSを1mlを追加。
- ルミノメーター用チューブで、（900μlPBS +100μlのサンプル）をPBSで二重にし、時間ポイント96時間で各サンプルの1:10希釈を行います。成長のコントロールのそれぞれに対して同じ希釈を行う。
- ルミノメーターに静かにボルテックスチューブと負荷と測定値を（上記のように）取る
NB：同じサンプルのトリプリケート間に測定値が互いの15％以内でご使用ください。
6。代表的な結果：
代謝活性は、冷凍庫のまっすぐいずれかに該当する場合または固定相において最適であるとして全血ルクスアッセイのための対数増殖期の細菌を使用することが重要である、すなわち、前にサンプルを接種して48〜72時間にわたって成長。前の成長は変動を避けるために、48時間または72時間のどちらかに一連の実験のための標準化されるべきである。図1は、BCG ルクスの代表的な文化の成長曲線を示しています。定常期に達するまで、倍加時間は約24時間です。
図1。7H9培地とRLUとCFUの相関関係で96時間以上BCG ルクスの代表的な成長曲線。
RLU値は常にCFUと相関するが、単一のCFUに対応するRLUの数は、感染の一貫性のある多重度を保証するために一連の実験を通じて同一の凍結ストックを使用することをお勧めしますそれはなぜである株式、によって変わる場合があります（ MOI）。
表1は、接種の時間（T 0）と96時間で生の日付の例を示しています。成長率は、公式T 96 / T 0を用いて計算されますが、他の時間間隔は、勿論、測定することができます。重要な細胞死が発生するとそれは、、しかし、96時間を超えて文化を使用しないことをお勧めします。
表1。接種（T0）の時と96時間（T96）と3成人のドナーから計算された成長率で生データの例。
あるとHIV感染のない子供の血液中に図2で示したように利用可能な抗原特異的メモリーの応答と多分また好中球数に応じて、成長率は、個人によって異なります。平均して、若い子供たちはツベルクリン反応検査（TST）、成人よりも高い成長率を持っている+ veの個人は、TST - VEの個人よりも低い成長率を持っており、HIV感染患者は、CD4 T細胞集団の欠乏に起因する高い成長率を持っている抗酸菌に対する細胞性免疫応答の重要なメディエーターの一つ。
図2間ドナーの変動性：基本的なHIV感染の状況に応じて患者を、一組のためのT 0に対する96時間の成長率。
一定期間における成長率の再現性は64のドナー12ヶ月の期間にわたって、単一ドナーの制御実験のために繰り返し出血から二回採血から結果をまとめたものを図3に示されています。変動の潜在的な原因は、多くのバイオアッセイで観察されたホストのサイトカインのレベルの範囲内でマイコバクテリア感作または変動性の変化である可能性があります。
図3。 12ヶ月で12の場面で（a）シングルドナー。12メートル以上に2回上に（B）複数（64）ドナーonths。
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Discussion
結核ワクチン研究の文脈における殺菌アッセイは、それらが潜在的に有望なワクチン候補をスクリーニングするために適用される動物モデル、年に設立されています。免疫原性の読み出しメインとして様々な臓器の機能の細菌負荷の低減。
人間の殺菌アッセイの第一世代はM.に感染し、単独でマクロファージを用いて設計され結核 。 CFUは、3週間の最小時間後に抗酸菌の生存の読み出しメインを務めた。これらのアッセイは、特定の時間ポイント1,2でPBMC、付着性単球/マクロファージおよび溶解の準備に依存していた。
マクロファージとMを含むようにT細胞間の複雑な相互作用の理解など、 結核が進化し、磁気ビーズを使用して、様々な細胞集団の分離が可能となった、これらのシステムは、アッセイに戻ってT細胞を追加し、CFU 3,4,5を測定することによって変更されました。これらのアッセイのいくつかは、ライブMを使用している結核が、M.と仕事の主な障害の1つ殺菌アッセイにおける結核は、封じ込め施設とCFUは、文化の3週間後にのみ可能であるという事実が必要です。さらに、PBMCを用いたアッセイでは、3週間かかる大きな血液の量と読み出しとしても、CFUに依存して、必要とする。
代謝活性に基づいて、より迅速なの読み出しを容易にするために、新しいアッセイを設計した。これらのアッセイでは、実行可能な抗酸菌と3つの異なるシステムを相互に関連付けるように代謝活性が測定されるバクテック/を経由してマイコバクテリア6月11日または放射検出システムをタグ付けウラシル混入4,5、レポーター遺伝子のいずれかを使用して過去10年間に設計されていますMDGITボトル7,8。
全血ルクスアッセイに成功TB -風土病の設定に転送され、子ども9,10で使用されている日付にのみアッセイである。さらに、他のアッセイは、時間の期間にわたって内ドナーの変動のデータを公表していない。
ルクスアッセイの制限は、その遺伝子組み換え生物への依存度と事前接種への文化生物のに必要です。しかし、生物の正確な定量化のために、それは比較可能性と再現性を助ける実験の各シリーズと各バッチ、のために感染の非常に正確な多重度を計算することが可能です。命令は、アッセイの実装を成功させるために不可欠である株式の良好な生存率を、達成するために株の準備のために密接に続いする必要があります。アッセイは、新鮮な血液で実施されているので、それは時間に敏感であり、フィールドでのサンプルの保管は不可能です。理想的には、血液が4時間以内に実験室に到達する必要があります。それは、必要な血液量をさらに低減するため、将来的に可能かもしれない、と私たちの研究室では現在これに取り組んでいます。
小さ なサンプルに低コストと適用性を考えると、それは新たな結核ワクチンの臨床試験、10または抗結核介入11にこの測定法を統合することが技術的に可能です。これは、マイコバクテリアから読み出さ免疫学的および分子生物学的手法（例えば、フローサイトメトリーとして、ELISPOTおよびマイクロアレイ）の配列を使用して、現在の慣行があるとして、ちょうどワクチンに対する宿主の応答をしない評価するために追加の機会を提供するだろうが、機能を追加する宿主 - 病原体相互作用に続く生存。これは、動物モデルや細胞性免疫応答に依存していない他の感染症の血清阻害に基づく殺菌アッセイを使用して、前臨床試験でワクチンの評価のための一般的な方法です。
それは、新規結核ワクチンにこのアプローチを適用するためにタイムリーです。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ウェルカムトラストからベアテKampmann（056608、GRO77273）への個人的な奨学金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCG lux | Various | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Biosciences | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC supplement | BD Biosciences | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 (20ml) | |
| N-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR international | 101077 | |
| Sterile PBS | In House | n/a | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Sterile distilled Water | In House | n/a | |
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold Technologies | ||
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning | 99445-12 | |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning | 2150329 | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD Biosciences | 367676 | |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD Biosciences | 352077 | |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR international | 99445-12 | |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| Glass beads 2mm diameter | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| 10ml pipettes and pipette boy | Any Supplier | ||
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | Any Supplier | ||
| Class II safety cabinet cabinet | |||
| Refrigerator (4°C) | |||
| Centrifuge | |||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | |||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |
References
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