Revealing Neural Circuits Topographie in Multi-Color

Summary

Wir bieten eine praktische Anleitung für die Bereitstellung von Tracer

Abstract

Neuronale Schaltkreise sind in funktionale topografische Karten organisiert. Um komplexe Schaltung Architektur visualisieren wir entwickelten einen Ansatz, um zuverlässig Etikett der globalen Strukturierung von mehreren topographischen Projektionen. Das Kleinhirn ist ein ideales Modell, um die geordnete Anordnung der neuronalen Schaltkreise zu untersuchen. Zum Beispiel hat die räumliche Organisation der spinozerebellären Moosfasern sich als unverzichtbare System für das Studium Moosfaser Strukturierung werden. Wir konnten kürzlich zeigen, dass Weizenkeimagglutinin (WGA) konjugiert Alexa 555 und 488 können für die Rückverfolgung spinozerebellären Moosfaser Projektionen in der Entwicklung und erwachsenen Mäusen verwendet werden (Reeber et al. 2011). Wir fanden drei großen Eigenschaften, die die WGA-Alexa Tracer wünschenswert Tools machen für die Kennzeichnung neuronalen Projektionen. Erstens sind Alexa Fluorophore intensive und ihre Helligkeit lässt wholemount Bildgebung direkt nach Tracing. Zweitens Label WGA-Alexa Tracer die gesamte Flugbahn des sich entwickelnden und adulten neuralen projections. Drittens WGA-Alexa Tracer sind schnell in beide retrograde und anterograde Richtungen transportiert. Hier beschreiben wir detailliert, wie die Tracer und andere erforderliche Tools, wie die Operation für spinozerebellären Tracing durchführen und wie man am besten zum Bild zurück Projektionen in drei Dimensionen vorzubereiten. Zusammenfassend stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Tracing-Protokoll, das von Nutzen sein wird für die Entschlüsselung der Organisation und Vernetzung der funktionellen Karten nicht nur im Kleinhirn, sondern auch in der Hirnrinde, Hirnstamm und Rückenmark.

Protocol

1. Delivering Tracer in vivo mit sterilen OP (§ § 1,1 bis 1,16)

Während des gesamten Verfahrens beraten wir, dass Standard-sterilen OP-Techniken eingesetzt werden. Dazu gehört die Verwendung steriler Handschuhe, Kittel und Mundschutz. Die Werkzeuge sollten entweder vor Gebrauch autoklaviert werden oder gründlich mit Wasser und anschließend Ethanol gereinigt. Während der Operation und vor allem zwischen Tieren, sauber Gewebestücke aus den Werkzeugen und trocken zu sterilisieren Instrumente mit einem heißen bead Sterilisator (Steri 250 Cat. # 18000-45, Fine Science Tools). Darüber hinaus ist es wichtig, dass Sie Ihren Arbeitsplatz so, dass Sie Bereiche für die Tier Vorbereitung (Rasieren, etc.), die Chirurgie und den Aufwachraum, wo das Tier leicht überwacht werden kann, erwärmt, und werden mit Analgetika nach Bedarf benannt wurden zu organisieren. Der Schlüssel zum erfolgreichen Überleben Operationen ist es, das Risiko einer Infektion zu senken und eine aggressive post-operative Betreuung Strategie. Bitte beachten Sie die Tabelle, wo Sie find alle notwendigen Geräte und Reagenzien für dieses Protokoll.

1. Anesthetize erwachsenen Mäusen mit frisch zubereiteten Avertin (2,2,2-Tribromethanol, Sigma, St. Louis MO,. Cat # T48402) über eine intraperitoneale (ip) Injektion mit einer Dosierung von 0.2ml/10grams Körpergewicht. Andere Anästhetika wie Isofluran oder Ketamin / Xylazin sind ebenso wirksam, aber sicher, dass Ihr Labor die erforderlichen institutionellen und Bundesebene Genehmigung vor dem Einsatz hat. Wenn Sie mit Welpen (P0 - P10) sind, können Sie sie auf crushed ice für 10-15 Minuten zu betäuben. Stellen Sie sicher, dass die Haut eines jeden Welpen nicht in direktem Kontakt mit dem Eis (zum Beispiel, indem man sie in die Finger von Latexhandschuhen) als das kalte Wasser schnell bewegen wird eine tödliche Niveau der Hypothermie. Bestätigen Sie, dass das Tier unter einer akzeptablen Ebene der Anästhesie wird durch Ausführen einer Zehe Prise mit einer Pinzette oder den Fingern, um die Tiere "Hinterpfoten. Wenn es ein Pedal Reflex, warten, bis das Tier nicht reagiert auf diesen Reiz als Indiz für ein tieferesEbene der Anästhesie.
2. Sobald das Tier ist völlig betäubt lag er mit seiner Rückenflosse nach oben auf eine sterile Gaze mit dem Kopf abgewandten Ihnen und ihren Schwanz in Ihre Richtung. Shave das Fell mit Haarschneidemaschinen, um sich selbst eine klare OP-Feld, das breit genug, um den Zugriff auf das zentrale Nervensystem zu gewinnen. Wischen Sie die rasierte Region mit zwei Sätzen von Alkoholtupfern, dann 70% Alkohol / betadine, und dann noch einmal mit Alkohol wischt. Verwenden Sie einen von innen nach außen kreisförmig bei der Reinigung des OP-Bereich. Sie können wählen, klar abzugrenzen Ihre OP-Feld, indem ein kleines Loch in eine sterile Gaze und Platzierung der Eröffnung über Ihre rasiert und sauber Operationsstelle. Obwohl die Aufrechterhaltung der sterilen OP-Bereich kann tückisch sein beim Betrieb von kleinen Tieren, dabei wird dazu beitragen, das Risiko einer Infektion.
3. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette und einen Einschnitt mit der Schere an der Mittellinie direkt über der unteren Brustwirbelsäule-oberen Lendenwirbelsäule region. Die unteren BWS-oberen Lendenwirbelbereich können, indem Sie Ihre Finger entlang der Wirbelsäule nach einem Buckel in der Wirbelsäule (Abb. 1) fühlen identifiziert werden.
4. Schneiden Sie die Faszie und oberflächliche Rückenmuskeln. Falls notwendig, stoppen Blutungen durch Ausbrennen der Blutgefäße (Fine Science Tools, Foster City, CA,. Cat # 18000-00). In Welpen, mit leichtem Druck um den Einschnitt mit einem Wattestäbchen genügt, um die Blutung zu stoppen.
5. Führen Sie eine dorsale Laminektomie, indem die Dornfortsätze von einem oder zwei Segmenten der unteren Brustwirbelsäule - obere Lumbalmark nach dem Schneiden der Lamina auf beiden Seiten der Wirbelsäule, auf halbem Weg zwischen dem Gelenkfortsatz und der dorsalen Dornfortsätze (Abb. 2) . Achten Sie darauf, das Rückenmark mit der Schere Schäden und ziehen Sie stets den kleinen Knochensplitter, wie sie das Rückenmark könnte zerreißen. Beachten Sie, dass die Wirbelsäule in der frühen postnatalen Welpen nicht vollständig verknöchert, was bedeutet, dass die Knochen sind sehrweich und lässt sich sehr einfach geschnitten werden. Deshalb darauf achten, nicht zu tief geschnitten, wie Sie vielleicht das Rückenmark beschädigt.
6. Wenn Sie nicht mit einer dorsalen Laminektomie in erwachsenen Mäusen durchführen möchten, haben wir herausgefunden, dass man die Weichteile zwischen den Wirbelkörpern Segmente geschnitten auf einen kleinen Bereich des Rückenmarks ohne Schneiden jeder Knochen freizulegen. Obwohl beide Methoden effektiv Wege des Eintrags in das Rückenmark, können die Vermeidung einer dorsalen Laminektomie sicherzustellen, dass das Rückenmark unbeschädigt bleibt.
7. Füllen Sie ein gezapftes Elektrode (Borosilikatglas Kapillaren; Cat # 300056, Harvard Apparatus, Holliston, MA;. Zweistufige Glasmikropipette Puller von Narishige Modell 001-PC-10) mit dem Tracer mit einem Mikrometer-Spritze (0,2 ml; Gilmont Instruments Cat . # GS-1100) oder eine gleichwertige Lieferung Apparat.
8. Ziehen Sie die Glas-Mikroelektrode in Platz auf einem Mikromanipulator und legen Sie die Elektrode 0,1-0.5mm in der unteren Brustwirbelsäule-oberen Lendenbereich des Rückenmarks auf halbem Weg zwischen der MitteLinie und dem seitlichen Rand des Rückenmarks. Das Tier kann in einem stereotaktischen Apparat zur genauen Identifizierung der Injektion loci und zur Stabilisierung des Tieres (Small Animal stereotaktische Instrument Modell 940-A und Elektrode Manipulator Model 960 von Kopf Instrumentation) statt. Alternativ wird, wenn Ihr Anästhesie-Regime kann zugeschnitten auf eine stetige Flugzeug ohne nennenswerte Bewegungen durch tiefes Atmen zu erreichen, sanft Taping das Tier werden ausreichen.
9. Druck spritzen in das Rückenmark über 3-5 Minuten etwa 0.5μl einer 2% igen Lösung von WGA-Alexa 488 (Weizenkeimagglutinin, Alexa Fluor 488-Konjugat;. Cat # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 555 (Weizenkeimagglutinin, Alexa 555-Konjugat;. Cat # W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 350 (Weizenkeimagglutinin, Alexa Fluor 350-Konjugat;. Cat # W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA- HRP (Weizenkeimagglutinin Meerrettichperoxidase, Sigma, St. Louis, MO Cat # L7017) oder 0.5μl von 10%BDA (biotinylierten Dextran Amin;. Cat # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, Sigma, St. Louis, MO; Cat # P4417). Injizieren dieser Bände von Tracern Ergebnisse in der Kennzeichnung eine große Anzahl von Fasern. Kleinere Volumina müssen für die Ausrichtung kleinerer Kerne (oder Sub-Regionen der einzelnen Kerne) und jeder Prüfer sollte empirisch bestimmen die ideale Lautstärke zu liefern injiziert werden. Iontophorese sollte für eine genaue Nanoliter Lieferung für präzise Injektionen in Betracht gezogen werden. Wir in der Regel ergänzen alle Tracer-Lösungen mit 0,5% Fast Green (Sigma, St. Louis, MO; Cat # F7252), um die Injektion vor Ort während der Operation sichtbar zu machen.
10. Wir fügen 1μl von Maisöl (Sigma, St. Louis, MO; Cat # C8267) für jeden 10 &mgr; l der BDA-Lösung vor der Injektion zu der Mischung aus Festhalten an den Wänden des gezogenen Pipetten zu verhindern. Wenn Sie Schwierigkeiten haben, dem Auswerfen der Tracer aus der Pipette langsam zurückzuziehen die Spitze eine kleine Tasche in das Gewebe dann zu erstellen Injektion wieder.Es ist nicht für die Mikroelektroden-Spitze zu verstopfen ungewöhnlich. In den meisten Fällen die Tasche auch hilft, ein Reservoir, aus dem die umliegenden Neuronen der Tracer aufnehmen kann. Denken Sie daran, immer auswerfen, den Tracer langsam zu massiven Gewebeschäden in der Nähe Ihres Nadel zu vermeiden.
11. Schließen Sie vorsichtig die Haut mit Wundklammern und Gewebekleber. Alternativ können Sie Nähte, um die Wunde zu schließen.
12. Beachten Sie, dass mit der Praxis des chirurgischen Eingriffs, zumindest bis zu diesem Punkt kann in weniger als 20 Minuten abgeschlossen sein.
13. Legen Sie das Tier in eine Erholung Kammer (Vetcare Kammer-Modell 9.16.0 Cat. # 340508 von Harvard Apparatus) auf einem Heizkissen (Heizkissen Cat. # 341241 von Harvard Apparatus) zu Unterkühlung und die Genesung beschleunigen zu vermeiden. Alternativ können Sie eine von vielen Marken und Modelle von Heizkammern. Überwachen Sie die Atemfrequenz und überprüfen Sie die Zeichen, dass das Tier versucht, sich zu bewegen. Die meisten Tiere sind in der Regel innerhalb von 10-15 Minuten nach der Operation ansprechbar.
14. WGA-Alexa 555, WGA-Alexa 488 und WGA-HRP sind schnell in Neuronen transportiert und wir haben in beiden frühen postnatalen und adulten Mäusen die Alexa-Konjugat-Tracer robust label lange Faserbahnen innerhalb von 24 Stunden (Reeber et al. 2011) gefunden . WGA-Alexa 350 ist auch schnell transportiert, obwohl die anderen Alexa Farbstoffe gegenüber ihren Bekanntheitsgrad ist stark abhängig von der Qualität und der Empfindlichkeit des Filters setzt (Daten nicht gezeigt;. Reeber et al 2011) BDA erfordert in der Regel längere Überlebenszeiten vollständig Spur neuronalen Projektionen und damit für eine vollständige Kartierung der spinozerebellären Projektionen Tiere müssen nach etwa 11 Tagen getötet werden.

2. Erkennung von anterograd zurückzuführen Moosfasern

1. Nach der jeweiligen Überlebenszeit betäuben die Mäuse mit Avertin (oder Ihrem bevorzugten Narkose).
2. Einmal gibt es keine Reflexe des Blutes durch das Herz durch Perfusion mit 0,1 M PBS (pH 7,2) gespült werden sollten. Dann fix das Gewebe durch Perfusion des Tieres mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Zusätzlich zu den Regionen, die Sie analysieren, ist es immer notwendig, um Gewebe aus der Injektionsstelle für die retrospektive Analyse, wie groß der Injektion wurde, ein Indiz für das Ausmaß der Gewebeschädigung durch die Elektrode verursacht zu erwerben, und für die Ermittlung möglicher Kennzeichnung in Fasern der Passage (Abb. 3, siehe Mesulam, 1982;. Reeber et al 2011).
3. Postfix die brAINS aus perfundierten Mäuse für 24-48 Stunden in 4% PFA und dann cryoprotect sie in gepufferter Saccharose-Lösungen in PBS (15% für ca. 2 Stunden oder bis das Gewebe sinkt auf den Boden des Behälters und dann 30% über Nacht oder bis die verdünnte Gewebe sinkt). Das Gewebe wird dann von der Saccharose entfernt sanft trocken getupft mit Küchenpapier und dann in einem Gewebe enthaltende Form Oktober eingetaucht (Optimal Cutting Temperature; Sakura Finetech USA Inc, CA). Das Gewebe wird dann eingefroren mit einem -80 ° C Gefrierschrank und gespeichert bei der gleichen Temperatur bis zu ihrem bereit, geschnitten werden.
4. Das Alexa Fluorophore werden direkt nach der Markierung sichtbar und erfordern keine zusätzliche Färbung. Deshalb wird nach Perfusion der WGA-Alexa zurückzuführen Gewebe geschnitten und montiert werden für die Bildgebung oder direkt in 4% PFA als wholemount Vorbereitung abgebildet. Wir fanden, dass die Abbildung des Gewebes in 4% PFA hat die besten Brechungsindex für die Abbildung der Topographie zurückzuführen Projektionen in wholemounts. Für Abschnitte, schneiden serial 40 um dicke coronal Abschnitte auf einem Kryostaten und sammeln sie als frei schwebende Abschnitte in PBS. Angesichts der Toxizität von PFA, sicherzustellen, dass eine entsprechende Gesichtsmaske während der Perfusion und Imaging-getragen wird, halten Sie den Bereich gut belüftet, und wenn nicht in Gebrauch sofort wieder jeden PFA oder PFA-fixierten Gewebe in verschlossene Behälter. Es ist ideal, wenn Sie Ihr Mikroskop in einem geeigneten Abzug befindet.
5. WGA-HRP markierter Fasern zeigten mit Tetramethylbenzidin (TMB) als Chromogen werden. Wir beschreiben nicht die HRP Färbeprotokoll hier, da es zuvor im Detail (Vogel und Prittie 1994.; Sillitoe et al 2010) beschrieben worden
6. Für BDA bezeichnet Fasern inkubieren free-floating Gewebeschnitten für 2 Stunden in Streptavidin-Cy3 (Kat. Nr. 434315, Invitrogen, Carlsbad, CA) oder Streptavidin-Alexa Fluor 488 oder 555 (Kat. Nr. S11223 für 488 und Cat. # S21381 für 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), in PBS waschen und hängen Sie dann mit einem Fluor-GEL. Für DAB inkubieren Gewebeschnitte über Nacht in ABC-Reaktionspuffer (Kat. Nr. PK-4000, Vektor Laboratories, Inc. Burlingame, CA), spülen Sie 3 mal in PBS und reagieren dann für 5-10 Minuten in DAB (0,5-Promillegrenze, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) ergänzt mit 10 &mgr; l von 30% H ₂ O ₂ für jeden 50ml DAB-Lösung.

3. Immunhistochemie

1. Immunhistochemie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Sillitoe et al. 2008). Kurz gesagt, inkubieren Gewebeschnitte in 0,1 M PBS mit 10% NGS (NGS, Sigma, St. Louis MO), 0,1% Tween-20 und primären Antikörper (siehe unten) für 16-18 Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Gewebeschnitte dreimal in PBS und dann brüten sie in Sekundärantikörper (siehe unten) für maximal 2 Stunden bei Raumtemperatur. Spülen Sie das Gewebe wieder und zeigen die Immunreaktivität wie unten beschrieben.
2. Zur Bestimmung der Beziehung zwischen Purkinje-Zellen und Moosfasern wir frei schwebende Gewebeschnitte mit herkömmlichen Methoden der Doppelfärbung Zusammenarbeit gekennzeichnet. Wir verwendeten WGA-Alexa 555für die Rückverfolgung und Alexa 488 konjugierten Esel-anti-Maus Sekundärantikörper (Invitrogen / Molecular Probes Inc., Carlsbad, CA) zu erkennen ZebrinII (1:250; Art Geschenk von Dr. Richard Hawkes, University of Calgary, Calgary, Kanada). ZebrinII ist ein monoklonaler Maus-Antikörper und wurde direkt aus abgebrannten Hybridom Kulturmedium verwendet. Der Fluorophor konjugierten sekundären Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:1500 verwendet. Nach der Färbung der Gewebeschnitte wurden auf geladene Objektträger montiert und dann mit einem Fluor-GEL in Tris-Puffer (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) oder mit Vectashield hardset eingedeckt Eindeckmedium mit DAPI (Kat. Nr. H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) für Triple Farbe Fluoreszenz-Imaging.
3. Wir testeten die Spezifität der Sekundärantikörper durch die Verarbeitung der Gewebeschnitte in der Abwesenheit von primären Antikörpern. Es wurde kein Signal in eine solche Kontrolle Experimenten nachgewiesen, was darauf hinweist, dass die Färbung beobachteten wir nicht durch unspezifische Signale von the Alexa-konjugierte Antikörper (Daten nicht gezeigt).

4. Mikroskopie und Datenanalyse

1. Wir erfassen Aufnahmen von Gewebeschnitten mit Leica DFC360 FX (Fluoreszenz) und DFC490 (DAB und TMB reagierte Gewebeschnitte) Kameras auf einem Leica DM5500 Mikroskop montiert.
2. Wir erfassen und analysieren die Bilder von Gewebeschnitten mit Leica Application Suite und Leica Application Suite FX Software-Pakete.
3. Mikrophotographien wholemounts mit einer digitalen Leica DFC3000 FX Kamera auf einem Leica MZ16 FA Stereomikroskop laufen Leica Application Suite FX-Software montiert.
4. Unsere beiden Mikroskope sind mit Leica CY3 (Modell # 11600231) und FITC (Modell # 11513880) Filter und die DM5500 mit einer zusätzlichen A4 DAPI / UV-Filter (Modell # 11504162) ausgestattet.
5. Die Bilder werden nach der Optimierung für under / over-Exposition bestimmt mit dem Leica-Software erworben. Wir importieren alle Rohdaten in Adobe Photoshop CS4 und ggf. we richtige gesamten Bereich der jedes Bild für Schärfe, Helligkeit, Kontrast oder Ebenen nur. Andere Foto-Bearbeitungs-Software kann als bevorzugte verwendet werden.
6. Der Schaltplan hier vorgestellten wurden in Adobe Illustrator CS4 erstellt.
7. Alexa 555 und CY3 gefärbten Neuronen, die so rot erkannt werden Einsatz unserer Filter wurden pseudo-farbigen Magenta in die Bilder während des Manuskripts vorgestellt.

Animals

Alle Tierversuche wurden im Rahmen einer genehmigten IACUC Tier-Protokoll nach den Richtlinien des Instituts der Albert Einstein College of Medicine durchgeführt. Männliche und weibliche outbred Swiss Webster (Taconic, Albany, NY) oder Inzucht C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) Mäuse wurden in unserer Kolonie gepflegt und für alle Studien. Noon am Tag ein Vaginalpfropf detektiert wurde als Embryonaltag 0,5.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Spinozerebelläre Afferenzen enden in parasagittal Bands im Kleinhirn (Abb. 3; Voogd et al 1969;. Grishkat und Eisenman 1995; Vogel und Prittie 1994; Vig et al 2005;. Apps und Hawkes 2009; Sillitoe et al 2010;.. Reeber et al 2011). Wir injizierten WGA-Alexa Tracer in der unteren Brustwirbelsäule-oberen Lumbalmark zu zeigen: 1), dass dieser Tracer verwendet werden, um konsequent Etikett spezifische Teilmengen von Anschlüssen im Kleinhirn (Abb. 3; Reeber et al 2011), 2). dass WGA-Alexa Tracer sind intensiv hell und kann verwendet werden, um das Gesamtbild der Moosfaser Topographie ganz cerebella (Abb. 3.; Reeber et al 2011) zu visualisieren, 3), dass WGA-Alexa 488 und 555 in Kombination eingesetzt werden können zur Verfolgung mehrerer Verträge im gleichen Tier (Abb. 4) und 4), dass WGA-Alexa Tracer mit immunhistochemische Färbung (Abb. 5). In neueren Arbeiten haben wir gezeigt, dass WGA-Alexa-Tracer-Label-Terminals in das Kleinhirn so früh wie 6 Stunden nach Bereitstellung der Tracer in das Rückenmark und eine ausgezeichnete Wahl für die Suche nach architectur sinde für die Entwicklung von Pathways (Reeber et al., 2011).

Abbildung 1. Aufbau von Anlagen für die Bereitstellung von Tracer in vivo. A. ein Bild unserer OP-Bereich. B. Die unteren Brustwirbelsäule-oberen Lendenwirbelbereich, indem Sie Ihre Finger entlang der Wirbelsäule nach einem Buckel in der Wirbelsäule spüren identifiziert werden können. Die dorsale Laminektomie sollte etwa in der Mitte der "Buckel", die durch den gelben Pfeil gekennzeichnet ist, durchgeführt werden.

Abbildung 2 Illustration eines unteren Brustwirbelsäule -... Oberen Lendenwirbelsäule Segment vor und nach dorsal Laminektomie A. Schematische Darstellung einer intakten Wirbelsegment aus der unteren Brustwirbelsäule-upper Bauholz Region der Maus Wirbelsäule B. A Dorsal Laminektomie wird durch Entfernen der Dornfortsätze von ein oder zwei Wirbelsegmente, nach dem Schneiden der Lamina auf halbem Weg zwischen dem Gelenkfortsatz und der dorsalen Dornfortsatz durchgeführt.

Abbildung 3. WGA-Alexa Tracer sind intensiv hell und kann verwendet werden, um afferente Projektion Topographie in hoher Auflösung zu visualisieren. A. Die Darstellung zeigt die Herkunft und die Beendigung der WGA-Alexa 555 markierte spinozerebellären Neuronen. B. Bild von der Injektionsstelle nach Abgabe WGA-Alexa 555 in der unteren Brustwirbelsäule oberen Lendenwirbelbereich der erwachsenen Rückenmark. C. Wholemount Bild der vordere Läppchen nach einer Injektion von WGA-Alexa 555 in der unteren Brustwirbelsäule-oberen Lendenbereich des Rückenmarks. D. WGA-Alexa 555 anterograde Tracing der spinozerebellären Trakt zeigt Banden Moosfasern wie auf eine Zusammenarbeit gesehenRonal Gewebeschnitt. Die Läppchen sind mit römischen Ziffern und die Zahlen label Moosfaser Bands auf beiden Seiten der Mittellinie (gilt für alle Bilder) definiert. Maßstabsbalken: B, 500 pm C, 500 pm D, 200 um.

Abbildung 4. WGA-Alexa Tracer für die Kennzeichnung mehrerer Nervenbahnen in das gleiche Tier effizient. A. Wholemount schematische Darstellung der Maus Kleinhirn Zusammenfassung der allgemeinen Muster von spinozerebellären Moosfaser Bands. WGA-Alexa 555 wurde in die rechte Seite der Lenden-Wirbelsäule und WGA-Alexa 488 in dem gleichen Segment auf der linken Seite injiziert. B. Wie auf einem koronalen Gewebe Querschnitt durch den hinteren Läppchen geschnitten gesehen, waren beide WGA-Alexa-Tracer transportiert, um das Kleinhirn und erfolgreich bezeichnet verschiedene Teilmengen von Terminals (siehe auch Reeber et al. 2011). Abkürzungen: Maulwurfdere Schicht (ml); Purkinje Zellschicht (PCL); Körnerzellschicht (GCL); der weißen Substanz (wm). Maßstabsbalken: B, 100 um.

Abbildung 5. WGA-Alexa-Tracer kann in Kombination mit Immunhistochemie und Histologie für Triple-Kennzeichnung von Neuronen und Projektionen verwendet werden. A. WGA-Alexa 555 ist in Moosfaser Terminals in Lobulus III abgelagert. B. ZebrinII Färbung zeigt eine Reihe von Purkinje Zelle Streifen in Lobulus III. C. DAPI-Färbung von neuronalen und glialen Kernen. D. zusammengefügte Bild von Platten A, B und C zeigt dreifache Kennzeichnung von afferenten Bands, Purkinje Zelle Streifen, und die allgemeine Zytoarchitektur. EH. Hohe Vergrößerung Bilder der markierten Bereiche in Platten AD gezeigt. Purkinje-Zelle Streifen sind nummeriert, wie zuvor beschrieben (reviewedin (Apps und Hawkes 2009)). Abkürzungen: molekulare Schicht (ml); Purkinje Zellschicht (PCL); Körnerzellschicht (GCL). Maßstabsbalken: D, 500 pm (für AC), H 500 pm (für EG).

Discussion

Wir haben die operative und technische Details für eine erfolgreiche axonalen und dendritischen Tracing unter Verwendung eines neuartigen Fluoreszenz-basierten Ansatz für die schnelle Kennzeichnung neuronalen Projektionen in der Entwicklung und erwachsenen Mäusen erforderlich beschrieben. Mit WGA-Alexa zeigen wir, wie Tracer und Marker für die Analyse von strukturierten Topografie elektrischer Schaltungen mit hoher Auflösung und in drei Dimensionen verwendet werden kann.

Viele Indikatoren sind für die Rückverfolgung neuronalen Schaltkreisen, einschließlich Cholera-Toxin Untereinheit B, Biocytin, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHAL), fluororuby, fluoremerald und Fluorogold. Darüber hinaus haben neue genetische und virale Basis Tracer nachgewiesen, dass molekular unterschiedliche neuronale Teilmengen topographisch sind, um ihre Ziele mit großer Präzision verbunden. Beachten Sie, dass obwohl einige neuronale Tracer überwiegend entweder in der anterograde oder retrograde Richtung (zB BDA 10.000 MW im Vergleich zu 3000 MW) transportiert werden, Tracer-Moleküle sind oft in beide transportiertRichtungen. In unseren Studien stellen wir WGA-Alexa basierten Tracer als zuverlässige neuroanatomischen Werkzeuge für die Analyse der topographischen Projektion Muster. Wir zeigen, dass WGA-Alexa hell fluoresziert, wird schnell transportiert und vielseitig genug, um mit immunhistochemischen Markern einschließlich derjenigen für die Kleinhirn-sagittal Fächer (Abb. 3) gekoppelt werden.

Wir haben einige Einschränkungen bei der Verwendung WGA-Alexa im Vergleich zu anderen verfügbaren neuroanatomischen Tracer gefunden. Im Gegensatz zu BDA (Wu et al. 1999), haben wir bereits gezeigt, dass WGA-Alexa (und WGA-HRP) zeigt nicht die gesamte Morphologie der komplexe Klemme Endungen (Reeber et al. 2011). Allerdings verbesserten wir den Wert der anatomischen Informationen aus verfolgt Terminals durch Paarung WGA-Alexa Tracing mit immunhistochemische Färbung für vesikulären Glutamat-Transporter 2 (VGLUT2) und Kokain und Amphetamin geregelt Transkript Peptid (CART) Immunhistochemie (Reeber et al 2011;. Reeber und Sillitoe, 2011). Einweiteres Manko der WGA-Alexa ist, dass das Signal relativ schnell abbaut an Gewebeschnitten, obwohl sie in den Medien, dass die Fluoreszenz-Signal zu schützen montiert. Deshalb haben wir in der Regel Bild des Gewebes sofort nach dem Schneiden, obwohl Bildgebung innerhalb von 2 Tagen Schneiden noch erlaubt beschriftet Fasern und Terminals erfolgreich abgebildet werden. Es gibt eine Tendenz für die WGA-Alexa Signal an Intensität während Immunfärbung der Gewebeschnitte verlieren. Mit weniger und kürzere wäscht während der Färbung kann dieses Problem minimieren. Eine weitere Empfehlung ist es, immer montieren und Bild einen Satz der zurückverfolgen Gewebeschnitten am Tag der Schnitt für einen Verweis gesetzt, um mit benachbarten Abschnitten, die für die Immunhistochemie verarbeitet werden zu vergleichen. In unseren Händen OCT (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) Gewebe Blöcke bei -80 ° C aufbewahrt embedded nach Perfusion und Gefrierschutzmittel kann für längere Zeit ohne Verlust der Tracer-Intensität gespeichert werden.

Unsere approach der Rückverfolgung Fasern könnte leicht zum Aufspüren neuronaler Karten in kortikalen, Hirnstamm und Rückenmark Wege angepasst werden. Wir prüfen derzeit die Möglichkeit der Verwendung von WGA-Alexa Tracer für die in-vivo-Bildgebung des Kreises Bildung in gentechnisch veränderten Tieren und zur Untersuchung der Dynamik der Schaltung Bildung nach der selektiven Darm-Trakt Läsionen und pharmakologischen Manipulationen. Da die schnellen Transport von WGA-Alexa Tracer ermöglicht kurzfristige Analyse unseres Ansatzes hat das Potenzial für die Entdeckung der dynamischen Veränderungen, die während strukturelle Plastizität der topographischen Schaltungen auftreten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bead sterilizer	Fine Science Tools	Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Cauterizer	Fine Science Tools	Cat. # 18000-00
Borosilicate glass capillaries	Harvard Apparatus	Cat. # 300056
Dual stage Glass Micropipette Puller	Narishige International	Model 001-PC-10
Micrometer syringe	Gilmont Instruments	Cat. # GS-1100
Small Animal Stereotaxic Instrument	Kopf Instruments	Model 940-A
Electrode Manipulator	Kopf Instruments	Model 960
Vetcare chamber	Harvard Apparatus	Cat. # 340508
Heating Pad	Harvard Apparatus	Cat. # 341241
Leica DFC360 FX camera	Leica Microsystems	DFC360 FX
Leica DFC490 camera	Leica Microsystems	DFC490
Leica DM5500 microscope	Leica Microsystems	DM5500
Leica DFC3000 FX camera	Leica Microsystems	DFC3000 FX
Leica MZ16 FA microscope	Leica Microsystems	MZ16 FA
CY3 Filter	Leica Microsystems	Model # 11600231
FITC Filter	Leica Microsystems	Model # 11513880
A4 DAPI/UV filter	Leica Microsystems	Model # 11504162
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Cat. #W11261
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	Cat. #W32464