Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Summary

Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.

Abstract

TGF-β ha opposti ruoli nella progressione del cancro al seno, agendo come un soppressore del tumore nella fase iniziale, ma stimolando l'invasione e metastasi in seguito ^1,2 stadio. Inoltre, TGF-β è spesso sovra-espresso nel cancro al seno e la sua espressione correla con prognosi infausta e metastasi ^3,4. I meccanismi attraverso i quali TGF-β induce invasione non sono ben compresi.

TGF-β suscita le sue risposte via cellulare di tipo II del TGF-β (TβRII) e di tipo I (TβRI) recettori. Su TGF-β-indotta formazione eteromerici complesso, TβRII fosforila il TβRI. Il TβRI attivato avvii un percorso di segnalazione intracellulare canonica da Smads fosforilazione del recettore (R-Smads), cioè Smad2 e Smad3. Questi attivato R-Smads formare complessi con eteromerici Smad4, che si accumulano nel nucleo e regolano la trascrizione dei geni bersaglio ^5. Oltre al già described percorso Smad, i risultati del recettore attivazione attivazione di numerose altre vie di segnalazione non Smad, per esempio mitogeno proteina chinasi attivata (MAPK) percorsi di ^6.

Per studiare il ruolo del TGF-β in diversi stadi di cancro al seno, abbiamo fatto uso del sistema a celle MCF10A. Questo sistema è costituito da immortalata spontaneamente MCF10A1 (M1), le cellule epiteliali del seno ^7, l'H-RAS trasformato M1-derivato MCF10AneoT (M2), che produce lesioni precancerose nei topi ^8, e l'M2-derivato MCF10CA1a (M4), istituito dalla xenotrapianti M2 e forme ad alta carcinomi di grado con la capacità di metastatizzare al polmone ^9. Questa serie MCF10A offre la possibilità di studiare le risposte delle cellule con diversi gradi di malignità che non sono viziate da un background genetico diverso.

Per l'analisi di TGF-β-indotta invasione, abbiamo generato homotypic MCF10A sferoide embe colture cellularidded in una matrice di collagene 3D in vitro (Fig. 1). Tali modelli sono molto simili tumori umani in vivo mediante l'istituzione di un gradiente di ossigeno e nutrienti, con conseguente cellule attive e invasivi sulle cellule all'esterno e quiescenti o addirittura necrotico nella parte interna della sferoide ^10. Sferoide test basato hanno anche dimostrato di ricapitolare meglio la resistenza ai farmaci di colture monostrato ^11. Questo modello MCF10 sistema 3D ci ha permesso di studiare l'impatto di TGF-β segnalazione sulle proprietà invasiva delle cellule del seno in diverse fasi di malignità.

Protocol

1. Preparazione della soluzione METHOCEL (500 ml)

1. Autoclave 6 g di metilcellulosa in una bottiglia da 500 ml contenente un agitatore magnetico.
2. Sciogliere la metilcellulosa in 250 ml di DMEM/F12 preriscaldato senza siero (60 ° C) per 20 min.
3. Aggiungere 250 ml di DMEM/F12 (RT) con siero di cavallo 10%. Mix notte (4 ° C).
4. Chiara la soluzione per centrifugazione (5000g, 2 ore, 4 ° C).
5. Prendere la soluzione limpida altamente viscosi a un nuovo tubo (circa il 90-95% della soluzione di riserva).
6. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.

2. Cultura sferoide

1. Preparare una soluzione al 20% METHOCEL (10 ml METHOCEL e 40 ml di terreno di coltura).
2. Lavare le cellule due volte con PBS, aggiungere lo 0,1% tripsina e cellule incubare a 37 ° C
3. Risospendere le cellule in terreno di crescita e contare le cellule.
4. Preparare una sospensione di 10 000 cellule per ml nel 20% METHOCEL.
5. Aggiungere la sospensione cellulare ai 96 fondo anche l'spiastre uspension (100 l per pozzetto).
6. Il giorno dopo, controlla la formazione sferoide nei piatti sospensione. Sferoidi sarà pronto per l'uso dopo 1-3 giorni.

3. Preparazione del collagene

1. Preparare sul ghiaccio una soluzione di 8 collagene ml, 1 ml di PBS 10x, 1 ml di NaOH 0,1 N e 3 gocce di 0,1 N HCl. Controlla se il pH è di 7,4 individuando alcune delle soluzione sulle strisce indicatore di pH. Regolare il pH se fuori portata.
2. Aggiungere 50 ml di soluzione di collagene neutralizzata nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti
3. Incubare a 37 ° C fino a quando il collagene è solidificata (90 min).
4. Preparare METHOCEL-collagene-ligando soluzioni su ghiaccio: per ogni ligando pipetta 1 parte di soluzione di collagene. Aggiungere 20 ng per ml di collagene TGF-β. Dopo diluizione con METHOCEL e diffusione sui diversi strati, la concentrazione finale di TGF-β sarà di 5 ng / ml Mescolare vortexando. Aggiungere 1 parte di METHOCEL-soluzione. Mescolare nel vortex.

4. Sferoide incorporareding

1. Inserire una punta di 200 microlitri, che ha circa 5 mm dalla punta tagliata, in una pipetta 200 ul. Aspirare uno sferoide con la pipetta e dispensare con cura il mezzo in un piatto vuoto. Guarda se la sferoide rimane all'interno della punta. Il sferoide è visibile come un punto bianco. Senza rilasciare lo stantuffo, aspirare 100 l collagene METHOCEL miscela e dispensare lo sferoide nella miscela di collagene in un collagene rivestito 96 pozzetti. Fate questo per 12 sferoidi per ogni condizione.
2. Lasciate solidificare il collagene almeno 30 minuti a 37 ° C
3. Rimuovere le bolle d'aria con una punta di 200 l.
4. Aggiungere 50 ml di media con 1,6% di siero e gli inibitori sciolto in DMSO. Per SB-431542 aggiungere 4 ml di soluzione madre (10 mM) a 1 ml di terreno. Dopo la diffusione, la concentrazione finale della inibitore sarà di 10 micron. TGF-β e gli inibitori rimarrà il corso dell'esperimento. Scatta foto di sferoidi al microscopio con ingrandimento 40x.
5. Dopo 48h di stimolazione con TGF-β e / o inibitori, scattare foto degli sferoidi al microscopio con ingrandimento 40x.
6. Misurare l'area del sferoidi invasori dopo 2 giorni e sottrarre la zona di partenza. Misurazione della superficie di uno sferoide: Aprire l'immagine dal sferoide in Adobe Photoshop Extended (figura 2A) e selezionare lo strumento di selezione rapida (figura 2B). Il puntatore del mouse si trasforma in un cerchio con un 'plus' (+) segno (figura 2C). Mentre si trascina il cursore sopra la sferoide, Photoshop riconoscerà i confini della sferoide. Se una zona diversa da sferoide è selezionata, questa regione può essere esclusa dalla selezione premendo il tasto Alt o utilizzando lo strumento di selezione negativa, che è indicata da un segno (-) nella barra degli strumenti. Il cursore si trasforma in un cerchio con un 'meno' (-) firmare e trascinando il cursore sopra l'area erroneamente selezionata, questa zona viene rimosso dalla selezione (figura 2D). Se necessario, più regioni può essere selezionato premendo il Shift pulsante. Per lavorare con maggiore precisione, le dimensioni del puntatore del mouse può essere regolata cambiando il diametro del pennello nella barra degli strumenti (2E figura). Quando la sferoide tutto è selezionata, l'area della selezione viene calcolata tramite ANALISI SU MISURA nella barra dei menu o premendo Ctrl + Maiusc + M (figura 2F). La finestra di registrazione misura apparirà mostrando il nome del file e la zona della selezione in pixel, così come altri dati (figura 2G). Se selezioni multiple sono misurati, la prima riga indica la somma di tutte le aree. Le misure delle scelte individuali sono presentati nelle linee di basso. I dati di tutte le misurazioni possono essere esportati in un file di testo e aperto in Excel.

5. Rappresentante dei risultati:

Un esempio di saggio sferoide con MCF10A1 (M1), le cellule epiteliali mammarie normali, H-RAS trasformato MCF10AneoT (M2), le cellule e M2-derivati ​​MCF10CA1a (M4) è dato in Figura 3. M1 cellule hanno mostrato solo debole senza invasionestimolazione, ma invaso significativamente migliore dopo la stimolazione da TGF-β. Al contrario, la RAS-trasformata M1-M2 derivati ​​già invaso in modo efficiente senza aggiunta di stimoli, e questo è stato ulteriormente aumentato 4-5 volte su TGF-β trattamento. M4 cellule hanno mostrato la più forte invasione, con o senza aggiunta di TGF-β.

Successivamente, abbiamo valutato se ci potrebbe interferire con TGF-β-indotta invasione in questo modello sferoide utilizzando inibitori chimici. A questo scopo abbiamo utilizzato SB-431542, un analogo ATP e selettivo inibitore dell'attività della chinasi TβRI, così come activina recettore di tipo IB (ActRIB) e activina receptor-like kinase (ALK) 7 ^12. Come previsto, SB-431542 potentemente inibito TGF-β-indotta invasione di M1, M2 e M4 cellule (Fig. 4), indicando che TGF-β-indotta invasione è TβRI-chinasi dipendente. Inoltre, l'invasione basale della sferoidi è stata fortemente inibita, il che suggerisce che l'invasione della base è anche deindipendenti sul TGF-β.

Figura 1. Diagramma di flusso del test 3D sferoide. In primo luogo, le cellule sono placcati in condizioni non aderente a forma di u piastre sospensioni. Cellule aggregrate in sferoidi multcellular e può essere incorporato in una matrice di collagene. In questa matrice di collagene, sono in grado di invadere.

Figura 2. Quantificazione dell'area del sferoidi utilizzando Adobe Photoshop Extended. (A) Il quadro della sferoide è aperto in Adobe Photoshop allargata del (B) Selezione lo strumento Selezione rapida (C) Trascinando il cursore sopra la sferoide per selezionare l'area dello sferoide (D) La rimozione di una zona di wongly incluso usando l' negativo veloce strumento Selezione (E) Regolazione della dimensione del pennello dello strumento di selezione rapida per selezionare con maggiore precisione l'area (F) Selezione delmisurazione comando da registrare (G) Esempio di un record di misura.

Figura 3. TGF-β-indotta invasione di sferoidi spontaneamente immortalata MCF10A1 (M1) (A), RAS-trasformato MCF10AneoT (M2 (B) e le sue metastasi derivate MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 e M4 sferoidi incorporato in collagene sono stati trattati con 5ng/ml di TGF-β per 48 ore, come indicato. AC immagini rappresentative tratte al giorno di incasso e due giorni dopo. invasione D relativo è stato quantificato come differenza zona giorno 2 meno giorno 0. I risultati sono espressi come media ± sd Adattato da ^13.

Invasione sferoide Figura 4. Basale e TGF-β-indotta è inibita by SB-431542. Sferoidi M1, M2 e M4 sono stati incorporati nel collagene e trattati con 5ng/ml TGF-β e / o 10 mM SB-431542 come indicato. Immagini rappresentative tratte dopo 2 giorni (A). Invasione parente è stato quantificato come differenza zona giorno 2 meno giorno 0 (B). I risultati sono espressi come media ± sd Adattato da ^13.

Discussion

Abbiamo stabilito un modello di sferoide in cui MCF10A1 cellule e dei suoi derivati ​​maligne invadono in una matrice di collagene in un TGF-β-dipendente. In primo luogo, sferoidi si formano in 96-pozzi di piastre di fondo sospensione rotonda alla presenza di metilcellulosa. Naturalmente, anche a forma di U piatti rivestiti di poli-HEMA può essere utilizzato per questo scopo. Metilcellulosa è assolutamente necessaria in questa fase, poiché le cellule moriranno in assenza di metilcellulosa. TGF-β viene aggiunto direttamente al collagene METHOCEL miscela da quando abbiamo scoperto che le cellule hanno risposto meno bene al TGF-β se questo fattore è stato aggiunto alla cima op medio del collagene. Tuttavia, si consiglia di aggiungere inibitori chimici disciolti in DMSO non direttamente nel collagene, dato che il DMSO precipitati nei icecold collagene METHOCEL miscela. Pertanto, si aggiungono questi composti nel terreno in cima al collagene.

Successivamente, le cellule sono incorporati in un collagene 3-dimensambiente ionale per consentire loro di invadere la matrice di collagene. Quando si confrontano le proprietà invasive delle diverse linee cellulari MCF10A1 abbiamo scoperto che l'invasione della base così come TGF-β-indotta invasione aumentato da cellule relativamente benigno M1, a più alti livelli nel RAS-trasformato derivato M2, a livelli ancora più elevati nel metastatico M4 variante. Così, la proprietà invasivo correlato con il relativo stato di aggressività di queste tre linee cellulari ^7,8,14.

L'incorporazione dello sferoide in collagene è un passo fondamentale nel saggio. La rilevazione della sferoide la punta della pipetta potrebbe essere difficile quando si esegue il test per le prime volte. Si può evitare questo, raccogliendo la sferoidi in un tubo, la filatura giù, rimuovendo il surnatante e risospendere il sferoidi in collagene METHOCEL miscela. Questo richiede più sferoidi come input di circa il 50% del sferoidi è perso durante questo processo. Inoltre, piùsferoidi può finire in un pozzo e potrebbe trovarsi troppo vicini gli uni agli altri da analizzare. Inoltre, si preferisce non avere più di un sferoide per pozzetto per evitare la possibilità che sferoidi possono interferire con l'altro (per esempio secernono fattori di crescita). Quindi il passo risospensione è un passo fondamentale con questo metodo.

Un limite di questo saggio è che analizziamo un test a 3 dimensioni in un piano a 2 dimensioni. Come si può vedere nelle figure 3 e 4, la maggior parte delle cellule di solito invadono sullo stesso piano. Tuttavia, sferoidi che si trovano molto vicino al bordo del pozzo invadono generalmente più in profondità e sono per questo motivo esclusi dall'analisi. Naturalmente sarebbe possibile eseguire l'analisi in 3D, al fine di ottenere un risultato più preciso. Ma questo richiede hardware e software sofisticate e il vantaggio di calcolare il volume invece di usare l'area non possono superare i problemi. Soprattutto perché abbiamo scoperto che la variazione delle dimensioni di partenzadel 3-dimensionale sferoidi misurata in 2D, in genere solo il 5-10%.

Un altro svantaggio di questo metodo è che l'immagine è un passo molto tempo, dato che il sferoidi si trovano a diverse altezze, che ostacola l'imaging automatizzato. Anche la fase di analisi richiede tempo e richiede immagini con un buon contrasto da sferoide alla matrice, al fine di fare uso di Photoshops capacità di riconoscere automaticamente il bordo della sferoide. Nel caso in cui il contrasto è troppo basso, si può facilmente adattare la luminosità e il contrasto utilizzando i livelli ed i comandi CURVE in Photoshop. Un altro modo per aumentare il contrasto potrebbe essere l'uso di un colorante vitale fluorescente.

Come un modo alternativo di quantificazione, si può disegnare l'area intorno alla sferoide manualmente utilizzando immagini J. Un anticipo di immagine J è che è freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Tuttavia, abbiamo trovato il disegno manuale della forma irregolare del sferoidi invaso in immagine Jun passo molto tempo rispetto a strumento di selezione rapida di Photoshop.

Il protocollo può essere adattato per studiare invasione di altre linee cellulari, a condizione che le cellule sono in grado di formare spheroids.Furthermore, la concentrazione ottimale di TGF-β per indurre l'invasione della linea cellulare potrebbe essere diverso. In tutte le nostre linee cellulari, TGF-β induce invasione a 5 ng / ml, anche se M4 prestazioni migliori quando si usano 2 ng / ml.

Inoltre, questo test può essere adattato a misurare le risposte invasiva per altri fattori di crescita, come fattore di crescita epiteliale (EGF) o fattore di crescita degli epatociti (HGF).

Nei nostri test l'invasione della base e TGF-β-indotta è stata fortemente inibita dal trattamento con SB-431542, un inibitore del recettore di tipo I per TGF-β. Questa è una prova di principio che gli inibitori chimici possono essere utilizzati in questo test. Inibitori chimici, come gli inibitori MMP, sono stati utilizzati con successo a concentrazionezioni consigliato dal produttore per la cultura monostrato cellulare.

Su padroneggiare questa tecnica, si può testare l'effetto degli inibitori chimici, l'abbattimento o l'iperespressione di geni invasione. Inoltre, scaling up il test in un formato ben 24, si può isolare l'RNA utilizzando un fenolo-cloroformio a base di metodo (ad es Trizol ® o Tripure), seguita da una colonna a base di silice-clean-up. Questo RNA può essere utilizzato per quantitativa real-time PCR.

Il nostro saggio di invasione sferoide assomiglia al processo in vivo più da vicino rispetto ai modelli 2D invasione, perché le cellule in sferoidi si trovano in diversi stati metabolici e interagire in maniera più naturale con l'ambiente circostante ^10. Abbiamo effettuato ioduro di propidio e diacetato di fluoresceina colorazione per verificare la presenza di cellule morte e vita dopo il test invasione e ha osservato che in modo simile alla situazione in vivo, le cellule del centro sono morti e necrotici, mentre le cellule al tempo tha bordo esterno sono metabolicamente attivi.

Abbiamo usato collagene di tipo I piuttosto che Matrigel, perché diversi report hanno mostrato che la composizione della matrice extracellulare nel carcinoma mammario è spesso alterata, con conseguente fibrotiche rigide focolai di collagene con un alto contenuto io. E 'stato dimostrato che il collagene contenuto aumento io promuove la formazione di cancro al seno e ¹⁵ e l'invasione è associata con una maggiore incidenza di metastasi ^16. Molte cellule tumorali hanno quindi ad invadere attraverso un ambiente ricco di collagene I per metastasi.

Diversi i modelli 3D sono stati sviluppati negli ultimi decenni. Le celle possono essere sia interamente immerse all'interno in una matrice o collocato su una matrice polimerica o di un ponteggio ^17,18. In un modello 3D sviluppato da Bissell e collaboratori, le cellule sono state coltivate in un ricostituito membrana basale (RBM) matrice. Questo modello fornisce un test rapido per distinguere tra normali e maligniepitelio mammario, ma si concentra sulla morfologia delle cellule ^19,20. Morfogenesi e organizzazione delle diverse linee cellulari MCF10A inversamente correlato con malignità ^21,22. In altri modelli 3D sferoidi multicellulari hanno mostrato la stessa resistenza ai farmaci citotossici come loro linea cellulare dei genitori in vivo, mentre le cellule in monostrato non è riuscito a farlo ^11. Anche culture 3D di linee cellulari MCF10A sono stati utilizzati per valutare la sensibilità di inibitori della chinasi ^23. Il nostro modello sferoide integra questi test da particolare attenzione ai invasione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Advanced Biomatrix	5005-B
pH indicator strips	Merck & Co., Inc.	9533
96-well suspension plates	Greiner Bio-One	650 185
96-well adhesion TC plates	Greiner Bio-One	655 180