Summary
Den här artikeln beskriver en mångsidig metod för att skapa-cellerna vävnad ringar av cellulära självorganisering. Glatta muskelceller seedade i ringformade agarose brunnar aggregera och avtal om att bilda robusta tredimensionella (3D) vävnader inom 7 dagar. Millimeter-skala vävnad ringar bidrar till mekanisk provning och fungerar som byggstenar för mjukpapper montering.
Abstract
Varje år hundratusentals patienter genomgår bypass-kirurgi i USA. 1 Cirka en tredjedel av dessa patienter inte har lämpliga autolog levererande fartyg på grund av sjukdomsprogression eller tidigare skörd. Syftet med kärlvävnad engineering är att utveckla ett lämpligt alternativ källa för dessa bypass ympkvistar. Dessutom kan konstruerad kärlvävnad vara värdefulla som levande vaskulär modeller för att studera hjärt-kärlsjukdomar. Flera lovande metoder för fartyg teknik blod har undersökts, med många nya studier med fokus på utveckling och analys av cellbaserade metoder. 2-5 Häri presenterar vi en metod att snabbt själv montera celler i 3D vävnad ringar som kan användas i vitro modell vaskulära vävnader.
För att göra detta, är suspensioner av glatta muskelceller seedade i rundbottnad ringformig agaros brunnar. Den icke-vidhäftande egenskaper agarosen gör ee celler att bosätta sig, samlade och avtal kring ett inlägg i mitten av brunnen för att bilda en sammanhängande vävnad ring. 6,7 Dessa ringar kan odlas i flera dagar före skörd för mekaniska, fysiologiska, biokemiska eller histologiska analys. Vi har visat att dessa celler som härrör från vävnader ringar avkastning på 100-500 kPa brottgräns 8 som överstiger värdet rapporterats för andra tekniska konstruktioner vävnad vaskulära odlade för liknande löptider (<30 kPa). 9,10 Våra resultat visar att den kraftiga cell -derived kärlvävnad ringen generationen kan uppnås inom en kort tid, och ger möjlighet för direkt och kvantitativ bedömning av bidragen av celler och cell-derived matris (CDM) till kärlvävnad struktur och funktion.
Protocol
1. Cell seedning mögel tillverkning
Börja med fräs en 1 / 2 "tjock bit av polykarbonat för att skapa 15, rund botten, ringformade brunnar med ett centrum inlägg diameter på 2 mm. Frästa kanaler 6 mm djup och 3,75 mm breda. Rengör och torka polykarbonat mögel att ta bort plast skräp från fräsning processen.
Blanda Polydimetylsiloxan (PDMS) på ett 10:01-förhållande (w / w) av bas att härdare, Degas att ta bort alla luftbubblor, och häll på polykarbonat mögel. Degas igen för att undanröja eventuella återstående bubblor, och bota i ugnen på 60 ° C i 4 timmar.
Härdat försiktigt bort PDMS mallen genom att långsamt skala bort den från polykarbonat, tvätta med tvål och vatten och autoklav. Även autoklav en lösning med två procent Agar (w / v) upplöst i Dulbecco ändrade Eagle medium (DMEM).
Placera PDMS mallen på en plan yta och fyll med smält AGA steg genom att först pipettering agaros till var och en av formarna mitt inlägg, och sedan pipettera in i utrymmet runt den. Låt agarosen stelna (ca 15 minuter), sedan vända formen att släppa agarosen från PDMS. Klipp över agarosen runt var och en av brunnarna, och placera agarosen brunnar i 12-bra plattor.
2. Cellodling och ring sådd
Lägg till media cellkultur (DMEM med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin) runt utsidan av agaros mögel, utan att täcka upp i formar. Placera plattorna i inkubatorn och låt dem jämvikta i cirka 15 minuter medan du förbereder cellerna.
Vid 90% sammanflödet, trypsinize råtta aorta glatta muskelceller (rSMCs) och resuspendera vid en koncentration av 5x10 6 celler / ml. Pipettera 100 mikroliter cellsuspension i varje av de ringformade agaros brunnar, med en cirkelrörelse att tillämpa celler i varje brunn.
innehåll "> Se till inkubatorn hyllorna nivå, placera sedan plattorna i inkubatorn och låt dem sitta ostört i 24 timmar. Exchange medelstora varannan dag därefter av aspirering media från hela väl, och påfyllning varje brunn tills agarosen är väl helt under vatten.3. Tissue ring skörd och tjockleksmätning
Vid slutet av kultur, ta bort ringen från agarosen formen genom att skjuta den över toppen av mitt inlägg.
Placera ringen i en liten petriskål med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS), centrum provet, och skaffa en bild med en digital bildbehandling system.
Använd ett program för bildanalys för edge upptäcka och mäta tjockleken på ringen i 4 lägen (övre, undre, vänster och höger) runt dess omkrets. Beräkna medelvärdet tjockleken värdet (t) för varje enskild ring, och använda detta värde för att beräkna tvärsnittsarean(2π (t / 2) 2).
4. Mekanisk provning av ringar
Ställ upp dragprovningsmaskin (Instron EPS 1000) i horisontellt läge. Bifoga en 1N ± 1mN lastcell och anpassade tunna grepp tråd (skapad genom att böja tråd av rostfritt stål).
Montera ringen prov på de två tunn tråd grepp. Förläng grepp tills en 5 mN tara lasten appliceras på provet. Ange den tvärsnittsarea (räknat från tjocklek mätningar) och registrera mätlängd.
Pre-cykel ringarna 8 gånger mellan tara belastning och 50 kPa stressen med en hastighet av 10 mm / min. Efter åttonde pre-cykeln, dra att misslyckas vid 10 mm / min. Fel noteras som en minskning i kraft med 40% från en mätning till nästa. För varje ring prov, mäta den ultimata dragspänning (UTS) och misslyckande stam och beräkna den högsta tangerar modulus (MTM) från den förvärvade data.
5. Tissue ringen somtering för att tillverka vävnad rör
Anpassade röret innehavare är svarvade ur runda 5 cm polykarbonat skivor med rektangulära inskärningar (2 cm x 3 cm). Borra gängade hål genom dessa skivor att låta två hållare som ska skruvas ihop. Autoklav den anpassade röret innehavare, och sedan överföra till biosäkerhet skåpet och placera i en tom petriskål.
Använd kirurgisk sax för att klippa ändarna på 1,9 silikon mm rör i en vinkel för att skapa fasade kanter och sedan autoklaveras silikon rör. Medan rören håller på att autoklaveras, fyll en petriskål med media.
Ta bort ringarna från agarosen brunnar och placera dem i petriskål med media. Placera autoklaveras silikon rören i samma petriskålen att blöta dem före användning.
Använd pincett för att placera en avfasade änden av en silikonslang i mitten av en ring och försiktigt skjut ringen på silikonslangar. Upprepa med önskat antal riNGS. Skjut ringarna i kontakt med varandra genom att försiktigt trycka dem successivt i båda riktningarna längs röret. Denna metod kan användas för ringar skördas efter bara en dag i kulturen.
När ringarna är monterade, rikta in silikon slangar i polykarbonat innehavare och skruva de två delarna av innehavaren tillsammans. Placera hållaren i en 100 mm petriskål och tillsätt 55 ml media. Börsen media varje 3 dagar under hela kulturen.
För att ta bort vävnaden rör, släpp silikon rören från polykarbonat hållaren och använda pincett för att skjuta vävnaden rören från silikonslang och in i en petriskål fylld med PBS.
6. Representativa resultat:
När protokollet utförs korrekt, samlade celler för att bilda vävnad ringar med en inre diameter som motsvarar diametern på motsvarande mögel post inom 24 timmar. Ringen kanterna är släta oftast i utseende och (om culturED på en plan yta), är enhetliga i tjocklek runt hela omkretsen. Vävnaden ringarna är lätta att hantera och kan avlägsnas från sina brunnar för efterföljande mekanisk och histologisk analys (se Gwyther et al. 2011 8). Tissue ring morfologi, matris sammansättning och mekaniska egenskaper varierar beroende på antal och typ av seedade celler.
Representativa resultat från vävnad ringar gjorda av olika celltyper, sådd förhållanden och kultur längd visas i tabell 1. Två mm ID ringar skapas från 5x10 5 rSMCs uppvisade en högre UTS än ringar skapas från vår tidigare publicerade 2 mm ringar (tillverkad av 6.6x10 5 rSMCs). 8 Liknar råtta celler, mänskliga glatta muskelceller (hSMC) lätt ihop för att bilda vävnad ringar, som innehöll en stor mängd av kollagen efter bara 14 dagar i kulturen (data visas inte). Mänskliga mesenkymala stamceller (hMSC) aggregerade också och bildade sammanhängande ringar, men lacked mekanisk hållfasthet och bröt under de inledande precycling faserna av enaxlig dragprovning.
| n | Mobilnummer | Tjocklek (mm) | Längd på kultur (dagar) | UTS (kPa) | MTM (kPa) | Fel stam (mm / mm) | |
| rSMC ringar | 6 | 660 tusen | 0,94 ± 0,12 | 14 | 97 ± 30 | 497 ± 91 | 0,50 ± 0,08 |
| rSMC ringar | 4 | 500 tusen | 0,53 ± 0,02 | 7 | 113 ± 8 | 189 ± 15 | 0,88 ± 0,05 |
| hSMC ringar | 3 | 750 tusen | 0,51 ± 0,05 | 14 | 160 ± 30 | 270 ± 20 | 0,92 ± 0,08 |
| hMSC ringar | 3 | 750 tusen | 0,40 ± 0,07 | 14 | N / A | N / A | N / A |
Tabell 1. Tabell över den kultur parametrar och mekaniska egenskaper av 2 mm ringar som genereras från olika celltyper, sådd koncentrationer, och löptider kultur.
Figur 1. (A) Schematisk bild av vävnaden ringen generation process. (B) Egen polykarbonat form med frästa ringformig brunnar. Centrala inlägg diameter är 2 mm. (C) PDMS mall efter att det skalade bort från polykarbonat mögel. (D) Aggregerade vävnad ring odlas i en agaros mögel med en 2 mm stolpe. (E) Två mm vävnad ring i PBS. Skala staplar = 6 mm (B, C) och 2 mm (D, E).
Figur 2. Representant plot av stress-töjningskurvan produCED från enaxlig dragprovning.
Discussion
Nyligen har det funnits ett ökat intresse för cell-eller "byggnadsställning-less" tissue engineering metoder för att hantera några av de begränsningar schavotten tillvägagångssätt vävnadsteknik. Med tanke på att-cellerna vävnader skapas från celler och matrix de producerar, de i sig innehåller mycket högre cell densitet, innehåller inga exogena material, och kan göras helt från mänskliga celler och proteiner. Blodkärl transplantat gjorda av mänskliga celler kan uppnå betydande hållfasthet i avsaknad av exogena ställningar (t.ex. brast trycket 3400 mmHg jämfört med 1600 mmHg för mänskliga ytlig ven) 12. Även om cellbaserade kärlvävnader uppvisar förbättrade celltäthet och mekanisk hållfasthet, senaste metoderna tillverkning (t.ex. "sheet-baserade engineering" 3,4,12 eller "bioprinting" 5,13) kräver omfattande kultur perioder (> 3 månader) eller specialiserad utrustning för 3D vävnad konstruktion. Den-cellerna vävnad ring metoderOD beskrivs här möjliggör snabb cellulära självorganisering för att bilda kraftfulla 3D vävnad konstruktioner inom en kort tid och utan användning av specialutrustning.
Detta protokoll detaljer för vi utvecklat för att skapa 2 mm innerdiameter råtta glatt muskulatur-cellerna vävnad ringar. I det aktuella exemplet var vävnad ringar odlade i 7 dagar (då odlade i ytterligare 7 dagar för ring fusion och rör bildning). Men 2 mm råtta (och mänskliga) kan glatt muskulatur cellen ringar tas bort från brunnarna och är sammanhängande nog för hantering (t.ex., överföring på silikon rör) så tidigt som en dag efter cell sådd. Dessutom kan robusta vävnad ringar med olika inre diametrar (2, 4 och 6 mm) skapas med denna metod genom att helt enkelt ändra posten diameter ursprungliga polykarbonat formen. 8 Vi har också nyligen ändrat polykarbonat mögel design så att fem 2 mm seeding brunnar att vara gjuten i ett enda flera bra agaros kammare, somanvänder mindre PDMS och agaros, och passar i en brunn på en 6-brunnar (data visas inte). Förändringar i posten diameter, bredden på sådd väl krökningsradie den rundade botten, kan antalet sådd brunnar, eller djup sådd brunnar allt ändras bara genom att ändra specifikationer i CAD-filen för CNC bearbetning av polykarbonat mögel. Slutligen kan en enda polykarbonat mögel användas för att tillverka ett obegränsat antal PDMS mallar, och varje PDMS mall kan rengöras, autoklaveras och återanvändas dussintals gånger.
Förutom att ändra storleken på vävnaden ringar har vi gjort ringar från många olika celltyper, inklusive: primära råtta SMC (Cell Applications, R354-05), primära humana kranskärl SMC (Lonza, CC-2583), primära humana dermal fibroblaster 11 (generös gåva av Dr George Pins, WPI Institutionen för medicinsk teknik), råtta lung fibroblaster (RFL-6, ATCC CCL-192), och mesenkymala stamceller (Lonza, PT-2501). Alla dessa celltyper aggregat och kontrakt runt centrum inlägg att bilda vävnad ringar, även den cellulära organisation, ECM sammansättning och mekaniska egenskaper hos konstruktioner varierar för varje celltyp. Den seedning parametrar för varje celltyp måste vara empiriskt bestäms utifrån storleken på cellerna och deras förmåga att aggregera. Därför, medan detta system för att skapa-cellerna vävnad ringar är mycket mångsidig, kan protokollet behöver smärre justeringar för optimal vävnad bildas med olika celltyper.
Tissue ring geometri ger enkel lastning och bedömning av fastigheter vävnad material genom enaxlig dragprovning enligt beskrivningen. Det finns också betydande prejudikat för att använda blod segment fartyg ringen för att mäta vaskulär kontraktion och fysiologiska funktioner. Preliminära studier tyder på att-cellerna vävnad ringar kan monteras på en tråd myograph anordning för mätning av farmakologiska lyhördhet ochkontraktionskraft generationen (data visas inte). Sammantaget tyder på förmåga att snabbt tillverka egna sammansatta celler ringar för histologisk, mekaniska, fysiologiska och biokemiska analyser ett kraftfullt nytt verktyg som kan vara användbara för modellering kärlvävnad struktur och funktion i hälsa och sjukdom.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) för hans hjälp med CNC-bearbetning. Dessutom skulle vi vilja tacka Adriana Hera (WPI databehandling och kommunikation Center) för hennes hjälp med MATLAB programmering, liksom Kate dryck och Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) för hjälp med Camtasia. Sophie Burke och Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) gav extra videofilmer. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health (R15 HL097332), den UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, American Heart Association (grundutbildning forskning gemenskap till JZH) och Worcester Polytechnic Institute (Summer Grundutbildning Forskning Fellowship till JZH och institutionella start medel till MWR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Agarose | Lonza Inc. | 50000 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 15-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A05-201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Digital imaging system | DVT Corporation | Model 630 | |
| Uniaxial testing machine | Instron | ElectroPuls E1000 | |
| Edge Detection Software | DVT Corporation | Framework 2.4.6 |
References
- Roger, V. L. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Kelm, J. M. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).
- Gauvin, R. A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs. Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).
- L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).
- Livoti, C. M., Morgan, J. R. Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units. Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).
- Gwyther, T. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).
- Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro. Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).
- Rowe, S. L., Stegemann, J. P. Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios. Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).
- Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices. J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).
- Konig, G. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).
- Mironov, V. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
