Summary
मात्रात्मक ग्रोथ फैक्टर (TGF) β प्रेरित 3 आयामी कोलेजन जैल में आक्रमण बदलने को मापने के लिए एक परख वर्णित है. यह परख सेल लाइनों के MCF10A श्रृंखला है, जो स्तन कैंसर के विकास के विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं का लाभ लेता है. इस विधि के अन्य सेल लाइनों के साथ इस्तेमाल किया जा और अन्य संभावित activators या आक्रमण की inhibitors की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अपनाया जा सकता है.
Protocol
1. Methocel समाधान तैयार करना (500 एमएल)
- आटोक्लेव एक 500 मिलीलीटर एक चुंबकीय उत्तेजक युक्त बोतल में 6 methylcellulose के जी.
- सीरम (60 ° सी) के बिना 20 मिनट के लिए preheated DMEM/F12 की 250 मिलीलीटर में methylcellulose भंग.
- DMEM/F12 (आरटी) 10% घोड़े सीरम युक्त के 250 मिलीलीटर जोड़ें. मिक्स रातोंरात (4 डिग्री सेल्सियस).
- Centrifugation (5000g, 2, 4 ° C) के द्वारा हल रिक्त करें.
- स्पष्ट एक नया ट्यूब (स्टॉक समाधान के बारे में 90-95%) अत्यधिक चिपचिपा समाधान लो.
- 4 में स्टोर ° उपयोग करें जब तक सी.
2. उपगोल संस्कृति
- एक 20% methocel समाधान (10 मिलीलीटर methocel और 40 मिलीलीटर मध्यम विकास) तैयार है.
- कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धो, 37 में 0.1% trypsin और सेते कोशिकाओं जोड़ने डिग्री सेल्सियस
- Resuspend मध्यम विकास में कोशिकाओं और कोशिकाओं गिनती.
- 20% methocel में 10 मिलीलीटर प्रति 000 कोशिकाओं के निलंबन की तैयारी.
- 96 अच्छी तरह गोल नीचे सेल निलंबन जोड़ेंuspension प्लेटें (अच्छी तरह से 100 प्रति μl).
- अगले दिन, निलंबन प्लेटों में उपगोल गठन की जाँच करें. Spheroids 1-3 दिनों के बाद उपयोग के लिए तैयार हो जाएगा.
3. कोलेजन की तैयारी
- बर्फ पर 8 मिलीलीटर कोलेजन, 1 मिलीलीटर 10x Pbs, 1 मिलीलीटर 0.1 एन NaOH और 3 0.1 बूँदें एन एचसीएल के समाधान तैयार. यदि पीएच 7.4 पीएच सूचक स्ट्रिप्स पर समाधान के कुछ खोलना है. रेंज के बाहर यदि पीएच को समायोजित करें.
- एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में निष्प्रभावी कोलेजन समाधान के 50 μl जोड़ें
- 37 में सेते डिग्री सेल्सियस जब तक कोलेजन (90 मिनट) जम जाता है.
- कोलेजन समाधान के प्रत्येक ligand विंदुक भाग 1 के लिए: बर्फ पर methocel - कोलेजन ligand समाधान तैयार करें. TGF-बीटा कोलेजन के 20 एनजी प्रति मिलीलीटर जोड़ें. Methocel और विभिन्न परतों पर प्रसार के साथ कमजोर पड़ने के बाद, TGF-बीटा के अंतिम एकाग्रता 5 एनजी / vortexing द्वारा मिलीलीटर मिक्स हो जाएगा. Methocel समाधान के भाग 1 जोड़ें. Vortexing द्वारा मिक्स.
4. उपगोल एम्बेडझंकार
- एक 200 μl टिप जो टिप काट के लगभग 5 मिमी, एक 200 μl विंदुक पर रखें. विंदुक के साथ एक उपगोल चूसो और ध्यान से एक खाली प्लेट में मध्यम बग़ैर. देखो अगर उपगोल टिप के अंदर रहता है. उपगोल एक सफेद डॉट के रूप में दिखाई देता है. सवार जारी करने के बिना, 100 μl कोलेजन methocel मिश्रण चूसना और एक 96 अच्छी तरह से कोलेजन - लेपित में कोलेजन मिश्रण में उपगोल बग़ैर. हर हालत के लिए 12 spheroids के लिए यह मत करो.
- कोलेजन 37 पर कम से कम 30 मिनट जमना ° सी
- एक 200 μl टिप के साथ हवाई बुलबुले निकालें.
- 1.6% सीरम और DMSO में भंग inhibitors के साथ मध्यम के 50 μl जोड़ें. एस.बी. - 431,542 के लिए स्टॉक समाधान के 4 μl (10 मिमी) मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें. प्रसार के बाद, अवरोध करनेवाला के अंतिम एकाग्रता 10 सुक्ष्ममापी किया जाएगा. TGF-β और inhibitors के प्रयोग के पाठ्यक्रम रह जाएगा. 40x बढ़ाई का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे spheroids की तस्वीरें ले लो.
- 4 के बादTGF-बीटा और / या inhibitors के साथ उत्तेजना के 8h, 40x बढ़ाई का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे spheroids की तस्वीरें ले.
- 2 दिनों के बाद हमलावर spheroids के क्षेत्र उपाय और क्षेत्र शुरू घटाना. मापने के क्षेत्र एक उपगोल: Adobe Photoshop विस्तारित (2A आंकड़ा) में उपगोल से मुक्त चित्र और त्वरित चयन उपकरण (आंकड़ा 2B) का चयन करें. 'प्लस' (+) चिह्न (आंकड़ा 2C) के साथ माउस सूचक एक चक्र में परिवर्तन. जबकि उपगोल अधिक कर्सर को खींच, Photoshop उपगोल की सीमाओं को पहचान लेंगे. उपकरण पट्टी में चिह्न (-) यदि उपगोल बाहर एक क्षेत्र का चयन किया गया है, इस क्षेत्र Alt कुंजी दबाकर या नकारात्मक चयन उपकरण है जो एक संकेत है का उपयोग करके चयन से बाहर रखा जा सकता है. (-) एक 'शून्य' के साथ एक सर्कल में कर्सर परिवर्तन हस्ताक्षर और गलत तरीके से चयनित क्षेत्र पर कर्सर को खींचकर, इस क्षेत्र (आंकड़ा 2D) चयन से निकाल दिया जाता है. यदि आवश्यक हो, कई क्षेत्रों श्री दबाने से चयनित किया जा सकता है हैIFT बटन. अधिक सही काम करने के लिए, माउस सूचक का आकार उपकरण पट्टी में ब्रश व्यास (आंकड़ा 2 ई) को बदलने के द्वारा समायोजित किया जा सकता है. जब पूरे उपगोल चयनित है, तो मेनू पट्टी में विश्लेषण के उपायः के माध्यम से या Ctrl + Shift + M (आंकड़ा 2 एफ) दबाकर चयन के क्षेत्र की गणना की जाती है. माप रिकॉर्डिंग विंडो में फ़ाइल नाम और पिक्सेल में चयन के क्षेत्र के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य डेटा (आंकड़ा 2G) दिखा दिखाई देगा. यदि एकाधिक चयन मापा जाता है, पहली पंक्ति के सभी क्षेत्रों की राशि से पता चलता है. व्यक्तिगत चयन के माप नीचे लाइनों में प्रस्तुत कर रहे हैं. सभी मापन की एक पाठ फ़ाइल में डेटा निर्यात किया जा सकता है और Excel में खोला गया.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
MCF10A1 (एम 1) सामान्य स्तन उपकला कोशिकाओं के साथ उपगोल परख का एक उदाहरण, एच रास MCF10AneoT कोशिकाओं (M2) बदल और M2 व्युत्पन्न MCF10CA1a (M4) चित्रा 3 में दी गई है. M1 कोशिकाओं के बिना ही कमजोर आक्रमण दिखायाउत्तेजना, लेकिन TGF-बीटा द्वारा उत्तेजना पर काफी आक्रमण बेहतर है. इसके विपरीत, M1 - व्युत्पन्न रास तब्दील M2 पहले से ही उत्तेजनाओं के अलावा बिना कुशलतापूर्वक पर आक्रमण किया, और यह आगे TGF-बीटा उपचार पर 4-5 गुना वृद्धि हुई. M4 कोशिकाओं दोनों के साथ और TGF-बीटा अलावा बिना मजबूत आक्रमण दिखाया.
अगला, हम जांच की है कि क्या हम इस उपगोल रासायनिक inhibitors का उपयोग मॉडल में TGF-β प्रेरित आक्रमण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है. इस प्रयोजन के लिए हम 431,542 एस.बी., एक एटीपी एनालॉग और TβRI kinase गतिविधि के चयनात्मक अवरोध करनेवाला, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से activin प्रकार आईबी (ActRIB) रिसेप्टर और activin 7 12 kinase तरह रिसेप्टर (ALK) का इस्तेमाल किया. जैसी कि उम्मीद थी, एस.बी. ४,३१,५४२ potently M1 के आक्रमण TGF-β प्रेरित, M2 और M4 (चित्र 4) कोशिकाओं, कि TGF-β प्रेरित आक्रमण का संकेत TβRI-kinase निर्भर है हिचकते हैं. इसके अलावा, बेसल spheroids के आक्रमण भी दृढ़ता से हिचकते था, कि बेसल आक्रमण सुझाव डे भी हैTGF-बीटा पर लटकता हुआ.
चित्रा 1. 3D उपगोल परख के फ्लो चार्ट. सबसे पहले, कोशिकाओं U-आकार का निलंबन प्लेटों में गैर पक्षपाती शर्तों के तहत चढ़ाया जाता है. कक्ष multcellular spheroids में aggregrate और एक मैट्रिक्स कोलेजन में एम्बेड किया जा सकता है. इस मैट्रिक्स कोलेजन में, वे आक्रमण कर रहे हैं.
चित्रा 2. Adobe Photoshop का उपयोग spheroids के क्षेत्र की मात्रा विस्तारित . (ए) उपगोल की तस्वीर एडोब फ़ोटोशॉप Extendend त्वरित चयन उपकरण के (बी) (सी) चयन उपगोल अधिक कर्सर खींचना एक wongly क्षेत्र का उपयोग शामिल की उपगोल हटाना (डी) के क्षेत्र का चयन करने के लिए खोला है त्वरित चयन उपकरण के ब्रश आकार के नकारात्मक त्वरित चयन उपकरण (ई) समायोजन करने के लिए और अधिक सही क्षेत्र का चयन करें (एफ) के चयनमाप आदेश (G) एक माप रिकॉर्ड के उदाहरण रिकॉर्ड.
चित्रा 3 TGF-β प्रेरित अनायास अमर MCF10A1 (एम 1) (ए) के spheroids के आक्रमण, रास तब्दील MCF10AneoT (M2 (बी) और अपने metastatic व्युत्पन्न (एम 4) MCF10CA1a (सी) M1. M2 और M4 spheroids एम्बेडेड 48h के लिए कोलेजन में TGF-बीटा के 5ng/ml के साथ इलाज किया गया के रूप में संकेत एसी प्रतिनिधि चित्रों एम्बेडिंग के दिन में लिया और दो दिन बाद डी सापेक्ष आक्रमण 2 दिन शून्य से 0 दिन पर क्षेत्र अंतर के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था परिणाम व्यक्त कर रहे हैं. के रूप में ± मतलब एसडी 13 से अनुकूलित.
चित्रा 4 बेसल और TGF-β प्रेरित उपगोल आक्रमण ख हिचकते हैंy एस.बी. 431,542. M1 M2 और M4 spheroids कोलेजन में एम्बेडेड रहे थे और 5ng/ml TGF-β और / या 10 सुक्ष्ममापी एस.बी. 431,542 के रूप में संकेत के साथ इलाज किया. प्रतिनिधि चित्रों 2 दिनों (ए) के बाद लिया. सापेक्ष आक्रमण 2 दिन शून्य से 0 दिन (बी) पर क्षेत्र अंतर के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था. परिणाम ± मतलब एसडी 13 से अनुकूलित के रूप में व्यक्त कर रहे हैं.
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Discussion
हम एक उपगोल मॉडल में जो MCF10A1 कोशिकाओं और उसके घातक डेरिवेटिव TGF-β निर्भर तरीके में एक मैट्रिक्स कोलेजन में आक्रमण की स्थापना की. सबसे पहले, spheroids methylcellulose की उपस्थिति में 96 कुओं दौर नीचे निलंबन प्लेटों में बनते हैं. बेशक, U-आकार पाली - हेमा लेपित प्लेटें इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Methylcellulose इस चरण में बिल्कुल आवश्यक है, के बाद से कोशिकाओं methylcellulose के अभाव में मर जाएगा. TGF-बीटा सीधे कोलेजन - methocel मिश्रण करने के लिए जोड़ा है क्योंकि हमने पाया है कि TGF-बीटा कोशिकाओं को कम अच्छी तरह से जवाब दिया जब इस पहलू कोलेजन के माध्यम सेशन शीर्ष करने के लिए जोड़ा गया है. हालांकि, यह रासायनिक inhibitors नहीं सीधे DMSO में कोलेजन में भंग जोड़ने के लिए सलाह दी जाती है, क्योंकि DMSO icecold मिश्रण कोलेजन - methocel में precipitates. इसलिए, हम कोलेजन के शीर्ष पर माध्यम से इन यौगिकों में जोड़ें.
बाद में, कोशिकाओं एक 3-dimens कोलेजन में एम्बेडेड रहे हैंional के लिए उन्हें कोलेजन मैट्रिक्स में आक्रमण करने की अनुमति वातावरण. जब अलग MCF10A1 सेल लाइनों के आक्रामक गुणों की तुलना हम कि बेसल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आक्रमण TGF-β प्रेरित आक्रमण अपेक्षाकृत सौम्य M1 कोशिकाओं से वृद्धि हुई है, रास - तब्दील M2 व्युत्पन्न में उच्च स्तर में भी उच्च स्तर पाया metastatic M4 संस्करण. इस प्रकार, आक्रामक गुण इन तीन में सेल 7,8,14 लाइनों की आक्रामकता के सापेक्ष राज्य के साथ सहसंबद्ध है.
कोलेजन में उपगोल के एम्बेडिंग परख में एक महत्वपूर्ण कदम है. विंदुक टिप में उपगोल का पता लगाने मुश्किल हो सकता है जब पहले कुछ समय के लिए परख प्रदर्शन हो सकता है. एक ट्यूब में spheroids इकट्ठा करके इस से बचने, उन्हें नीचे कताई, सतह पर तैरनेवाला हटाने कर सकते हैं और कोलेजन - methocel मिश्रण में spheroids resuspend. यह इनपुट के रूप में अधिक spheroids की आवश्यकता spheroids का 50% के आसपास के रूप में इस प्रक्रिया के दौरान खो दिया है. इसके अलावा कई,spheroids ऊपर एक में अच्छी तरह से खत्म कर सकते हैं और प्रत्येक के लिए अन्य विश्लेषण के करीब झूठ भी हो सकता है. इसके अलावा, यह नहीं अधिक तो अच्छी तरह से प्रति एक उपगोल है संभावना है कि spheroids एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप (स्रावित वृद्धि कारकों द्वारा जैसे) से बचने के लिए पसंद है. इसलिए resuspension कदम इस पद्धति का उपयोग करके एक महत्वपूर्ण कदम है.
इस परख की एक सीमा है कि हम एक 2 आयामी विमान में 3 आयामी परख का विश्लेषण. आंकड़े 3 और 4 के रूप में देखा जा सकता है, सबसे कोशिकाओं को आमतौर पर एक ही विमान में आक्रमण. हालांकि, कि बहुत के किनारे के पास स्थित हैं spheroids अच्छी तरह से गहराई में आमतौर पर अधिक आक्रमण और विश्लेषण से बाहर रखा गया है कि कारण के लिए कर रहे हैं. बेशक यह संभव हो सकता है 3 डी में विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, क्रम में एक और अधिक सटीक परिणाम पाने के. लेकिन इस अत्याधुनिक हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर और क्षेत्र का उपयोग कर के बजाय मात्रा की गणना करने के लाभ की आवश्यकता परेशानी नहीं पल्ला झुकना सकता है. खासकर जब से हमने पाया है कि शुरू के आकार में भिन्नता3 आयामी रूप में 2d में मापा spheroids के, आम तौर पर केवल 5-10% है.
इस पद्धति का एक और नुकसान है कि इमेजिंग के लिए एक समय लेने कदम है, क्योंकि spheroids अलग हाइट्स, जो स्वचालित इमेजिंग बाधित पर स्थित हैं. इसके अलावा विश्लेषण कदम समय लगता है और उपगोल से मैट्रिक्स के लिए अच्छा विपरीत के साथ चित्रों की आवश्यकता है क्रम में Photoshops क्षमता का उपयोग स्वचालित रूप से उपगोल की सीमा को पहचान कर. मामले में इसके विपरीत बहुत कम है, एक बड़ी आसानी से चमक और विपरीत और फ़ोटोशॉप में स्तर घटता आदेशों का उपयोग कर अनुकूलित कर सकते हैं. एक अन्य के विपरीत बढ़ाने के लिए रास्ता एक महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट रंजक उपयोग किया जा चाहते हैं.
मात्रा का ठहराव का एक वैकल्पिक तरीका के रूप में, एक उपगोल आसपास क्षेत्र आकर्षित मैन्युअल छवि जे छवि की एक अग्रिम का उपयोग कर सकता है जे है कि यह फ्रीवेयर (http://rsbweb.nih.gov/ij/) है. हालांकि, हम आक्रमण spheroids के अनियमित आकार के मैनुअल ड्राइंग छवि जम्मू में पायाफ़ोटोशॉप के त्वरित चयन उपकरण की तुलना में एक समय लेने कदम.
प्रोटोकॉल अन्य सेल लाइनों के आक्रमण की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है बशर्ते कि कोशिकाओं spheroids.Furthermore, TGF-बीटा के इष्टतम एकाग्रता सेल लाइन के आक्रमण उत्पन्न अलग हो सकता है बनाने में सक्षम हैं,. हमारे सभी सेल लाइनों में, TGF-बीटा 5 एनजी / एमएल पर आक्रमण लाती है, हालांकि M4 बेहतर प्रदर्शन है जब 2 एनजी / मिली उपयोग कर.
इसके अलावा, इस परख उपकला वृद्धि कारक (EGF) या hepatocyte विकास (HGF) कारक के रूप में अन्य विकास कारकों, आक्रामक प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
हमारे assays में बेसल और TGF-β प्रेरित आक्रमण जोरदार SB-431,542 के साथ उपचार, प्रकार मैं TGF-बीटा के लिए रिसेप्टर के एक अवरोध करनेवाला द्वारा हिचकते था. इस सिद्धांत का एक सबूत है कि रासायनिक inhibitors इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है. एमएमपी inhibitors के रूप में अन्य रासायनिक inhibitors, concentra पर भी सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया हैमाहौल monolayer सेल संस्कृति के लिए निर्माता से सिफारिश की है.
इस तकनीक माहिर होने पर, एक रासायनिक inhibitors, पछाड़ना, या आक्रमण पर जीन की overexpression के प्रभाव का परीक्षण कर सकते हैं. इसके अलावा, एक 24 अच्छी तरह प्रारूप करने के लिए स्केलिंग अप परख द्वारा, एक शाही सेना को अलग phenol के क्लोरोफॉर्म आधारित (जैसे Trizol ® Tripure या) विधि एक सिलिका - स्तंभ के आधार पर सफाई की बाद का उपयोग कर सकते हैं. यह आरएनए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हमारे उपगोल आक्रमण परख vivo 2D आक्रमण मॉडल की तुलना में अधिक बारीकी से प्रक्रिया में जैसा दिखता है, क्योंकि spheroids में कोशिकाओं को अलग चयापचय राज्यों में हैं और उनके 10 परिवेश के साथ और अधिक प्राकृतिक फैशन में बातचीत. हम प्रदर्शन किया है Propidium आयोडाइड और fluorescein DiAcetate धुंधला आक्रमण परख के बाद मृत और जीवित कोशिकाओं की जांच करने के लिए और कहा कि इसी तरह vivo स्थिति में, केंद्र में कोशिकाओं मर चुका है और परिगलित हैं, जबकि टी कोशिकाओंवह बाहरी छोर metabolically सक्रिय हैं.
हम प्रकार मैं न तो matrigel कोलेजन का इस्तेमाल किया, क्योंकि कई रिपोर्टों से पता चला है कि स्तन कैंसर में बाह्य मैट्रिक्स की संरचना अक्सर बदल दिया है, एक उच्च कोलेजन मैं सामग्री के साथ fibrotic कड़ी foci में जिसके परिणामस्वरूप. यह प्रदर्शन किया गया है कि मैं वृद्धि की कोलेजन सामग्री स्तन कैंसर के गठन और 15 आक्रमण को बढ़ावा देता है और 16 मेटास्टेसिस के अधिक से अधिक घटनाओं के साथ जुड़ा हुआ है. कई ट्यूमर कोशिकाओं को इस तरह कोलेजन के माध्यम से मैं अमीर वातावरण पर आक्रमण करने के लिए metastasize है.
पिछले दशकों में कई 3D मॉडल विकसित किया गया है. कक्ष या तो पूरी तरह से कर सकते हैं एक मैट्रिक्स में भीतर एम्बेडेड या एक मैट्रिक्स के शीर्ष या एक polymeric 17,18 पाड़ पर रखा. बिसेल और सह कार्यकर्ताओं द्वारा विकसित एक 3D मॉडल में, कोशिकाओं एक पुनर्गठन तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (RBM) में बड़े हो रहे थे. यह मॉडल एक तेजी से सामान्य और घातक के बीच अंतर परख प्रदान करता हैस्तन उपकला लेकिन, सेल आकारिकी 19,20 पर केंद्रित है. Morphogenesis और अलग MCF10A सेल लाइनों के संगठन inversely 21,22 दुष्टता के साथ सहसंबद्ध. अन्य 3D मॉडल में multicellular spheroids vivo में अपने माता पिता के सेल लाइन के रूप में साइटोटोक्सिक दवाओं के लिए एक ही प्रतिरोध दिखाया है, जबकि monolayers में कोशिकाओं से 11 ऐसा करने में असफल रहा. इसके अलावा MCF10A सेल लाइनों के 3D संस्कृतियों kinase inhibitors के 23 के लिए संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हमारी उपगोल मॉडल विशेष रूप से आक्रमण पर ध्यान केंद्रित करके इन assays के पूरक है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष.
Acknowledgments
हम केन और अभिकर्मकों फ्रेड मिलर (बारबरा Ann Karmanos कैंसर Intitute, डेट्रोइट, संयुक्त राज्य अमेरिका) सेल लाइनों के लिए के लिए Iwata (OSI फार्मास्यूटिकल्स, न्यू यार्क, संयुक्त राज्य अमेरिका) के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck & Co., Inc. | 9533 | |
| 96-well suspension plates | Greiner Bio-One | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates | Greiner Bio-One | 655 180 |
References
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