Sfäroid analys för att mäta TGF-β-inducerad Invasion

Summary

En analys för att kvantitativt mäta Transforming Growth Factor (TGF)-β-inducerad invasionen i 3-dimensionella kollagen geler beskrivs. Denna analys drar fördel av MCF10A serie av cellinjer som representerar olika stadier av bröstcancer utveckling. Denna metod kan antas för att användas tillsammans med andra cellinjer och kan användas för att undersöka andra potentiella aktivatorer eller hämmare av invasion.

Abstract

TGF-β har motsatta roller i bröstcancer progression genom att fungera som en tumörsuppressor i det inledande skedet, men stimulerande invasion och metastasering i ett senare skede ^1,2. Dessutom är TGF-β ofta överuttryckt i bröstcancer och dess uttryck korrelerar med dålig prognos och metastasering ^3,4. De mekanismer genom vilka TGF-β inducerar invasion inte är välkända.

TGF-β framkallar sina cellulära svaren via TGF-β typ II (TβRII) och typ I (TβRI)-receptorer. Vid TGF-β-inducerad heteromeric komplexbildning, fosforylerar TβRII den TβRI. Den aktiverade TβRI inleder intracellulära kanoniska signalväg genom fosforylerande receptor Smads (R-Smads), dvs Smad2 och Smad3. Dessa aktiveras R-Smads formen heteromeric komplex med Smad4, som ackumuleras i cellkärnan och reglera transkription av mål gener ^5. Förutom den tidigare described Smad väg, aktivering av receptorn resulterar i aktivering av flera andra icke-Smad signalvägar, till exempel mitogen aktiverat protein kinas (MAPK) vägar ^6.

För att studera betydelsen av TGF-β i olika stadier av bröstcancer, gjorde vi användning av MCF10A cellen systemet. Detta system består av spontant förevigat MCF10A1 (M1) bröst epitelceller ^7, förvandlade H-RAS M1-derivata MCF10AneoT (M2), som producerar premaligna lesioner hos möss ⁸ och M2-derivata MCF10CA1a (M4), som bildades ur M2 implanterad och bildar hög kvalitet carcinom med förmågan att metastasera till lungorna ^9. Detta MCF10A serien erbjuder möjligheten att studera de svar av celler med olika grader av malignitet som inte är påverkade av en annan genetisk bakgrund.

För analys av TGF-β-inducerad invasionen genererade vi homotypic MCF10A sfäroid cellkulturer embedded i en 3D kollagenmatrisen in vitro (Fig. 1). Sådana modeller liknar mycket humana tumörer in vivo genom att etablera en gradient av syre och näringsämnen, vilket resulterar i ett aktivt och invasiva celler på utsidan och inaktiv eller nekrotiska celler i insidan av sfäroid ^10. Sfäroid baserade analyser har också visat att bättre rekapitulera resistens än monolayer kulturer ^11. Denna MCF10 3D-modell systemet tillät oss att undersöka effekten av TGF-β signalering på invasiva egenskaper bröst celler i olika stadier av malignitet.

Protocol

1. Beredning av methocel lösning (500 ml)

1. Autoklav 6 g metylcellulosa i en 500 ml flaska med en magnetomrörare.
2. Lös metylcellulosa i 250 ml förvärmd DMEM/F12 utan serum (60 ° C) i 20 min.
3. Tillsätt 250 ml DMEM/F12 (RT) med 10% häst serum. Blanda natten (4 ° C).
4. Rensa lösningen genom centrifugering (5000g, 2h, 4 ° C).
5. Ta den klara mycket viskös lösning till ett nytt rör (ca 90-95% av stamlösning).
6. Förvaras vid 4 ° C fram till användning.

2. Sfäroid kultur

1. Bered en 20% methocel-lösning (10 ml methocel och 40 ml odlingsmedium).
2. Tvätta cellerna två gånger med PBS, lägg till 0,1% trypsin och celler inkubera vid 37 ° C
3. Resuspendera cellerna i odlingsmedium och räkna cellerna.
4. Bered en suspension av 10 000 celler per ml i 20% methocel.
5. Lägg till cellsuspension till 96 väl rund botten suspension plattor (100 l per brunn).
6. Nästa dag, kontrollera sfäroid formation i suspensionen plattorna. Spheroids kommer att vara klara för användning efter 1-3 dagar.

3. Beredning av kollagen

1. Förbered på isen en lösning av 8 ml kollagen, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH och 3 droppar 0,1 N HCl. Kontrollera om pH är 7,4 genom att uppmärksamma en del av lösningen på remsorna pH-indikator. Justera pH, om utom räckhåll.
2. Tillsätt 50 l av neutraliserat kollagen lösningen i brunnar på en 96 brunnar
3. Inkubera vid 37 ° C tills kollagen är solidifierat (90 min).
4. Förbered methocel-kollagen-ligand lösningar på is: för varje ligand pipett en del av kollagen lösning. Lägg till 20 ng per ml kollagen TGF-β. Efter spädning med methocel och spridning över de olika lagren kommer den slutliga koncentrationen av TGF-β vara 5 ng / ml Blanda genom att vortexa. Tillsätt 1 del methocel-lösning. Blanda genom att vortexa.

4. Sfäroid bäddading

1. Placera en 200 l spets som har ca 5 mm av spetsen avskuren, på en 200 l pipett. Sug upp en sfäroid med pipett och försiktigt Fördela substratet i en tom tallrik. Titta om sfäroid stannar inne i spetsen. Den sfäroid syns som en vit prick. Utan att släppa kolven, suger upp 100 l kollagen-methocel blandningen och dosera sfäroid i kollagen blandningen i en kollagen-coated 96 bra. Gör detta för 12 spheroids för varje tillstånd.
2. Låt kollagen stelna i minst 30 minuter vid 37 ° C
3. Avlägsna luftbubblor med en 200 l spets.
4. Tillsätt 50 ìl medium med 1,6% serum och hämmare löst i DMSO. För SB-431.542 lägga 4 ìl av stamlösning (10 mm) till 1 ml medium. Efter diffusion, kommer den slutliga koncentrationen av hämmare vara 10 mikrometer. TGF-β och inhibitorer kommer att stanna under experimentet. Ta bilder av spheroids under mikroskop med 40x förstoring.
5. Efter 48h i stimulering med TGF-β och / eller hämmare, ta bilder av spheroids under mikroskop med 40x förstoring.
6. Mät ytan av den invadera spheroids efter 2 dagar och subtrahera startområdet. Att mäta arean av en sfäroid: Öppna bilden från sfäroid i Adobe Photoshop Extended (Figur 2a) och välj Quick Selection-verktyget (Figur 2b). Muspekaren ändras till en cirkel med ett "plus" (+) tecknet (figur 2C). Medan du drar markören över sfäroid kommer Photoshop igen gränser sfäroid. Om ett område utanför sfäroid är valt kan denna region uteslutas från valet genom att trycka på Alt-tangenten eller med negativt urval verktyg som indikeras av ett (-) tecken i verktygsfältet. Markören ändras till en cirkel med ett "minus" (-) tecken och genom att dra markören över felaktigt markerade området, är detta område bort från markeringen (figur 2D). Om det behövs flera regioner kan väljas genom att trycka på ShIFT-knappen. Att arbeta mer exakt, kan storleken på muspekaren justeras genom att ändra borstdiameter i verktygsfältet (figur 2E). När hela sfäroid väljs, är den del av urvalet som beräknas via analys-åtgärd i menyraden eller genom att trycka Ctrl + Skift + M (figur 2F). Mätningen inspelning fönster visas som visar filens namn och området av urvalet i pixlar, samt andra data (figur 2G). Om flera markeringar mäts, visar den första raden med summan av samtliga områden. Mätningarna av de enskilda alternativen presenteras i raderna nedan. Uppgifterna för alla mätningar kan exporteras till en textfil och öppnas i Excel.

5. Representativa resultat:

Ett exempel på sfäroid analysen med MCF10A1 (M1) normala bröst epitelceller, förvandlades H-RAS MCF10AneoT (M2) celler och M2-derived MCF10CA1a (M4) ges i figur 3. M1 celler visade bara svaga invasion utanstimulering, men invaderade betydligt bättre på stimulering av TGF-β. Däremot RAS-transformerade M1-derivata M2 invaderade redan effektivt utan tillsats av stimuli, och detta var ytterligare ökat 4-5 gånger på TGF-β behandling. M4 celler visade starkast invasionen, både med och utan TGF-β tillägg.

Sedan undersökte vi om vi kunde störa TGF-β-inducerad invasionen i denna sfäroid modell med kemiska hämmare. För detta ändamål använde vi SB-431.542, en ATP analog och selektiv hämmare av kinase aktiviteten hos TβRI samt Activin typ IB receptor (ActRIB) och Activin receptor-liknande kinase (ALK) 7 ^12. Som väntat hämmade SB-431.542 potent TGF-β-inducerad invasionen av M1, M2 och M4 celler (Fig 4), vilket visar att TGF-β-inducerad invasionen är TβRI-kinas beroende. Dessutom var de basala invasionen av spheroids också starkt hämmas, vilket tyder på att basala invasionen är också deroende på TGF-β.

Figur 1. Flödesschema för 3D sfäroid analysen. Först är celler klädd under icke-häftande förhållandena i u-formade suspensioner plattor. Celler aggregrate in multcellular spheroids och kan bäddas in i ett kollagenmatrisen. In i detta kollagenmatrisen, kan de invadera.

Figur 2. Kvantifiering av den del av spheroids med hjälp av Adobe Photoshop Extended. (A) Bilden av sfäroid öppnas i Adobe Photoshop Extendend (B) Val av verktyget Snabbval (C) drar markören över sfäroid att markera det område i sfäroid (D) Borttagning av en wongly ingår området med hjälp av negativa Snabbval (E) Justering av borsten storleken på verktyget Snabbval att mer exakt välja området (F) Val avmätning kommandot för att spela in (G) Exempel på en mätning rekord.

Figur 3. TGF-β-inducerad invasionen av spheroids av spontant förevigat MCF10A1 (M1) (A), RAS-transformerade MCF10AneoT (M2 (B) och dess metastaserande derivat MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 och M4 spheroids inbäddade i kollagen behandlades med 5ng/ml av TGF-β för 48h som visas. AC representant bilder tagna på dagen för inbäddning och två dagar senare. var D Relativ invasion kvantifieras som område skillnad på dag 2 minus dag 0. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SD Anpassad från ^13.

Figur 4. Basal och TGF-β-inducerad sfäroid invasionen hämmas By SB-431.542. M1, M2 och M4 spheroids var inbäddade i kollagen och behandlas med 5ng/ml TGF-β och / eller 10 mikroM SB-431.542 som anges. Representativa bilder tagna efter 2 dagar (A). Relativ invasionen var kvantifieras som område skillnad på dag 2 minus dag 0 (B). Resultaten uttrycks som medelvärde ± SD Anpassad från ^13.

Discussion

Vi etablerade en sfäroid modell där MCF10A1 celler och maligna derivat invadera till en kollagenmatrisen i en TGF-β-beroende sätt. Först är spheroids bildas i 96-brunnar runda plattor botten fjädring i närvaro av metylcellulosa. Naturligtvis kan även U-formad poly-HEMA plåt användas för detta ändamål. Metylcellulosa är absolut krävs i detta steg, eftersom celler dör i avsaknad av metylcellulosa. TGF-β läggs direkt till kollagen-methocel blandning eftersom vi upptäckt att celler svarade sämre på TGF-β när denna faktor var tillsättas medium op toppen av kollagen. Däremot är det lämpligt att lägga kemiska hämmare löst i DMSO inte direkt in i kollagen, eftersom DMSO fällningar i iskall kollagen-methocel blandning. Därför lägger vi dessa föreningar på medellång på toppen av kollagen.

Därefter är cellerna inbäddade i en kollagen 3-dimensional miljö att tillåta dem att invadera i kollagenmatrisen. Vid en jämförelse av invasiva egenskaper hos de olika MCF10A1 cellinjer fann vi att basala invasion samt TGF-β-inducerade invasionen ökat från relativt godartad M1 celler, till högre nivåer i RAS-transformerade M2 ​​derivatet, till ännu högre nivåer i metastaserande M4 variant. Således invasiva egenskaper korrelerade med den relativa tillstånd av aggressivitet av dessa tre cellinjer ^7,8,14.

Den inbäddning av sfäroid i kollagen är ett kritiskt steg i analysen. Att upptäcka sfäroid i pipettspetsen kan vara svårt när analysen utförs för de första gångerna. Man kan undvika detta genom att samla in spheroids i ett rör, spinning ner dem, ta bort supernatanten och suspendera spheroids i kollagen-methocel blandning. Detta kräver mer spheroids som indata som cirka 50% av spheroids går förlorad under denna process. Dessutom fleraspheroids kan hamna i en bra och kan ligga för nära varandra för att analysera. Dessutom är det att föredra att ha inte mer än en sfäroid per brunn för att undvika möjligheten att spheroids kan störa varandra (t.ex. genom faktorer utsöndra tillväxt). Därför resuspension steget är ett kritiskt steg med denna metod.

En begränsning av denna analys är att vi analyserar en 3 dimensionell analys i en 2 dimensionella plan. Som kan ses i figur 3 och 4, de flesta celler invaderar oftast i samma plan. Men spheroids som ligger väldigt nära kanten av invadera väl generellt mer på djupet och är av det skälet undantas från analysen. Naturligtvis skulle det vara möjligt att utföra analysen i 3D, för att få ett mer exakt resultat. Men detta kräver avancerad hårdvara och mjukvara och nyttan av att beräkna volym istället för att använda området inte kan uppväga de problem. Speciellt eftersom vi fann att variationen i start storlekav 3-dimensionella spheroids mätt i 2D, påverkas oftast endast 5-10%.

En annan nackdel med denna metod är att bildbehandling är ett tidskrävande steg eftersom spheroids är placerade på olika höjd, vilket hämmar automatiserad bildbehandling. Också analysen steg är tidskrävande och kräver bilder med bra kontrast från sfäroid till matris för att kunna utnyttja Photoshops förmåga att automatiskt känna igen gränsen till sfäroid. Ifall kontrasten är för låg, kan man enkelt anpassa ljusstyrka och kontrast med hjälp av Nivåer och Kurvor kommandon i Photoshop. Ett annat sätt att öka kontrasten skulle vara att använda en vital fluorescerande färg.

Som ett alternativt sätt att kvantifiering skulle man kunna dra runt sfäroid manuellt med Image J. Ett förskott på Image J är att det är freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Vi hittade dock den manuella ritning av den oregelbundna formen på invaderade spheroids i Image Jett tidskrävande steg jämfört med Photoshop Quick Selection Tool.

Protokollet kan anpassas för att undersöka invasion av andra cellinjer, förutsatt att cellerna kan bilda spheroids.Furthermore, den optimala koncentrationen av TGF-β att inducera invasion av cellinje kan vara annorlunda. I alla våra cellinjer, framkallar TGF-β invasionen vid 5 ng / ml, men M4 presterar bättre när de använder 2 ng / ml.

Dessutom kan denna analys anpassas för att mäta invasiv svar på andra tillväxtfaktorer, såsom epitelceller tillväxtfaktor (EGF) eller hepatocyte growth factor (HGF).

I våra analyser basala och TGF-β-inducerad invasionen var starkt hämmas av behandling med SB-431.542, en hämmare av typ I receptorn för TGF-β. Detta är ett bevis på principen att kemisk hämmare kan användas i denna analys. Andra kemiska hämmare, såsom MMP-hämmare, har också använts framgångsrikt vid koncentrationerningar som rekommenderas av tillverkaren för cellslager cellkultur.

Vid mastering denna teknik kan en testa effekten av kemiska hämmare, knockdown eller överuttryck av gener på invasionen. Genom att skala upp analysen till en 24 bra format kan en isolera RNA med hjälp av en fenol-kloroform-baserad metod (t.ex. Trizol ® eller Tripure) följt av en silica-kolonn baserad sanering. Detta RNA kan användas för kvantitativ realtids-PCR.

Vår sfäroid invasion analys liknar in vivo-processen mer noggrant än 2D-invasion modeller, eftersom celler i spheroids är i olika metabola tillstånd och interagera i mer naturligt sätt med sin omgivning ^10. Vi har utfört propidiumjodid och Fluorescein diacetate färgning för att leta efter döda och levande celler efter invasionen analys och konstaterade att på samma sätt som in vivo situationen, de celler i centrum är döda och nekrotisk, medan de celler vid tHan ytterkant är metaboliskt aktiva.

Vi använde typ I-kollagen snarare än matrigel, eftersom flera rapporter har visat att sammansättningen av extracellulära matrix i bröstcancer ofta ändras, vilket resulterar i fibrotiska stel foci med hög kollagen jag innehåll. Det har visats att ökad kollagen jag innehåll främjar bildandet bröstcancer och invasionen ¹⁵ och förknippas med högre incidens av metastaser ^16. Många tumörceller har alltså att invadera genom en kollagen jag rik miljö för att metastasera.

Flera 3D-modeller har utvecklats under de senaste decennierna. Celler kan vara antingen helt inbäddad i en matris eller placeras på toppen av en matris eller en polymer byggnadsställning ^17,18. I en 3D-modell som utvecklats av Bissell och medarbetare, var cellerna odlas i en rekonstruerad basalmembranet (RBM) matris. Denna modell ger en snabb analys för att skilja mellan normala och malignabröst epitel, men fokuserar på cellmorfologin ^19,20. Morfogenes och organisation av olika MCF10A cellinjer korrelerar omvänt med malignitet ^21,22. I andra 3D-modeller flercelliga spheroids visade samma resistens mot cytostatika som deras föräldrar cellinje in vivo, medan celler i monolager underlåtit att göra detta ^11. Även 3D-kulturer av MCF10A cellinjer har använts för att bedöma känsligheten för Kinasinhibitorer ^23. Vår sfäroid modell kompletterar dessa tester genom att specifikt fokusera på invasionen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Advanced Biomatrix	5005-B
pH indicator strips	Merck & Co., Inc.	9533
96-well suspension plates	Greiner Bio-One	650 185
96-well adhesion TC plates	Greiner Bio-One	655 180