Summary
Vi præsenterer en metode til at visualisere neglebånd i live
Abstract
De neglebånd af C. elegans er en meget modstandsdygtig struktur, der omgiver det ydre af dyret 1-4. Neglebånd ikke kun beskytter dyr fra miljøet, men også bestemmer kropsform og spiller en rolle i motilitet 4-6. Flere lag, der udskilles af epidermale celler består af neglebånd, herunder en yderste lipid lag 7.
Omkredsen riller i hårstrået kaldes annuli mønster længden af dyret og er til stede i alle faser af udvikling 8. Alae er langsgående kamme, der er til stede under bestemte stadier af udvikling, herunder L1, Dauer og voksne stadier 2,9. Mutationer i gener, som påvirker cuticular kollagen organisationen kan ændre cuticular struktur og dyrs krop morfologi 5,6,10,11. Mens cuticular billeddannelse ved hjælp af sammensatte mikroskopi med DIC optik er muligt, de nuværende metoder, der fremhæver cuticular strukturer omfatter fluorescerendecent transgenet udtryk 12, antistof farvning 13, og elektronmikroskopi 1. Mærket hvedekim agglutinin (WGA) er også blevet brugt til at visualisere cuticular glycoproteiner, men er begrænset i at løse finere cuticular strukturer 14. Farvning af cuticular overflade med fluorescerende farvestof er blevet observeret, men aldrig karakteriseret i detaljer 15. Vi præsenterer en metode til at visualisere neglebånd i levende C. elegans med den røde fluorescerende lipofile farvestof DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat), der er almindeligt anvendt i C. elegans at visualisere miljømæssigt udsatte neuroner. Dette optimeret protokol til DII farvning er en enkel og robust metode til høj opløsning fluorescerende visualisering af annuli, alae, vulva, mandlige hale, og hermafrodit hale spike i C. elegans.
Protocol
1. Udarbejdelse af Dii pletten
- Forbered en stamopløsning på 20 mg / ml DII (Biotium, Inc., Hayward, CA) i DMF. DII er lysfølsomt, så beskytte DII mod lys ved indpakning i folie.
- Opret en arbejdsgruppe fortynding af Dii ved at tilsætte 0,6 μL DII materiel til 399,4 μL M9 for hver population. Dette skulle give en endelig arbejder fortynding af 30 mikrogram / ml Dii i M9. Dette kan skaleres op til farvning flere befolkningsgrupper samtidigt. Shield DII mod lys af indpakning røret (r) i folie.
2. Udarbejdelse af nematoder
- Brug en 60 mm plade med en befolkning på uforurenet nematoder. Vask dyr fra pladen ved hjælp af en opløsning af 0,5% Triton X-100 i M9 buffer ved forsigtigt hvirvlende væske i en cirkulær bevægelse hen over overfladen af pladen til at løsne alle larver og voksne dyr. Overfør skylles ud i et sterilt 1,5 ml rør.
- Umiddelbart spin ned dyrene ved 2000 rpm i 30 sek. Fjern og kassér så meget supernatant som muligt uden at forstyrre massen af dyr på bunden af røret.
- For at reducere residual Triton X-100, skylles dyr ved hjælp af M9 buffer, spin, og fjern supernatant. Gentag dette trin én gang.
- Tilsæt 400 μL af arbejdstid DII løsning M9 til røret og vortex kort resuspendere dyr i løsningen.
- Ryst rør ved 20 ° C vandret i 3 timer ved 350 omdrejninger i minuttet i en lys-beskyttet miljø. Hvis det ønskes, kan dyr inkuberes op til 16 timer efter farvning.
- For at reducere mængden af ubundet farvestof, spin ned dyrene ved 2000 rpm i 20 sek. Fjern og kassér så meget supernatanten som muligt uden at forstyrre massen af dyr.
- Resuspender dyr i 400 μL M9 buffer og hælde væske på en bakterie-fri del af en NGM agarplade tilsået med OP50 E. coli. Give dyrene mulighed for at genvinde mindst 30 minutter. Under inddrivelse tid dyrene skal kravle væk fra DII farvning flydende og på maden. Dette trinreducerer baggrundsfluorescens fra gratis DII.
3. Montering og observere prøver
- Smelt 4% agar i vand ved hjælp af en autoklave eller en mikrobølgeovn.
- Opret genbruges afstandsstykker, som kan bruges til at sikre en ensartet tykkelse agar pad, ved layering to stykker af lab tape på et objektglas. Lav to spacer dias alt.
- Arranger et rent objektglas mellem to spacer dias. Pipette omkring 150 μL (fire dråber) af smeltet 4% agar på midten af den rene objektglas. Hurtigt dække den smeltede agar ved hjælp af et ekstra skub til at danne en agar pad. Fjern forsigtigt låget glide, holde puden centreret på toppen af den stigende dias.
- Pipette ca 5 mikroliter af nematoder bedøvelse (100 mM - 1 mm levamisol, for eksempel) på puden.
- Mount 8 til 12 dyr i narkose og dæk med et mikroskop dækglas.
- Observere dyrene ved hjælp af en forbindelse eller konfokal mikroskop udstyret med mindst 40x formål, be ve og en DSRed / TRITC (eller andre kompatible) filter. Den fluorescens excitation maksimalt DII er 549 nm og dets emission maksimale er 565 nm for bundet farvestof (Biotium, Inc., Hayward, CA).
4. Repræsentative resultater
Dii pletter neglebånd af vildtype og mutant C. elegans. Den cuticular Overfladen indeholder annuli adskilt af omkredsen furer og i nogle faser, langsgående kamme kaldet alae. Hver udviklingsstadiet har cuticular strukturer med forskellige kompositioner 2. Højderygge eller furer af både alae og annuli fluorescens-pletter, afhængigt af overfladen sammensætning, hele larver og voksne stadier og forbliver synligt op til en dag efter helbredelse ved hjælp af denne metode. Baggrund fluorescerende pletter er undertiden observeret (figur 2F, G), men ikke rutinemæssigt (figur 1, figur 2A-E, H, I). Alle billeder blev taget med spinning disk konfokal eller, når det bemærkes, widefield (WF) sammensatte mikroskopi.
ENT ">
Figur 1. Dii pletter neglebånd og miljømæssigt udsatte neuroner. L2 fase dyr. 630x forstørrelse. Mosaik billede dele blev indfanget med ivision-Mac-software (BioVision Technologies, Exton, PA). Billeder blev forenet ved hjælp af Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA). Skala bar = 10 ìm. Dii også fluorescens-pletter amphid og phasmid sensoriske neuroner i hoved og hale henholdsvis (pile markere nogle).
Figur 2. Dii fluorescens-pletter C. elegans neglebånd i alle faser af post-embryonale udvikling. 630x forstørrelse. Skala bar = 10 ìm. Farvning af vildtype dyr i A) L1, B) L2; C) Dauer, D) L3, E) L4, og F) voksne stadier. Den alae og ringformede kamme er fluorescens farves i L1 og Dauer dyr (A, C). Dii pletter ringformede ridges i L2 dyr(B). Annular furer plet i L3 og L4 dyr (D, E). De furer af alae og annuli farves hos voksne dyr (FH). Alae er sammensat af to, fem eller tre riller (i L1, Dauer, eller voksne dyr, henholdsvis), der kører længden af dyret (pile) 16. Annuli skabe omkredsen kamme omkring dyret (pilespidser, F og J). Neglebånd af voksne mutant dyr vise moderat cuticular organisation defekter (GH). G) højderygge af alae er diskontinuerlig (WF). H) Overtallige alae kamme er smeltet og forgrenede eller tvedelt (WF). Kollagen genet mutanter udviser alae og ringformede organisation defekter (IJ). I) i transgene dyr overekspression pRF4 (rol-6 (su1006)), højderygge af alae ligger i en vinkel til længden af dyret. J) Annuli i transgene dyr overekspression pRF4 (rol-6 (su1006)) vise et uregelmæssigt mønster.
Figur 3. ExternAl morfologiske strukturer er oplyst af Dii farvning. 630x forstørrelse. Skala barer = 10 ìm. Dii fremhæver også andre udvendige funktioner, herunder A) voksne hermafrodit vulva, B) voksne mandlige hale stråler og blæser, og C) hermafrodit hale spike (kløvet i denne mutant baggrunden).
Figur 4. Cuticle tager længere tid at pletten med DII end miljømæssigt udsatte neuroner. 630x forstørrelse. Skala bar = 10 ìm. Efter to timers farvning, er amphid (ikke vist), og phasmid sensoriske neuroner (pile) i tilstrækkelig grad plettet. I modsætning hertil er hårstrået af yngre dyr kun delvist farves i lapper (pilespids).
| Vask | Stain-løsning (+ DII) | Inkubationstiden | Cuticle farvede |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 2 timer | ingen |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 + 0,5% Triton X-100 | 3 timer | ingen |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 2 timer | delvise |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | M9 | 3 timer | ja |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 2 timer | delvise |
| M9 + 0,5% Triton X-100 | H 2 0 | 3 timer | ja |
Tabel 1. Cuticular farvning under forskellige betingelser. Forskellige inkubation løsninger og tidspunkter blev testet til at optimere cuticular farvning hos dyr. H 2 0, sterilt destilleret vand. Delvis farvning indikerer pletvist farvning af larver neglebånd (Figur 4), selvom voksne neglebånd pletter consistently.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den DII farvningsmetode præsenteres her giver mulighed for forholdsvis hurtig og bekvem måde at visualisere neglebånd i C. elegans. Ved nyorientering og optimere en metode, der almindeligvis anvendes til billede miljømæssigt udsatte sensoriske neuroner 15,17, kan DII bruges til fluorescens plet både alae og ringformede strukturer (figur 1 og 2), samt vulva, mandlige hale, og Hermafrodit hale spike (Figur 3). Vi har konstateret, at inkubationstid løsning og tid indflydelse på evne til DII konsekvent at farve i hårstrået (Tabel 1, Figur 4). Metoden til DII farvning miljømæssigt udsatte neuroner anvender en to-timers inkubationstid i M9 med Triton X-100 15. En indledende vask af M9 med det overfladeaktive Triton X-100 hjælper med at fjerne forurening fra cuticular overfladen og forhindrer, at dyr fra klumpe. Men inkubere dyrene tre timer i en farvning løsning i samme buffer forhindrer farvestof fra farvning neglebånd (Tabel 1).Dette kan være forårsaget af lipider på den nematode overflade, der krængede af længere behandling i rengøringsmiddel. Inkubation af dyr i vand med DII pletter neglebånd, angiver, at M9 saltopløsning ikke er nødvendig for DII farvning af neglebånd. Selv om en vand-baseret protokol anbefales til neuronal DII farvning 15, finder vi, at dyr behandles på denne måde optræder ofte usunde. Vask dyr kort i 0,5% Triton X-100 i M9, efterfulgt af en tre-timers inkubation i farvning løsning lavet med M9, giver konsekvent farvning af cuticular strukturer og vedligeholder trivsel af dyrene.
Dyr kan blive reddet efter observation og vedligeholdes, således at direkte downstream analyser. Denne metode er et praktisk værktøj, der kan bruges i mange undersøgelser, herunder men ikke begrænset til, cuticular sekretion og organisation, epidermal celle udvikling, heterochronic gen veje, og nematode evolution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke S. Taneja-Bageshwar, K. Beifuss, S. Kedroske, og HC. Hsiao for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev finansieret af startfonde fra TAMHSC Institut for Molekylær og Cellulær Medicin. Den sammensatte omfang og spinning disk blev købt med midler fra afdelingen og TAMHSC Kontor dekanen. Nogle stammer, blev tilvejebragt af Caenorhabditis Genetik Center, som er finansieret af National Center for Research Resources. pRF4 (rol-6 (su1006)) var en gave fra A. Fire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Biotium, Inc. | 60010 | Stock dilution: 20 mg/mL in DMF working dilution: 30 mg/mL |
| DMF (Dimethylformamide) | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Triton X-100 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) | VWR international | EM-9410 | |
| M9 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1mM MgSO4) | |||
| NGM (Nematode growth medium) | IPM Scientific, Inc. | 11006-501 | Can be prepared following NGM agar protocol18 |
| Agar-agar | EMD Millipore | 1.01614 | 4% in water |
| Levamisole (Levamisole hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM levamisole as required |
| Microscope slides | VWR international | 16005-106 | |
| Microscope cover glasses | VWR international | 16004-302 | |
| Compound scope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives to match the needs of the experiment |
| TRITC or other compatible filter | Chroma Technology Corp. | 49005 | ET - DSRed (TRITC/Cy3) sputtered filter set |
References
- Cox, G. N., Kusch, M., Edgar, R. S. Cuticle of Caenorhabditis elegans: its isolation and partial characterization. The Journal of Cell Biology. 90, 7-17 (1981).
- Cox, G. N., Staprans, S., Edgar, R. S. The cuticle of Caenorhabditis elegans. II. Stage-specific changes in ultrastructure and protein composition during postembryonic development. Dev. Biol. 86, 456-470 (1981).
- Hall, D., Altun, Z. C. elegans Atlas. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Page, A. P., Johnstone, I. L.
- Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55, 555-565 (1988).
- Mende, N. von, Bird, D. M., Albert, P. S., Riddle, D. L. dpy-13: a nematode collagen gene that affects body shape. Cell. 55, 567-576 (1988).
- Blaxter, M. L. Cuticle surface proteins of wild type and mutant Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 268, 6600-6609 (1993).
- Costa, M., Draper, B. W., Priess, J. R. The role of actin filaments in patterning the Caenorhabditis elegans cuticle. Dev. Biol. 184, 373-384 (1997).
- Sapio, M. R., Hilliard, M. A., Cermola, M., Favre, R., Bazzicalupo, P. The Zona Pellucida domain containing proteins, CUT-1, CUT-3 and CUT-5, play essential roles in the development of the larval alae in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol.. 282, 231-245 (2005).
- Johnstone, I. L. Cuticle collagen genes. Expression in Caenorhabditis elegans. Trends Genet. 16, 21-27 (2000).
- Kramer, J. M., French, R. P., Park, E. C., Johnson, J. J. The Caenorhabditis elegans rol-6 gene, which interacts with the sqt-1 collagen gene to determine organismal morphology, encodes a collagen. Mol. Cell Biol. 10, 2081-2089 (1990).
- Thein, M. C. Caenorhabditis elegans exoskeleton collagen COL-19: an adult-specific marker for collagen modification and assembly, and the analysis of organismal morphology. Dev. Dyn. 226, 523-539 (2003).
- McMahon, L., Muriel, J. M., Roberts, B., Quinn, M., Johnstone, I. L. Two sets of interacting collagens form functionally distinct substructures within a Caenorhabditis elegans extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 14, 1366-1378 (2003).
- Link, C. D., Ehrenfels, C. W., Wood, W. B. Mutant expression of male copulatory bursa surface markers in Caenorhabditis elegans. Development. 103, 485-495 (1988).
- Tong, Y. G., Burglin, T. R. Conditions for dye-filling of sensory neurons in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Methods. 188, 58-61 (2010).
- Singh, R. N., Sulston, J. E. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148, 187-200 (1998).
- Brenner, S.
