Summary
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVs）ベクトルはのためにますます貴重になってきています
Abstract
近年、組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、（AAV）動物におけるin vivo試験のためにますます貴重になっており、また現在は、人間の臨床試験で検証されています。野生型AAVは、パルボウイルス科ファミリの非病原性のメンバーと本質的に複製欠損である。幅広い伝達プロファイル、低免疫応答だけでなく、これらのベクトルで達成強いと永続的な導入遺伝子の発現は、それらのin vitroおよび in vivo遺伝子デリバリーのために人気があり、多目的なツールきました。 rAAVsは、簡単かつ安価に実験室で生産し、それらの良好な安全性プロファイルに基づいて行うことができます、一般的に低い安全性の分類が与えられます。ここで、我々はAAV1およびAAV2両方のキャプシドタンパク質を含むキメラrAAVsの生産とタイターのための方法を説明します。これらのいわゆるキメラベクターの使用は、親のような高力価の株式などの血清型（AAV1）と精製の両方の利点を兼ね備えアフィニティークロマトグラフィー（AAV2）による。これらのAAV血清型はすべてのAAV血清型の最も研究であり、そして個々に広い感染性のパターンを持っている。ここで説明するキメラベクターは、AAV1およびAAV2の感染特性を持つ必要がありますので、神経細胞、骨格筋、膵臓、特に腎臓を含む組織の広い範囲を、感染すると予想することができます。メソッドはここで説明するヘパリンカラム精製を使用して、方法は、塩化セシウム勾配を通じて遠心分離のような他の精製法、より高いウイルス力価とクリーンなウイルス製剤を得たと信じていた。さらに、我々はこれらのベクトルを迅速かつ容易に製造感染性粒子の数の正確な読みを与えるために滴定することができる方法について説明します。
Protocol
次のプロトコルをまとめた図は、図1を参照してください。
安全上の注意：組み立てられたウイルス粒子と接触しているすべての材料はVirkon液または他の適切な消毒剤で消毒する必要がある。
1。プラスミドDNAの株式の準備（〜2日間）
- 以下のプラスミドが1必要です。
- pRV1 - AAV2 repおよびcap配列を含有する
- PH21 - AAV1 repおよびcap配列を含有する
- pFdelta6 - アデノウイルスヘルパープラスミド
- AAV2パッケージングシグナル（逆方向末端反復、ITRS）に挟まれた組換え発現カセットを含むプラスミドAAV
- pFdelta6が部分欠失を防ぐためにStbl2コンピテントセルで成長させる必要がありますが、pRV1とPH21はDH5alphaコンピテントセルに成長させることができる。部分的な削除がDH5alpha細胞内で発生した場合はAAVプラスミドはStbl2細胞に成長させることができる。
- プラスミドDNAは高品質とRNAの汚染物質の自由でなければならない。プラスミドは、次のダイジェストを使用して整合性をスクリーニングすることができます。
- pRV1 - XbaIで消化7.5キロバイトと3.8 kbのバンドを与えるために
- PH21 - 4.5kbのバンドを与えるためにEcoRIで消化、2.8 kbと0.2キロバイト
- pFdelta6 - 5.5kbのバンドを与えるためにHindIIIでダイジェスト、3 KB、3 KB、2.3 kbと1.5キロバイト
2。 （ - 3日間2）トランスフェクションのためのヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞の調製
- プレート2個の80％5 15cmの直径Nunc社製組織培養皿にHEK293細胞のコンフルエント150センチメートル2フラスコ。トランスフェクションの前にコンフルエント80％（めっき後約48時間） - 細胞は70でなければなりません。 10％ウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン/ 100μg/ mlのストレプトマイシンを含む低グルコースと標準ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養細胞。
- トランスフェクションの前に3時間は、DMEMを除去し、イスコフと交換の5％ウシ胎児血清を含む改変ダルベッコ培地（IMDM）。
3。ウイルス性プラスミドのトランスフェクション（トランスフェクションのための〜1時間、インキュベーションのための3日間）
- ウイルスの単一のバッチ（5 × 15cmの組織培養プレート）のために、以下を準備します。
- プラスミド62.5μgのAAV
- 125μgのpFdelta6
- 31.25μgのpRV1
- 31.25μgのPH21
- 1650μlの2.5 M CaCl 2を
- 12ミリリットルのdH 2 O
- 50 mlチューブにクラス2の組織培養フード滅菌フィルタートランスフェクション混合物に。
- ソリューションをボルテックスながら、素早く液（pH 7.05）緩衝生理食塩水2 × HEPES 13 mlを加える。 50 mlチューブの蓋を交換し、15秒間ボルテックスし続けます。 1分45秒放置する、微細な白色沈殿物が形成すべきである。
- 静かに各15cmの組織培養皿へのトランスフェクション溶液5mlを加える。スワールプレートが混在し、インキュベーターに戻ります。
- トランスフェクション後16時間は、IMDM培地を除去し、DMEMで置き換えてください。
4。細胞の溶解とrAAVsの収穫（2時間）
- トランスフェクション後72時間は、細胞培養プレートから培地を除去し捨てる。すべての廃棄物は、Virkon液または他の適切な消毒剤で処理する必要があります。
- ゆっくりと（; pH7.4のPBS）緩衝生理食塩水暖かい1 ×リン酸で細胞を洗浄。
- 各プレートに25ミリリットル温かいPBSを加え、穏やかにセルスクレーパーで細胞を取り除く。 50mlチューブ中で懸濁液を集める。
- 10分800 xgで細胞をペレット化する。
- 上清と150mMのNaClでペレットを再懸濁します、20mMのトリスpH8.0を破棄し、組織培養プレートあたり10mlを使用してください。 2つの50 mlチューブに分割。
- のdH 2 Oで10％のデオキシコール酸ナトリウムの新鮮な溶液を調製します最終濃度0.5％のために各チューブには、この1.25 mlを加え。 ml当たり50単位の最終濃度にベンゾナーゼヌクレアーゼを追加。徹底的にチューブを混ぜる。
- 15分間3000 × gで遠心分離によって細胞残屑を取り除きます。新鮮な50 mlチューブに移す、すべての細胞の破片がヘパリンカラム（ステップ5を参照）がブロックされないように削除されていることを確認してください。この段階で、サンプルは、続行する前に-20℃で保存することができます。我々は、感染性を低下させることなく-20℃で数週間サンプルを保存している。
5。 rAAVsのヘパリンカラム精製（2 - 3時間）
- そのソリューションが流れそう〜5.4ステップ5.2の毎分1 mlのカラムを通して蠕動ポンプを使用してセットアップハイトラップのヘパリンカラム。に気泡がヘパリンカラムに導入されていないことを確認することが重要です。
- 10ミリリットル150mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0でカラムを平衡化する。
- カラムを50 mlのウイルス液を適用するとを通して流れるようになります。
- 20ミリリットル100mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0でカラムを洗浄。
- 5 mlのシリンジを使用すると、列wを洗浄し続けます1ミリリットル300mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0のに続いてi番目の1ミリリットル200mMのNaCl、20mMのトリス、pH8.0、。フロースルーを捨てる。
- 適用することにより、カラムから5mlの注射器と穏やかな圧力の溶出ウイルスを使用する：
- 1.5ミリリットル400mMのNaCl、20mMのトリス、pH8.0の
- 3.0ミリリットル450 mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0の
- 1.5ミリリットル500mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0の
- 15 ml遠心チューブに、これらを収集する。
6。濃度とrAAVsの無菌濾過（1時間）
- 10万分子量カットオフを持つアミコンウルトラ-4遠心フィルターユニットを使用してベクトルを集中する。 2分（室温で）2000 xgでコンセントレータと遠心分離機にカラム溶出液4mlをロードする。ろ過液を廃棄し、残りのウイルス液と繰り返し遠心分離でコンセントレータをリロードします。濃縮された量は約250μlのはずです。濃縮されたボリュームがこれよりかなり多い場合は、フローのtを捨てるhroughと体積が約250μlのようになるまで1分のステップで遠心し続けます。
- 500μlの最終容量のためにウイルスをPBS 250μlを加え、コンセントレータから取り外します。
- 13mmの直径0.2μmのシリンジフィルターを通してフィルターベクトル。必要になるまでベクトルを分注し、-80℃で保存してください。
7。ウイルスストックのタイター（3日）
これは、レポーター遺伝子または免疫細胞化学的に検出可能な遺伝子産物を駆動するHEK293細胞において活性であるプロモーターが必要です。 HEK293細胞他の細胞株または初代細胞培養と互換性のないベクトルを生成するときに使用することができます。
- そう彼らが40であることをHEK293細胞を播種が18ポリ- L -リジンコートしたガラス製カバースリップまたはヌンクチャンバースライドの18の井戸を準備 - コンフルエント50％。 Creリコンビナーゼ依存rAAVsの滴定のためにその安定的に発現するCreリコンビナーゼ2 HEK293細胞を使用してください。
- シリアルDの各ウェルに感染AAVベクター（図2A）のilutions。希釈当たり3ウェルを使用してください。我々は日常的に各ウェルに直接ウイルスを追加。
- 後72時間は、室温で10分のために培地（2％PFAの最終濃度を与える）に4％パラホルムアルデヒド（PFA）の等量を追加することで、HEK293細胞を修正。
- 細胞をPBSで3回洗浄し、のdH 2 Oおよびカバースリップですすいでください。
- 最高希釈係数を持つ3つの井戸から、形質導入された細胞の数を数えるが、それでも、感染した細胞が含まれ、これらの平均値を見つけ、マイクロリットルあたりの感染ユニット（図2B）の番号を与えるために希釈係数を掛けます。
8。予想結果
HEK293細胞は、強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を図2Bに示されているウイルスのエンコーディングで形質導入。我々は一般的にマイクロリットルあたり約6 × 10 6感染性粒子の一貫した力価を実現。我々は日常的に定位麟蹄のため、これらのベクターを使用成人の齧歯類の脳にction。これは、地域固有の遺伝子発現2の強力な技術を提供します。細胞型の選択的な遺伝子発現を持つこの地域の特異性を組み合わせるために、我々は、Cre -トランスジェニックマウス2のターゲット領域にCreリコンビナーゼ依存rAAVsを注入する。図2C - Eは、成人のパルブアルブミンのCreトランスジェニックマウス3の異なる脳領域にEGFPをエンコードするのCre依存rAAVsの定位注射の例を示します。
図1。するrAAVの生産のためのプロトコルの模式図。 1）HEK293細胞を播種し、70までに成長している - 80％コンフルエントに。 2）AAVとヘルパープラスミドを調製し、そしてHEK293細胞にトランスフェクトされています。トランスフェクションおよびHEK293細胞は別の56時間培養した後、3）培地は、DMEM、16時間に変更されます。 4）HEK293細胞を回収し、溶解されています。 rAAVベクターはcによって細胞残渣から分離されていますentrifugation。 5）ウイルス粒子が濃縮し、滅菌前にヘパリンカラムを通して精製されています。 6）HEK293細胞を24ウェルプレート上で増殖し、感染単位の数を決定するAAVベクターの連続希釈液で感染されています。
図2。タイターとrAAV1 / 2のin vivoアプリケーションで。ウイルス力価を測定するためのHEK293細胞の（A）のセットアップ。 HEK293細胞は、rAAVsの連続希釈液で形質導入されています。 C、感染していないコントロール、N、未希釈のウイルスストックを1μl。 （B）HEK293細胞はEGFPを発現するrAAVsに感染している。 （CE）ウイルスeGFPの発現は、Creを活性化rAAVsの定位注射後のパルブアルブミンのCreトランスジェニックマウスの別のターゲット地域でCreを発現神経細胞に限定されています。例の画像は（C）網様体視床と淡蒼球、（D）歯状回と海馬の（E）CA1領域におけるGFP免疫反応性を示しています。 DG、ドntate回、RT、視床網様核、GP、淡蒼球。スケールバー：B、500μmであり、C、100μm以下、D、100μm以下、E、500μmである。
Discussion
rAAVベクターは、動物でのin vivo研究にとってますます貴重になってきています。ここで、我々は企業へのウイルスの生産の高価なアウトソーシングを避けることで、この有用なベクトルの広範なアプリケーションを容易にすることができるrAAVsを製造するための簡単で安価なプロトコルを記述している。プロトコルは、（参考文献1に基づいて）等しい比4で、両方の親の血清型からキャプシドタンパク質を含むキメラrAAV1 / 2ベクトルの生産を説明します。ヘパリンカラムに結合することによって、rAAVベクターの精製は、AAV2キャプシドタンパク質の発現に依存していますが、ここで概説AAV1以外の血清型と組み合わせることができます。さらに、AAV6は減少親和性を持つものの、ヘパリンに結合することが報告されており、潜在的にこの手順5,6を用いてヘパリンカラムで精製することができます。それは他の血清型は、ヘパリンカラム溶出5,7のためのNaClの異なる濃度を必要とすること、しかし、注意すべきである。
包装するrAAVのゲノムは5.2 KB 8までのパッケージング効率の大幅な削減と4.1と4.9キロバイトの間で最適であることが示された。導入遺伝子発現の細胞型特異的規制は通常、小型のAAV粒子内に収容することができる要素に作用する大きなシスによって達成されるので、このパッケージングの制限は、するrAAVのシステムの最大の欠点と見なすことができます。このような我々はむしろ、ステップ6.3に概説PBSを追加するよりも、1つ以上の500μlをバッチに250μlのに集中して、別のウイルスのバッチを組み合わせているAAVパッキンの制限に近い場合、パッケージの遺伝子をしようとするから生じるものなど、低力価のバッチを、克服するために。信頼性の高い細胞型特異形質導入は、パッケージングの限界を伸ばし避けるためのCre -ドライバーのマウスと、条件付きするrAAVカセット（下記参照）を組み合わせることにより達成することができます。
ノートの、このプロトコルは高いtの生産にわかりやすい指示を提供しようとしながらITERするrAAVは、それはヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによる精製のためのAAV2キャプシドタンパク質の部分の存在を必要とする。 AAV2以外の血清型は、別の手順9を用いて精製する必要があります。ヘパリンカラム精製の 利点の一つは、それが塩化セシウム勾配10を使用して製造したものよりも大きい感染率を持つAAVベクターを生成すると考えられています。しかし、この方法にはいくつかの欠点もあります。例えば、ヘパリンに結合する他のタンパク質も精製されたウイルスストックで存在することができる。ヘパリン精製ベクターの親和性がベクトル力価10、特に興奮20または抑制性ニューロン（図2）のどちらをターゲットにする我々のアプローチの影響を受けることができるが、AAV介在導入遺伝子の発現のCre -誘発活性化を採用し、力価に依存しません。ヘパリンカラム精製に代わるものを使用するよりも高いウイルス力価と純粋な準備を生成するイオジキサノール密度勾配の使用、です。塩化セシウム勾配10。この方法は、純度99％11より大きいベクトルを生成するためにヘパリンカラム精製と組み合わせることができます。したがって、慎重な検討は、ウイルスの精製法は、その特定のダウンストリームアプリケーションに適しているのと、個々のグループによって行われる必要があります。
このプロトコルに関連付けられている最も一般的な問題は、低ウイルス力価である。私たちの経験では、これは通常、低トランスフェクション効率、またはヘパリンカラムからのウイルスの溶出にさかのぼることができます。すべてのトランスフェクションの材料は、トランスフェクション前に室温になっているはず、とテストのトランスフェクションは、各研究室に最適な条件を見つけるために実行する必要があります。トランスフェクションの他の方法は、リポフェクタミンなど、非常に効率的ですが、法外に高価になることができます。さらに、ヘパリンカラム溶出液の濃度とpHはヘパリンカラムwithoからビリオンの完全な溶出のために重要です。UTの損傷。もう一つの重要なポイントは、パッケージング細胞は組織培養皿の表面によく付着する必要があるということです。細胞が手順の実行中にいくつかの段階でデタッチした場合には、実験を終了し、細胞の新しいバイアルを解凍することをお勧めします。
げっ歯類における導入遺伝子発現の時空間制御が容易に正確な解剖学的ターゲティングと動物の発達段階によって達成されます。効率的なAAVによる遺伝子導入は、子宮内12,13で示されている。成人の脳では、定位注射した後するrAAV粒子に感染して領域のみならず、ウイルス力価の変化によってではなく、注入パラメータを変更することにより非常に大きなエリアに、非常に小さな対象地域から調整することができます。これらは、ボリュームとスピード注射のとウイルス懸濁液14とポリオールマンニトールのインクルードが。マンニトールは、全身するrAAVの注入15日以降の様々な組織の感染性を高めるために使用することができます</>のSup。
するrAAV（約4.7 KB）のパッケージング能力は、おそらくこれらのウイルスベクターから発現することができる遺伝子の点では最も制限要因になります。しかし、最近の研究では、ウイルス粒子が同じセル16に感染するときに遺伝子発現を開始、これは部分的に別々のrAAVベクターに分割する大規模な遺伝子または発現カセットによって克服し、ブリッジング配列を導入することができることを示している。 rAAVベクターによって運ばれる遺伝子の発現レベルも大幅に自己無料のrAAVベクター17を使用することによって高めることができる。 rAAVベクターの定位注入は、地域固有の方法で遺伝子発現を誘導するための、迅速、安価で強力な方法を提供する。組み合わせでは第2世代のRNA干渉戦略の18 rAAVsはまた地域固有のダウン遺伝子ノックアウトのために使用することができます。 rAAVsは、回路や細胞の種類を達成するためのCreトランスジェニックマウスまたは細胞型特異的プロモーターと組み合わせることができます。例：TETシステムとのフィッティングrAAVsがウイルス媒介遺伝子発現22,23上に時間的なコントロールを追加しながら、高空間分解能2,19-21で遺伝子操作を可能にする特異的な遺伝子発現は、これらの例では、これらのベクトルの膨大な組合せの可能性を示し、今後数年間にわたってするrAAVベースの研究の急速な増加を予測。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra centrifugal filters | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
| Hek293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
| HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| 15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
| Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
| Table 1. Specific reagents required for protocol | |||
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