Summary
我们提出了一个可视化生活角质层的方法
Abstract
角质层的C.线虫是一种高度耐药的结构，周围的动物 1-4外部。角质层不仅可以保护环境的动物，但也决定体形和蠕动4-6次的作用。由表皮细胞分泌的几层组成的角质层，包括最外层的脂质层7。
在角质层的圆周脊称为环空中的模式动物的长度， 目前在8发展的所有阶段。 Alae有纵脊目前是在特定的发展阶段，包括L1的dauer，和成人阶段2,9。影响表皮胶原组织的基因突变可以改变表皮结构和动物的身体形态 5,6,10,11 。虽然使用DIC的光学显微镜复合表皮成像是可行的，目前的方法，突出表皮结构包括荧光12％的转基因表达，抗体染色，电子显微镜1。也被用来标记麦胚凝集素（WGA）的可视化表皮糖蛋白，但受限于解决更精细的表皮结构 14 。使用荧光染料染色表皮表面已被观察到，但从来没有在细节 15的特点。我们提出了一个方法来可视化角质层在现场 C. 线虫使用红色荧光亲脂性染料DII（1,1' -双十八烷基- 3，3,3'，3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐），也就是通常用于在 C 线虫可视化环境接触的神经元。这是一个简单可靠的方法，高分辨率的荧光可视化的环空中，alae，外阴，男性的尾巴， 在 C和雌雄同体的尾穗DII染色的优化协议线虫 。
Protocol
1。 DII制备染色
- 准备的20毫克/毫升DII（Biotium公司，公司，海沃德，CA）在DMF原液。 DII是光敏感，所以保护光箔包装DII。
- 每个人口0.6μLDII股票加入到399.4微升M9的创建工作的DII稀释。这应该给最后的30微克/毫升DII在M9的工作液。这可以扩展多个种群同时染色。盾DII在铝箔包装管（S）。
2。线虫的制备
- 包含一个未被污染的线虫人口使用60毫米的钢板。洗轻轻摇动整个板面的液体的圆周运动，放松所有的幼虫和成年动物，动物板，解决了0.5％的Triton X - 100的使用M9的缓冲区。转移到无菌1.5毫升管洗。
- 立即降速在2000转每分钟30秒的动物。取下并丢弃很多SUPernatant尽可能在试管底部，而不会干扰动物的质量。
- 为了减少残留的TRITON X - 100，冲洗动物使用M9的缓冲区，旋转，去除上清液。重复此步骤一次。
- 管和涡简要加入400μL的工作DII M9的解决方案，以重悬在溶液中的动物。
- 摇管在20 ° C水平为3个小时在350 RPM轻保护环境。如果需要的话，动物可以被孵育染色16小时。
- 为了减少未结合的染料量，自旋向下的动物，在2000转，持续20秒。删除尽可能上清液丢弃，而不会干扰动物的质量。
- 在400μLM9的缓冲区，并倒到无细菌的接种与OP50 E.一个NGM琼脂板部分液体悬浮动物大肠杆菌 。让动物恢复至少30分钟。在恢复时间的动物应该爬远离DII染色液体到食品。这一步免费直接投资收益减少背景荧光。
3。安装和观察标本
- 使用高压灭菌器或微波熔体4％水琼脂。
- 创建可重复使用的垫片，可用于确保琼脂板厚度均匀，分层两件实验室磁带载玻片上。共两个间隔的幻灯片。
- 两个间隔幻灯片之间安排一个洁净的载玻片。移液器熔化的4％到洁净的载玻片中心琼脂约150μL（四滴）。迅速覆盖使用一个额外的幻灯片的形式琼脂垫熔化的琼脂。小心地取下封面幻灯片，安装幻灯片的顶部为中心的垫。
- 移液器约5μL线虫麻醉（100微米 - 1毫米左旋咪唑，例如，）上垫。
- 山8 - 12只动物在麻醉剂，并与显微镜的盖玻片覆盖。
- 使用装有至少40倍objecti的化合物或共聚焦显微镜观察动物 VE和一个DsRed的/ TRITC（或其他兼容）过滤器。激发最大的投资收益为549纳米，其最大发射约束染料（Biotium公司，公司，海沃德，CA）是565纳米。
4。代表性的成果
DII污渍角质层的野生型和突变株C.线虫 。表皮表面含有环空中圆周沟分开，并在某些阶段，纵脊alae。每个发展阶段有2个不同成分的表皮结构。 alae和环空中的山脊或沟荧光染色，取决于表面成分，整个幼虫和成年阶段，仍然可见使用这种方法恢复后的一天。有时观察到的背景荧光斑点（图2F，G）的，但不是常规（图1，图2A - E，H，我）。所有图像旋转盘共聚焦或时指出，广角（WF）复合显微镜。
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图1。 DII污渍角质层和环境接触的神经元。 L2阶段的动物。 630x放大倍率。马赛克图像部分使用iVision - Mac软件（BioVision的技术，位于宾夕法尼亚州Exton）被抓获。使用Adobe Photoshop CS3（Adobe系统公司，加利福尼亚州圣何塞）加入图像。比例尺= 10微米。 DII还荧光污渍amphid phasmid感觉神经元的头部和尾部分别为（箭头标记一些）。
图2。 DII C.荧光污渍线虫角质层后胚胎发育的各个阶段 。 630x放大倍率。比例尺= 10微米。野生型动物染色）L1，B）二级C）的dauer，D）三级，E）L4;和F）成人阶段。在L1和的dauer动物alae和环形脊荧光染色（A，C）。 DII污渍二级动物的环形脊（二）。环形沟L3和L4动物（D，E）染色。在alae沟和环空中成年动物（FH）的染色。 Alae是由二，五，或三个脊（L1，的dauer，或成年动物，分别）运行长度的动物（箭头）16。环空中创建圆周周围的动物脊（箭头，F和J）。角质层成人突变动物显示温和的表皮组织缺损（GH）。 G）alae的脊不连续（WF）。高）编外alae脊融合和分支或分叉（WF）。胶原蛋白基因的突变体表现alae和环形组织缺损（IJ）。 i）在过表达转基因动物pRF4（ROL - 6（su1006）），alae谎言脊动物的长度角度。 J）在转基因动物的过度表达pRF4（ROL - 6（su1006））环空中显示一个不规则的图案。
图3。为extern人的形态结构，照亮了DII染色。630x放大倍率。比例尺= 10微米。 DII还突出等外观特征，包括一）成人雌雄同体外阴，B）的成年雄性的尾巴射线和风扇和C）雌雄同体的尾穗（在这种突变的背景分叉）。
图4。角质层需要更长的时间比环境接触的神经元与DII染色。 630x放大倍率。比例尺= 10微米。经过两个小时的染色，amphid（未显示）和phasmid感觉神经元（箭头）有足够的染色。相比之下，年轻动物的角质层只是部分补丁（箭头）染色。
| 洗 | 染色解决方案（DII） | 孵育时间 | 角质层染色 |
| M9的± 0.5％TRiton X - 100 | M9 + 0.5％的Triton X - 100 | 2小时 | 没有 |
| M9 + 0.5％的Triton X - 100 | M9 + 0.5％的Triton X - 100 | 3小时 | 没有 |
| M9 + 0.5％的Triton X - 100 | M9 | 2小时 | 部分 |
| M9 + 0.5％的Triton X - 100 | M9 | 3小时 | 是 |
| M9 + 0.5％的Triton X - 100 | H 2 O | 2小时 | 部分 |
| M9 + 0.5％的Triton X - 100 | H 2 O | 3小时 | 是 |
表1。表皮染色，在不同的条件下，各种孵化的解决方案和时间进行了测试，以优化在动物表皮染色。 H 2 O，无菌蒸馏水。部分染色表明幼虫角质层片状染色（图4），虽然成人角质层污渍的彗星onsistently。
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Discussion
这里介绍DII的染色方法，允许一个相对快速和方便的方法来可视化的角质层线虫。再利用和优化常用的图像环境暴露15,17感觉神经元的方法，直接投资收益可用于荧光染色alae和环状结构（图1和2），以及外阴，男性的尾巴，和雌雄同体的尾穗（图3）。我们发现，洗液和时间的影响的直接投资收益的能力，始终染色的角质层（表1，图4）。 DII染色环境暴露的神经元的方法使用两个小时的孵育时间M9 TRITON X - 100 15。 M9与表面活性剂的初始洗TRITON X - 100有助于消除从表皮表面的污染和防止结块动物。然而，在同一个缓冲区染色液孵化三个小时的动物防止染料染色的角质层（表1）。这可能是引起血脂线虫表面上被剥夺了在洗涤剂溶液治疗。潜伏期的动物DII污渍角质层的水，表明M9盐溶液不是DII角质层染色的要求。虽然水为基础的协议是神经元DII染色15的建议，我们发现，动物治疗这种方式往往出现不健康的。洗衣机在0.5％的动物简要Triton X - 100在M9的的，在染色液三个小时的孵化与M9的表皮结构，提供一致的染色和维护动物福祉。
动物可以获救后的观察和维护，允许直接下游分析。这种方法是一种方便的工具，它可以在许多研究中使用，包括但不限于，表皮的分泌和组织，表皮细胞的发育，heterochronic基因的途径，和线虫的演变。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢S.塔内加- Bageshwar，K. Beifuss，S. Kedroske，和HC。萧为有益的讨论。这项工作是由从分子和细胞医学TAMHSC系的启动资金。该化合物的范围和旋转盘购部门和TAMHSC院长办公室提供的资金。一些菌株提供了线虫遗传学中心，这是由国家研究资源中心资助。 pRF4（ROL - 6（su1006））答：消防的礼物。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
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