Summary
Рекомбинантный адено-связанный вирус (rAAVs) векторов, становятся все более ценными для
Abstract
В последние годы рекомбинантный адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) становятся все более ценными для прижизненного исследования на животных, а также в настоящее время проходит испытания в клинические испытания на человеке. Дикого типа AAV является непатогенных члена семьи parvoviridae и по своей сути репликации с дефицитом. Широкого профиля трансдукции, низкий иммунный ответ, а также сильных и устойчивых экспрессии трансгена достигнуты с этими векторами сделало их популярными и универсальный инструмент для в пробирке и в естественных условиях доставки гена. rAAVs можно легко и дешево производится в лаборатории, и, основываясь на их благоприятный профиль безопасности, которые обычно предоставляются низкой классификации безопасности. Здесь мы опишем метод производства и titering химерных rAAVs содержащие белки капсида, так и AAV1 AAV2. Использование этих так называемых химерного вектора сочетает в себе преимущества обоих родительских серотипов, таких как высокие запасы титры (AAV1) и очисткис помощью аффинной хроматографии (AAV2). Эти AAV серотипов являются наиболее изученным из всех серотипов AAV, и в индивидуальном порядке имеют широкую картину инфекционности. Химерного вектора, описанные здесь, должны иметь инфекционные свойства AAV1 и AAV2 и, таким образом, можно ожидать, чтобы заразить широкий спектр тканей, включая нейроны, скелетных мышцах, поджелудочной железы, почек и других. Метод, описанный здесь используется гепарин очистки колонки, метод считается, дают более высокий титр вирусных и чище вирусных подготовки, чем другие методы очистки, такие как центрифугирование через цезия градиентом хлорида. Кроме того, мы опишем, как эти векторы могут быть быстро и легко оттитрованы, чтобы дать точное считывание количества инфекционных частиц.
Protocol
См. рисунок 1 для иллюстрации обобщения следующий протокол.
Безопасность Примечание: Все материалы, которые были в контакте с собранном вирусных частиц необходимо дезинфицировать раствором Virkon или других подходящих дезинфицирующих средств.
1. Подготовка запасов плазмида ДНК (~ 2 дня)
- Следующие плазмиды требуется 1:
- pRV1 - содержащие AAV2 Rep и Кап последовательности
- pH21 - содержащие AAV1 Rep и Кап последовательности
- pFdelta6 - аденовирус-хелперов плазмиды
- AAV плазмиды, содержащей рекомбинантный кассеты выражение окружении AAV2 упаковки сигналы (в виде перевернутого концевых повторов, РМЭ)
- Хотя pFdelta6 должны быть выращены в Stbl2 компетентных клеток, чтобы предотвратить частичное удаление, pRV1 и pH21 могут быть выращены в DH5alpha компетентных клеток. AAV плазмиды могут быть выращены в Stbl2 клеток, если частичное удаление происходят в клетках DH5alpha.
- ДНК плазмиды должны быть высокого качества и свободным от загрязнений РНК. Плазмиды могут быть проверены на целостность, используя следующий дайджестов:
- pRV1 - дайджест с XbaI дать полосы 7,5 кб и 3,8 кб
- pH21 - дайджест с EcoRI дать полосы 4,5 кб, 2,8 кб и 0,2 кб
- pFdelta6 - дайджест с HindIII дать полосы 5,5 кб, 3 кб, 3 кб, 2,3 кб и 1,5 кб
2. Подготовка человеческих эмбриональных клетках почек 293 (HEK293) для трансфекции (2 - 3 дней)
- Пластина два 80% сливной 150 см 2 колбы НЕК293 на пять 15 см в диаметре блюда Nunc тканевой культуры. Клетки должны быть 70 - 80% сливной до трансфекции (примерно через 48 часов после покрытия). Культуры клеток в изменение стандартного Eagle Дульбекко среде (DMEM) с низким уровнем глюкозы, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 100 Ед / мл пенициллина / 100 мкг / мл стрептомицина.
- За 3 часа до трансфекции удалить DMEM и заменить Айскоув"Среды с изменение Дульбеко (IMDM), содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки.
3. Трансфекция вирусных плазмид (~ 1 час для трансфекции, 3 дня инкубации)
- Подготовка следующих за одну партию (5 х 15 см пластины культуре ткани) вируса:
- 62,5 мкг плазмиды AAV
- 125 мкг pFdelta6
- 31,25 мкг pRV1
- 31,25 мкг pH21
- 1650 мкл 2,5 М CaCl 2
- 12 мл дН 2 O
- В классе 2 культуре ткани капот стерильный фильтр трансфекции смесь в 50 мл трубки.
- В то время вортексе решение, быстро добавить 13 мл 2 HEPES х буферном растворе (рН = 7,05). Замените крышку 50 мл трубку и продолжают вихрь в течение 15 секунд. Оставить постоять в течение 1 минуты 45 секунд, мелкий белый осадок должен форме.
- Аккуратно добавить 5 мл трансфекции раствора в каждую 15 см блюдо культуры ткани. Swirl пластин для смешивания и вернуться в инкубаторе.
- 16 часов после трансфекции удалить IMDM средних и заменить DMEM.
4. Лизирующий клеток и уборки rAAVs (2 часа)
- Через 72 часа после трансфекции, удалить СМИ из пластин культуре клеток и выбросьте. Все отходы следует относиться с решением Virkon или других подходящих дезинфицирующих средств.
- Осторожно промыть клетки в теплой 1x фосфатным буферным раствором (PBS, рН 7,4).
- Добавить 25 мл теплой PBS в каждую тарелку и аккуратно удалить соты с ячейкой скребком. Сбор суспензии в 50 мл пробирки.
- Гранул клетки при 800 мкг в течение 10 минут.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис рН 8,0, использовать 10 мл на ткани пластины культуры. Разделение на две 50 мл пробирки.
- Подготовка свежий раствор 10% натрия дезоксихолата в дН 2 O. Добавить 1,25 мл этого в каждую пробирку для конечной концентрации 0,5%. Добавить benzonase нуклеазы до конечной концентрации 50 единиц на мл. Смешайте трубки тщательно.
- Удалить распада клеток путем центрифугирования при 3000 мкг в течение 15 минут. Трансфер в свежем 50 мл трубки, убедитесь, что все ячейки мусор был удален, чтобы предотвратить блокирование гепарин столбцов (см. шаг 5). На этом этапе образцы могут храниться при температуре -20 ° C, прежде чем продолжить. У нас хранятся образцы в течение нескольких недель при температуре -20 ° С без снижения инфективности.
5. Гепарин очистки колонке rAAVs (2 - 3 часа)
- Установка HiTrap гепарин столбцов с помощью перистальтического насоса так, что решения проходят через колонку на 1 мл в минуту для шагов 5,2 до 5,4. Важно, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха вводятся в колонку гепарин.
- Равновесие колонку с 10 мл 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0.
- Применить 50 мл вируса решение колонки и дать течь через.
- Промыть колонку с 20 мл 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0.
- Использование 5 мл шприц продолжают мыть колонке Wго по 1 мл 200 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0, затем по 1 мл 300 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0. Отменить проточные.
- Использование 5 мл шприцев и нежный элюировать давление вируса из колонки, применяя:
- 1,5 мл 400 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0
- 3,0 мл 450 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0
- 1,5 мл 500 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0
- Сбор этих в 15 мл центрифужную пробирку.
6. Концентрация и стерильной фильтрации rAAVs (1 час)
- Концентрат вектора, используя Amicon ультра-4 центробежного фильтра с единицы 100000 молекулярного веса отсечки. Нагрузка 4 мл элюата колонки в концентратор и центрифуге при 2000 мкг в течение 2 минут (при комнатной температуре). Отменить flowthrough и перезагрузите концентратор с оставшийся раствор вируса и повторить центрифугирования. Концентрированный объем должен быть примерно 250 мкл. Если концентрированный объем значительно больше, чем это, отказаться от потока тhrough и продолжают центрифуги в минуту действия, пока объем составляет примерно 250 мкл.
- Добавить 250 мкл PBS, чтобы вирус для конечного объема 500 мкл и удалить из концентратора.
- Фильтры вектора через 13 мм диаметром 0,2 мкм фильтр шприца. Векторные должны быть аликвоты и хранили при температуре -80 ° C до требуется.
7. Titering вирусных акций (3 дня)
Для этого требуется промоутер, который является активным в НЕК293 вождения гена репортера или immunocytochemically обнаружить генный продукт. При производстве вектор, который не совместим с НЕК293 других клеточных линий или первичных культур клеток могут быть использованы.
- Подготовка 18 поли-L-лизин покрытием покровные стекла или 18 скважин слайдов Nunc камеры путем посева НЕК293, чтобы они были 40 - 50% вырожденная. Для титрования Cre-зависимых rAAVs использовать НЕК293, что стабильно выразить Cre рекомбиназы 2.
- Infect каждой лунки с серийными гilutions из AAV вектор (рис. 2A). Используйте 3 скважин в разведении. Мы регулярно добавлять вирус непосредственно в каждую лунку.
- После 72 часов исправить HEK293, добавив равный объем 4% параформальдегида (PFA) и средних (предоставление конечной концентрации 2% PFA) в течение десяти минут при комнатной температуре.
- Вымойте ячейки три раза PBS, промыть в дН 2 O и покровное.
- Подсчитайте количество трансдуцированных клеток из трех скважин, которые имеют высокий коэффициент разбавления, но по-прежнему содержат инфицированные клетки, найти среднее значение этих и умножить на коэффициент разбавления, чтобы дать число инфекционных единиц на микролитр (рис. 2В).
8. Ожидаемые результаты
НЕК293 трансдуцированных с вирусом кодирование расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) показаны на рисунке 2B. Как правило, мы добиться согласованных титры примерно 6 х 10 6 инфекционных частиц в микро-литра. Мы регулярно использовать эти векторы для стереотаксической Инджеction на взрослом мозге грызунов. Это обеспечивает мощную технику для конкретного региона экспрессии генов 2. Для объединения этого региона с специфика камерного типа селективной экспрессии генов мы вводим Cre рекомбиназы-зависимых rAAVs в целевых регионах Cre-трансгенных мышей 2. Рис 2С-Е приведены примеры стереотаксической инъекции Cre-зависимых rAAVs кодирования EGFP в различных регионах мозга взрослого парвальбумина-Cre трансгенных мышах 3.
Рисунок 1. Схематическое изображение протокол для производства rAAV. 1.) НЕК293 высевают и выросли до 70 - 80% слияния. 2.) AAV и помощником плазмид готовятся и трансфицировали в НЕК293. 3.) Средний изменяется обратно на DMEM 16 часов после трансфекции и HEK293 клетки культивировали в течение еще 56 часов. 4.) HEK293 клетки собирают и разрушается. rAAV векторов отделены от клетки мусора на сentrifugation. 5.) Вирусные частицы очищаются через гепарин колонки, прежде концентрации и стерилизации. 6.) HEK293 клетки, выращенные на 24 луночных планшетах и заразить серийные разведения вектора AAV, чтобы определить число инфекционных единиц.
Рисунок 2. Titering и в естественных условиях применения rAAV1 / 2. (А) Настройка НЕК293 для измерения вирусного титра. HEK293 клетки трансдуцированных с серийные разведения rAAVs. С неинфицированных контроль, N 1 мкл неразбавленного вирусных акций. (B) HEK293 клетки, инфицированные rAAVs выражения EGFP. (CE) Вирусный выражение EGFP ограничивается Cre-экспрессирующих нейронов в различных регионах цель парвальбумина-Cre трансгенных мышей после стереотаксической инъекции Cre активированных rAAVs. Примеры изображения показывают GFP иммунореактивности в (С) бледного таламус и ретикулярную глобус, (D) зубчатой извилине и (Е) СА1 области гиппокампа. Д.Г., де-ntate извилины; РТ, ретикулярные ядра таламуса; Г.П., бледного шара. Шкала бары: В, 500 мкм, C, 100 мкм, D, 100 мкм, Е, 500 мкм.
Discussion
rAAV векторы становятся все более ценными для прижизненного исследования на животных. Здесь мы описали простой и недорогой протокол для производства rAAVs, которые могут способствовать широкому применению этого полезного вектор, избегая дорогостоящих услуг сторонних вируса продукции компании. Протокол (на основе справочных 1) описывает производство химерных rAAV1 / 2 векторов, содержащих белки капсида от обоих родительских серотипов при равном соотношении 4. Очистка rAAV векторов путем связывания с гепарином колонн опирается на выражение AAV2 капсид белков, но могут быть объединены с другими серотипами, чем AAV1 изложены здесь. Кроме того, AAV6, как сообщается, связываться с гепарином, хотя и с пониженным сродством, и потенциально может быть очищен с гепарином столбцов с помощью этой процедуры 5,6. Следует отметить, однако, что другие серотипы потребует различных концентраций NaCl для элюирования колонки гепарин 5,7.
Упаковка rAAV геномов было показано, что оптимальное между 4,1 и 4,9 кб с резким сокращением в упаковке КПД до 5,2 кб 8. Эта упаковка предел может считаться крупнейшим недостатком системы rAAV, так как тип клеток-специфического регулирования экспрессии трансгена обычно достигается за счет большого цис-действующих элементов, которые не могут быть удовлетворены за счет мелких частиц AAV. Чтобы преодолеть низкий титр партий, например, в результате попытки пакета генов, которые близки к пределу AAV упаковки мы объединяем отдельные вирусные партиях сосредоточено до 250 мкл в 500 мкл одна партия, а не добавлять PBS как указано в пункте 6.3. Надежная камерного типа конкретных трансдукции может быть достигнуто за счет Cre-драйвера мыши и условных кассеты rAAV (см. ниже), чтобы избежать растяжения упаковки предела.
Следует отметить, что в то время как этот протокол попытки обеспечить легкий в следуйте инструкциям на производство высококачественных тИТЭР rAAV, он требует наличия AAV2 капсида фрагментов белка для очистки гепарин аффинной хроматографии. Серотипов, кроме AAV2 должна быть очищена с помощью альтернативных процедур 9. Одним из преимуществ гепарин очистки столбец считается, производить AAV векторов, которые имеют большую инфекционности темпами, чем, полученной с использованием градиента цезия хлорид 10. Тем не менее, Есть также некоторые недостатки этого метода. Например, другие белки, которые связывают гепарин может также присутствовать в очищенной вирусной акции. Хотя тропизм гепарин-очищенных векторы могут влиять на вектор титр 10, наш подход к конкретно нацелены либо возбуждающих 20 или тормозных нейронов (рис. 2) работает Cre-индуцированной активации AAV-опосредованной экспрессии трансгена и титр-независимыми. Альтернативу гепарину очистки колонка использование iodixanol градиента плотности, которая производит более высокий титр вирусных и чище, чем подготовка использованиецезия градиентом хлорида 10. Этот метод может также сочетаться с гепарином очистки колонке для получения вектора, который больше, чем 99% чистого 11. Таким образом, серьезное внимание должны быть приняты отдельными группами, какие вирусные метод очистки лучше всего подходит для их конкретных приложений вниз по течению.
Наиболее распространенные проблемы, связанные с этим протоколом низкий вирусный титр. По нашему опыту это, как правило, восходят к низкой эффективности трансфекции, или элюирования вируса из гепарин столбцов. Все трансфекции материалы должны быть при комнатной температуре до трансфекции, и проверить трансфекции должны быть выполнены, чтобы найти оптимальные условия в каждой лаборатории. Другие методы трансфекции, таких как lipofectamine, отличаются высокой эффективностью, но может быть слишком дорого. Кроме того, концентрации и рН гепарин решения элюирования колонка имеет решающее значение для полного вымывания вирионов из гепарина witho столбцовут повреждения. Еще одним важным моментом является то, что упаковка клетки должны хорошо прилипают к поверхности блюда тканевой культуры. Если клетки отделяются на определенном этапе во время процедуры рекомендуется прекратить эксперимент и размораживания новый флакон клеток.
Пространственно-временной контроль экспрессии трансгена у грызунов легко достигается точной ориентации анатомических и стадии развития животного. Эффективное AAV-опосредованного переноса генов было показано внутриутробно 12,13. Во взрослом мозге, площадь инфицированных rAAV частиц после стереотаксической инъекции можно регулировать от очень маленьких целевых регионах, гораздо больших площадях не только изменениями в вирусном титре, но и путем изменения параметров впрыска. К ним относятся объем и скорость инъекции, а также включение полиола маннитол с вирусной суспензии 14. Маннитол также может быть использован для повышения заражения различных тканей после системной инъекции rAAV 15 </ SUP>.
Упаковке мощностью rAAV (примерно 4,7 кб), вероятно, наиболее ограничивающим фактором с точки зрения генов, которые могут быть выражены в этих вирусных векторов. Однако, недавние исследования показали, что это может быть частично преодолены путем расщепления больших генов или выражение кассеты на отдельные векторы rAAV и введение моста последовательности, инициируя экспрессию генов, когда вирионы заразить той же клетке 16. Выражение уровне генов, переносимых насекомыми, rAAV также может быть значительно повышена с помощью самостоятельного бесплатный rAAV векторов 17. Стереотаксической инъекции векторов rAAV обеспечивает быстрый, недорогой и мощный метод для стимуляции экспрессии генов в регионе имеет свои особенности. В сочетании с 2-го поколения стратегии РНК-интерференции 18 rAAVs также может быть использован для конкретного региона генов сбить. rAAVs могут быть объединены с Cre-трансгенных мышей или камерного типа конкретных промоутеров для достижения схемы и камерного типа-Специфическая экспрессия генов, позволяющих генетические манипуляции с высоким пространственным разрешением 2,19-21, при монтаже rAAVs, например, с системой тет добавляет временной контроль над вирусом-опосредованной экспрессии генов 22,23. Эти примеры иллюстрируют огромное комбинаторное потенциал этих векторов и прогнозировать быстрый рост rAAV основе исследований за долгие годы.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra centrifugal filters | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
| Hek293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
| HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| 15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
| Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
| Table 1. Specific reagents required for protocol | |||
References
- Klugmann, M. AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats. Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).
- Murray, A. J. Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory. Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).
- Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).
- Hauck, B. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).
- Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors. Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).
- Blankinship, M. J. Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6. Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).
- Wu, Z. Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes. Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).
- Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus. Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).
- Zolotukhin, S. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods. 1, 158-167 (2002).
- Burova, E., Loffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).
- Bilbao, R. Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1. Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).
- Mastakov, M. Y. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).
- Fu, H. Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain. Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).
- Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences. Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).
- Georgiadis, A. AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins. Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).
- Atasoy, D. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Guggenhuber, S. AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity. PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).
- Lawlor, P. A. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).
- Chtarto, A. Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector. Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).
- Han, Y. Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors. Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).
