Summary
我们描述了一个替代的方法来列举分枝杆菌
Abstract
功能测定早已起到了关键作用的一个给定的疫苗的免疫原性的测量。这是常规表现为血清杀菌滴度。儿童疫苗的血清杀菌滴度的研究使我们能够开发和验证切断保护性免疫反应的水平和削减权衡，在日常使用。没有这样的检测已采取迈进的诱导主要是细胞免疫效应T细胞反应的形式，如结核病疫苗，疫苗的例行评估。表现一个给定的候选疫苗在动物模型，定期评估标准化杀菌检测，目前所有的新型结核病疫苗候选人受到这一步在他们的评价，第1阶段的人体试验之前。理想的免疫原性，因此，新型抗结核病疫苗的保护效力的可能性的评估应在人体模型进行类似的分步进行的评价，现在，包括杀菌实验的测量。
杀菌检测在结核病疫苗研究方面已经建立的动物模型，它们应用到屏幕上可能有前途的候选疫苗。作为主要的免疫原性读出各个器官功能的细菌负荷减少。然而，没有这样的检测已被纳入临床试验新型抗结核病疫苗的最新。
虽然仍存在不确定性的确切机制，导致人类巨噬细胞内结核分枝杆菌杀，分枝杆菌与巨噬细胞和T细胞的相互作用是明确要求。本文中所描述的实验代表的新型杀菌检测等关键的细胞成分的研究，使全血中目前没有作出有关其相对独立的贡献的假设与所有其他细胞和体液因素。本集团所描述的检测使用全血的小卷，并已受聘在成人和儿童的研究结核病流行的设置。我们已经表明BCG疫苗的免疫原性，增加分枝杆菌的增长，在HIV阳性患者，以及抗逆转录病毒疗法和维生素 D分枝杆菌在体外生存的影响。在这里，我们总结的方法，目前我们的重复性数据，使用这个相对简单，低成本和友好的领域模型。
注：定义/缩写
卡介苗勒克斯= M 牛卡介苗，蒙特利尔应变，转化与穿梭质粒进行哈维氏弧菌的luxAB基因pSMT1，分枝杆菌GroEL的（HSP60）启动子的控制下。
CFU =集落形成单位（结核分枝杆菌的可行性措施）。
Protocol
1。卡介苗勒克斯记者分枝杆菌股票的制备
- 成长卡介苗LUX（牛分枝杆菌卡介苗蒙特利尔应变穿梭质粒pSMT1的转化）用颤 抖的Middlebrook 7H9肉汤含0.2％甘油，0.05％Tween 80和10％的ADC浓缩在200rpm中旬对数生长期。
- 在光度计试管一式两份（900μlPBS +100μL卡介苗勒克斯文化），准备在无菌PBS 1:10稀释的卡介苗勒克斯文化1毫升。
- 装入管中的N -癸醛（荧光素酶底物）到本机的背面，并确保盖子担保和管到位。
- 总理通过基板的黄金节目，注入100 UCL × 3每3个空吸管放在光度计，光度计喷油。
- 装入2管光度计和采取的程序，在每个管注入100 UCL基板的读数，并在1秒的间隔为20秒读。
- 当股价已达到1 × 10 8 RLU /毫升，以2X10 8 RLU /毫升（约3-4天的生长需要），加等体积的无菌30％甘油在50毫升猎鹰管文化，轻轻混匀。
- 1.5毫升卷分装成标记的螺丝帽2毫升微管和储存在-80 ° C。
2。确定股票RLU / CFU相关等分内容
- Middlebrook 7H9培养基添加10％的ADC补充一个发泄的第一个200毫升锥形瓶中15毫升。
- 潮霉素和20％吐温30μl加入15μl。
- 在安全内阁在室温（RT）的冷冻和解冻取出一小瓶卡介苗勒克斯 。小瓶的内容添加到中等，并拧紧瓶盖。
- 孵育晃动在200rpm在37 ° 4天。
- 在每一天，弥补了串行的10倍稀释（1:10，1:100，1:1000，1:10,000和1:100 000）CFU决心。
- 在平行设置的相同的稀释和重复，以确定发光（1.2-1.6） 。
- 准备Middlebrook 7H11琼脂（1升含0.5％甘油，10％OADC补充，20％吐温潮霉素和1毫升1毫升的液体介质）的两个3车厢板。
- 盘开出100μL每个稀释到每个板，使用单独的传播者段，同样分布在个别室的液体，。
- 用封口膜密封每个板块，在无菌塑料袋的地方，与反应釜胶带密封，并在37 ° 2周，眼皮朝下彗星。
- 定期检查，直到CFUs出现（2-3周）。
- 要计数的殖民地，从孵化器和地方上的菌落计数器删除板块。计算平均每个稀释重复板。
- 使用相当于每个稀释度RLU和CFU计数计算RLU / CFU的比例。的比例应为3至5 RLU / CFU。
3。 勒克斯文化卡介苗接种到全血制备
- Middlebrook 7H9培养基添加10％的ADC补充一个发泄的第一个200毫升锥形瓶中15毫升。
- 潮霉素和20％吐温30μl加入15μl。
- 在安全内阁在室温下冷冻和解冻取出一小瓶卡介苗勒克斯 。小瓶的内容添加到中等，并拧紧瓶盖。
- 孵育晃动在200rpm在37 ° 2到4天的彗星。
- 在光度计试管一式两份（900μlPBS +100μL卡介苗勒克斯文化），准备在无菌PBS 1:10稀释的卡介苗勒克斯文化1毫升。
- 与基总理光度计（如上所述），轻轻涡管到光度计负载，并采取读数（如上所述）。
- 使用此读来稀释在PBS的文化，给予相当于 7x10 6 RLU（这将使约2 × 10 5 CFU / ml的血液和卡介苗的比例约为1:1的单核细胞接种，假设一个单核细胞计数的约2 × 10 5 4 × 5单核细胞每毫升血液）。
4。全血制备
- 取35毫升静脉血液中含不含防腐剂肝素管。
- 血液转移至50ml猎鹰管和平等的含有量的谷氨酰胺和25mm HEPES（没有笔/链球菌）的RPMI 1640稀释。
- 分装到每个时间点的不育茹管（共6管为0hrs：3和3为96小时，额外的时间点设置额外的管，如果有必要的900μl稀释血液，一式三份。
- 分装900μl10％的ADC补充+50μg/ml潮霉素（在同一介质中，用于文化卡介苗勒克斯）Middlebrooks 7H9培养基生长控制的重复。
- 添加稀释卡介苗勒克斯 100μL每管血，2增长控制管。
- 搅拌均匀，放置96小时的时间点和2生长控制方在摇摆孵化器在37 3 bijous ° C，20转/分（CO 2的不需要） 。
5。测量发光（0hr和96小时）
- 在2000克离心10分钟3 bijous。
- 小心地取出，而不会干扰2毫升螺丝帽微管沉淀和冻结在-80300μL上清℃，随后的细胞因子分析。
- 加入300μL的PBS每个茹，以取代删除上清量。
- 成相应的50毫升猎鹰管吸每个茹的内容，并添加8毫升蒸馏水，以每管。开始了10分钟的计时器。
注：这是一个时间敏感的一步，这个孵化不能有任何超过10分钟，从开始时，细胞首先接触到水 。 - 冲洗，蒸馏水和5秒的旋涡2毫升相应的猎鹰管引爆之前，每个茹。
- 在结束了10分钟的孵育，离心2000克猎鹰管10分钟。
- 倒出上清液进入Surfanios消毒剂。
- 添加一些玻璃珠，每个颗粒和涡。
- 添加无菌PBS 1ml到每个管和涡。
- 在光度计管中，每个样品一式两份，用PBS（900μlPBS +100μL样品），并在96小时的时间点1:10稀释。每个生长控制的相同稀释。
- 轻轻涡管和负载到的光度计，并采取读数（如上面所述）
注：同一样品一式三份的读数应在彼此的15 ％。
6。代表性的成果：
重要的是要使用全血勒克斯检测的增长对数生长期的细菌，即接种样品前增长超过48-72小时，代谢活动是最理想的，如果任直出的冰柜或固定相。前增长应为48或72小时的实验系列，以避免变异标准化。图1显示了一个代表性的文化卡介苗勒克斯的生长曲线。倍增时间约24小时，直到达到固定相。
图1。代表BCG的生长曲线勒克司超过96小时7H9培养基和相关RLU和CFU 。
虽然RLU值总是与CFU关联，可以改变单一的CFU数量相应的RLU取决于股票，这就是为什么它是很好的做法，整个一系列的实验中使用相同的冻结的股票，以保证一个一致的多重感染（ MOI）。
表1显示了一个原始日期的接种时间（T 0），并在96小时的例子。增长比率计算公式T 96 / T 0，但其他的间隔时间，当然也可以测量。它是，但是，最好不要使用超过96小时的文化，如发生显着的细胞死亡。
表1的接种时间（T0），并在96小时（T96）和3个成人捐助者计算增长比率的原始数据的例子。
根据现有的抗原特异性记忆反应和中性粒细胞计数也可能，增长比率因人而异如图所示，在图2与儿童的血液中，这里没有感染艾滋病毒。平均，幼儿比成年人有较大幅度的增长比率，结核菌素皮肤试验（TST）+已经个人有较低的增长比率比尖沙咀- VE个人，和艾滋病毒感染者由于缺乏症的CD4 T细胞人口的高增长比率，分枝杆菌的细胞免疫反应的关键调解人之一。
图2捐助者间的变异 ：增长的比率为一组患者的T 0与96小时，取决于底层的艾滋病毒状况。
过了一段时间的增长比率的可重复性是在图3所示，它总结了64流血超过12个月内，从一个单一的捐助者为对照实验，反复流血的两次捐助者的结果。变异的潜在原因可能是，在分枝杆菌致敏或在宿主细胞因子水平的变化的变化，许多生物测定。
图3。 （a）单一捐助12次超过12个月。（二）多（64）2次捐助者超过12米onths。
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Discussion
在结核病疫苗研究中的杀菌检测以及建立动物模型，它们应用到屏幕上可能有前途的候选疫苗。作为主要的免疫原性读出各个器官功能的细菌负荷减少。
人类杀菌实验的第一代设计单独使用巨噬细胞，感染与 M. 结核病 。 CFU担任分枝杆菌生存的主要读出后最短的时间为3周。依靠这些检测外周血单个核细胞，贴壁的单核细胞/巨噬细胞和裂解准备在特定时间点 1,2 。
作为我们理解更复杂的巨噬细胞和T细胞包含M.之间的相互作用肺结核的演变，现在可以和各种细胞的人口使用磁珠分离，这些系统进行了修改，增加T细胞的检测和测量CFU 3,4,5。这些实验的一些生活 M. 肺结核 ，但与M.工作的主要障碍之一杀菌检测结核病的防护设施和事实，CFU后，才3周文化的需要。此外，外周血单个核细胞为基础的实验需要大量的血液，仍然依靠对CFU读出，这需要3个星期。
为了方便更快速的读出，代谢活动的基础上，新的分析方法进行了设计。在这些实验中，代谢活性测定作为一种可行的结核分枝杆菌三种不同的系统关联设计已经在过去的10年使用或者尿嘧啶掺入 4,5，记者基因标记 6-11分枝杆菌或通过BACTEC辐射检测系统/ MDGIT瓶7,8。
全血勒克斯检测是唯一的检测迄今为止，已成功地转移到结核病流行的设置和使用儿童9,10。此外，没有其他的检测已经出版了一段时间内捐助变异的数据。
勒克斯检测的限制，是对转基因生物体的的依赖和文化生物体之前接种的需要。然而，由于生物体的确切量化，它是可以计算出每个一系列的实验和每个批次，其中艾滋病的可比性和重复性的一个非常准确的多重感染。说明需要遵循的菌株，达到良好的生存能力股票，这是实验的成功实施是必不可少的准备密切。由于新鲜血液进行检测，这是对时间敏感的，并存储在该领域的样本是不可能的。在理想的情况下，血液，需要4小时内到达实验室。在未来有可能进一步减少所需的血量，和我们实验室目前这方面的工作。
由于成本低，适用于小样本，在技术上是可行的融入这个实验临床试验的新型结核病疫苗的10或 11抗结核干预。这将提供更多的机会来评估不仅仅是宿主反应的疫苗，是现行做法，采用免疫学和分子生物学技术（如流式细胞仪，酶联免疫斑点法和微阵列）阵列，但添加功能读出分枝杆菌以下宿主 - 病原体相互作用的生存。这是常见的做法，在临床前研究的动物模型或通过使用基于血清抑制其他不依赖细胞免疫反应的感染的杀菌检测的疫苗评估。
这是及时应用此方法，以新的结核病疫苗的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由个人从威康信托Beate Kampmann（056608，GRO77273）的奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCG lux | Various | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Biosciences | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 | |
| Middlebrook OADC supplement | BD Biosciences | 212240 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | 274364 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 (20ml) | |
| N-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR international | 101077 | |
| Sterile PBS | In House | n/a | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Sterile distilled Water | In House | n/a | |
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold Technologies | ||
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning | 99445-12 | |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning | 2150329 | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD Biosciences | 367676 | |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD Biosciences | 352077 | |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR international | 99445-12 | |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C | |
| Glass beads 2mm diameter | Sigma-Aldrich | Z143928 | |
| 10ml pipettes and pipette boy | Any Supplier | ||
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | Any Supplier | ||
| Class II safety cabinet cabinet | |||
| Refrigerator (4°C) | |||
| Centrifuge | |||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | |||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures |
References
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