Révéler la topographie des circuits neuronaux dans les multi-couleur

Summary

Nous fournissons un guide pratique pour la prestation des traceurs

Abstract

Les circuits neuronaux sont organisés en fonction des cartes topographiques. Afin de visualiser l'architecture circuit complexe, nous avons développé une approche de l'étiquette de manière fiable la structuration globale de multiples projections topographiques. Le cervelet est un modèle idéal pour étudier l'arrangement ordonné des circuits neuronaux. Par exemple, l'organisation compartimentée du spinocérébelleuse fibres moussues s'est avéré être un système indispensable pour l'étude de la structuration des fibres moussues. Nous avons récemment montré que le germe de blé agglutinine (WGA), conjugué à Alexa 555 et 488 peut être utilisé pour tracer des projections spinocérébelleuses fibres moussues dans le développement et la souris adulte (al Reeber et al. 2011). Nous avons trouvé trois propriétés principales qui font les outils WGA-Alexa traceurs souhaitable pour l'étiquetage des projections de neurones. Premièrement, les fluorophores Alexa sont intenses et leur luminosité permet d'imagerie wholemount directement après traçage. Deuxièmement, WGA-Alexa traceurs étiquette toute la trajectoire du développement et les adultes projectio neuronesns. Troisièmement, WGA-Alexa traceurs sont rapidement transportés dans les deux directions rétrograde et antérograde. Ici, nous décrivons en détail la façon de préparer les traceurs et les autres outils requis, comment effectuer la chirurgie pour spinocérébelleuse traçage et la meilleure façon de projections d'images tracées en trois dimensions. En résumé, nous fournissons un protocole étape par étape de traçage qui sera utile pour déchiffrer l'organisation et la connectivité des cartes fonctionnelles, non seulement dans le cervelet, mais aussi dans le cortex, du tronc cérébral et la moelle épinière.

Protocol

1. Offrir traceurs in vivo en utilisant la chirurgie stériles (articles 01.01 à 01.16)

Tout au long de la procédure, nous conseillons cette norme stériles techniques chirurgicales sont utilisées. Cela inclut l'utilisation des gants stériles, une blouse et un masque facial. Les outils devraient être soit autoclavées avant utilisation ou nettoyés à l'eau puis l'éthanol. Pendant la chirurgie, et surtout entre les animaux, fragments de tissus nettoyer les outils et sec stériliser les instruments avec un stérilisateur à billes chaudes (Steri 250 Cat. # 18000-45, Outils Fine Science). En outre, il est essentiel que vous organisez votre espace de travail de telle sorte que vous avez des zones désignées pour la préparation des animaux (etc rasage), la chirurgie, et une zone de récupération où l'animal peut être facilement contrôlé, réchauffé, et fourni avec des analgésiques au besoin. La clé de la survie de chirurgies réussies est de réduire le risque d'infection et de maintenir une stratégie de soins post-opératoires agressive. S'il vous plaît se référer à la table où vous pouvez nageoireD tous les équipements et les réactifs nécessaires pour ce protocole.

1. Anesthetize souris adultes fraîchement préparés Avertin (2,2,2-tribromoéthanol, Sigma, St. Louis MO; Cat. # T48402) via un intrapéritonéale (IP) d'injection avec un dosage de poids corporel 0.2ml/10grams. D'autres anesthésiques comme l'isoflurane ou de kétamine / xylazine sont tout aussi efficaces, mais s'assurer que votre laboratoire a reçu l'approbation nécessaire des institutions et du gouvernement fédéral avant de l'utiliser. Si vous utilisez les chiots (P0 - P10) vous pouvez les anesthésier sur glace pilée pendant 10-15 minutes. Assurez-vous que la peau de chaque chiot n'est pas en contact direct avec la glace (par exemple, en les plaçant dans des doigts de gants en latex) que l'eau froide va rapidement induire un niveau létal d'hypothermie. Confirmez que l'animal est sous une plaine acceptable de l'anesthésie en effectuant un pincement de l'orteil avec une pince ou les doigts aux pattes de l'animal postérieurs. S'il ya un réflexe de pédale, attendre que l'animal ne répond pas à ce stimulus comme une indication d'un profondplaine de l'anesthésie.
2. Une fois que l'animal est totalement anesthésié le poser avec sa face dorsale sur une compresse stérile avec sa tête face à vous et sa queue en face de vous. Rasez les poils avec une tondeuse cheveux afin de vous donner le champ libre chirurgicale qui est assez large pour accéder au système nerveux central. Essuyez la région rasée avec deux ensembles de tampons d'alcool, puis 70% d'alcool / bétadine, et ensuite nettoyer une fois de plus avec des lingettes alcoolisées. Utiliser une à l'intérieur pour motif circulaire extérieur lorsque le nettoyage de la zone chirurgicale. Vous pouvez choisir de délimiter clairement le champ opératoire en coupant un petit trou dans un tampon de gaze stérile et plaçant l'ouverture de votre site chirurgical rasé et propre. Bien que le maintien du champ opératoire stérile peut être difficile lors du fonctionnement sur les petits animaux, faisant aidera à réduire le risque d'infection.
3. Soulever la peau avec une pince et faire une incision avec des ciseaux à la ligne médiane juste au-dessus du bas-thoracique supérieure r lombaireségion. La baisse thoraciques région supérieure région lombaire peut être identifié par votre doigt le long des vertèbres de se sentir pour une bosse dans la colonne vertébrale (Fig. 1).
4. Couper le fascia et les muscles superficiels épinière. Si nécessaire, arrêter les saignements en cautérisant les vaisseaux sanguins (Outils Fine Science, Foster City, CA; Cat. # 18000-00). Dans les chiots, en appliquant une légère pression autour de l'incision avec des cotons-tiges est suffisante pour arrêter le saignement.
5. Effectuer une laminectomie dorsale en supprimant les apophyses épineuses de un ou deux segments de la partie inférieure thoracique - moelle épinière supérieure lombaire après la coupe de la lame sur les deux côtés de la colonne, au milieu vertébrale entre l'apophyse articulaire et le processus dorsale épineuse (fig. 2) . Attention à ne pas endommager la moelle épinière avec vos ciseaux et de toujours retirer le petits fragments d'os car ils pourraient lacérer la moelle épinière. Notez que la colonne vertébrale au début de chiots postnatale n'est pas complètement ossifiée, ce qui signifie que les os sont trèsdoux et peut être coupé très facilement. Par conséquent, veillez à ne pas couper trop profondément car vous pourriez endommager la moelle épinière.
6. Si vous préférez ne pas effectuer une laminectomie dorsale chez la souris adulte, nous avons constaté que vous pouvez couper les tissus mous entre les segments vertébraux pour exposer une petite région de la moelle épinière sans couper l'os. Bien que les deux méthodes sont efficaces itinéraires d'entrée dans la moelle épinière, en évitant une laminectomie dorsale peut s'assurer que la moelle épinière demeure intact.
7. Remplissez un verre de l'électrode tiré (verre borosilicate capillaires; Cat # 300056, Harvard Apparatus, Holliston, MA;. Double étage verre Micropipette Extracteur d'Narishige Modèle 001-PC-10) avec votre traceur à l'aide d'une seringue micrométrique (0.2ml; Gilmont Instruments chat . # GS-1100) ou un appareil de livraison équivalent.
8. Serrer la microélectrode de verre en place sur un micromanipulateur et d'insérer l'électrode 0.1-0.5mm en bas du thorax-dessus région lombaire de la moelle épinière à mi-chemin entre le milieuligne et le bord latéral de la moelle épinière. L'animal peut être tenue dans un appareil stéréotaxique pour une identification précise des loci d'injection et pour la stabilisation de l'animal (Petit modèle animal Instrument stéréotaxique 940-A et le modèle d'électrode 960 Manipulateur d'Instrumentation Kopf). Alternativement, si votre régime anesthésique peut être adapté pour atteindre un avion régulier sans mouvements significatifs à cause de la respiration profonde, tapent doucement l'animal vers le bas suffira.
9. Pression injecter dans la moelle épinière sur 3-5 minutes environ 0.5μl d'une solution à 2% de WGA-Alexa 488 (germe de blé agglutinine, Alexa Fluor 488 conjugué; Cat. # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 555 (germe de blé agglutinine, Alexa Fluor 555 conjugué; Cat. # W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 350 (agglutinine de germe de blé, Alexa Fluor 350 conjugué; Cat. # W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA- HRP (germe de blé agglutinine peroxydase de raifort; Sigma, St. Louis, MO Cat # L7017) ou 0.5μl de 10%BDA (biotinylé dextran amine; Cat. # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) en tampon phosphate salin (PBS; Sigma, St. Louis, MO; Cat # P4417). L'injection de ces volumes des résultats des traceurs dans l'étiquetage d'un grand nombre de fibres. Des volumes plus petits devront être injectés pour cibler les noyaux plus petits (ou sous-régions de noyaux individuels) et chaque enquêteur doit déterminer empiriquement le volume idéal pour offrir. Iontophorèse devraient être considérés pour la livraison nanolitre précises pour des injections précises. Nous généralement toutes les solutions complètent traceur avec 0,5% Fast Green (Sigma, St. Louis, MO; Cat # F7252) pour visualiser l'endroit d'injection pendant la chirurgie.
10. Nous ajoutons 1 microlitre d'huile de maïs (Sigma, St. Louis, MO; Cat # C8267) à chaque 10 pi de solution de BDA avant l'injection afin de prévenir le mélange de coller aux parois des pipettes tiré. Si vous avez des ennuis d'éjecter le traceur hors de la pipette, lentement rétracter la pointe pour créer une petite poche dans le tissu, puis essayez à nouveau injecter.Il n'est pas inhabituel pour la pointe de microélectrodes à s'encrasser. Dans la plupart des cas la poche permet également de créer un réservoir à partir duquel les neurones environnants peuvent absorber le traceur. N'oubliez pas de toujours éjecter le traceur lentement pour éviter les dommages aux tissus massifs dans les environs de votre aiguille.
11. Fermez doucement la peau avec des clips de la plaie et colle tissulaire. Alternativement, vous pouvez utiliser des sutures pour refermer la plaie.
12. Notez que la pratique de l'intervention chirurgicale, au moins jusqu'à ce point, peut être complété en moins de 20 minutes.
13. Placez l'animal dans une chambre de récupération (Vetcare chambre de modèle 9.16.0 Cat. # 340508 à partir Harvard Apparatus) sur un coussin chauffant (Cat coussin chauffant. # 341241 à partir Harvard Apparatus) pour éviter l'hypothermie et d'accélérer la récupération. Alternativement, vous pouvez utiliser une des nombreuses marques et modèles des chambres de chauffage. Surveiller le taux de respiration et de vérifier les signes que l'animal est tentant de déplacer. La plupart des animaux sont généralement réactive en 10-15 minutes après la chirurgie.
14. WGA-Alexa 555, Alexa WGA-488, et WGA-HRP sont rapidement transportées dans les neurones et nous avons constaté que chez les souris adultes et postnatale précoce de l'Alexa conjugué traceurs robuste tracts étiquette fibres longues dans les 24 heures (Reeber et al. 2011) . WGA-Alexa 350 est également rapidement transporté bien par rapport à l'autre colorant Alexa sa visibilité est fortement dépendante de la qualité et la sensibilité des jeux de filtres (données non présentées;. Reeber et al 2011) BDA exige généralement des temps de survie plus longue pour bien tracer les projections neurales et donc pour la cartographie complète de projections spinocérébelleuses animaux devront être sacrifiés après environ 11 jours.

2. Détection de anterogradely tracé fibres moussues

1. Après les périodes de survie respectifs anesthésier la souris avec Avertin (ou votre préféré l'anesthésie).
2. Une fois il n'ya pas de réflexes du sang doit être rincé à travers le cœur en perfusant avec 0,1 M de PBS (pH 7,2). Ensuite, fixer le tissu en perfusant l'animal avec du paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS. En plus des régions vous permettra d'analyser, il est toujours nécessaire d'acquérir des tissus à partir du site d'injection pour l'analyse rétrospective de la taille de l'injection a été, une indication de l'étendue des dommages aux tissus causés par l'électrode, et pour identifier étiquetage possible dans les fibres de passage (fig. 3, voir Mesulam, 1982;. Reeber et al 2011).
3. Postfix le BRains de souris perfusées pendant 24-48 heures à 4% PFA et puis les cryoprotect de solutions de saccharose tamponné dilué dans du PBS (15% pour environ 2 heures ou jusqu'à ce que les puits de tissu au fond du récipient, puis 30% pendant la nuit ou jusqu'à ce que le tissus puits). Le tissu est ensuite retiré de la saccharose, délicatement tamponné à sec avec du papier absorbant et ensuite plongé dans un moule tissu contenant PTOM (température de coupe optimale; Sakura Finetech Unis Inc, CA). Le tissu est ensuite congelé en utilisant un congélateur à -80 ° C et stockés à la même température jusqu'à ce que son prêt à être découpé.
4. Les fluorophores Alexa sont visibles directement après l'étiquetage et ne nécessitent pas de coloration supplémentaire. Par conséquent, après la perfusion des tissus WGA-Alexa tracés peuvent être coupés et montés pour l'imagerie ou directement imagés dans 4% des PFA comme une préparation wholemount. Nous avons constaté que l'imagerie des tissus de 4% PFA a donné le meilleur indice de réfraction pour l'imagerie de la topographie de projections tracées dans des échantillons entiers. Pour les sections, coupé de série Coron 40μm d'épaisseursections al sur un cryostat et les percevoir comme flottant sections dans le PBS. Compte tenu de la toxicité de l'IFP, en sorte qu'un masque approprié est porté pendant la perfusion et l'imagerie, garder la zone bien ventilée, et lorsqu'il n'est pas utilisé immédiatement retourner tout ou PFA PFA tissus fixés à des contenants scellés. Il est idéal si votre microscope est situé dans une hotte adaptée fumées.
5. Fibres WGA-HRP étiqueté peut être révélée à l'aide tétraméthylbenzidine (TMB) comme chromogène. Nous ne décrirons pas le protocole de coloration HRP ici car il a déjà été décrite en détail (Vogel et Prittie 1994;. Sillitoe et al 2010)
6. Pour BDA fibres étiquetés incubation des coupes de tissus flottant pendant 2 heures dans streptavidine-Cy3 (Cat. # 434315, Invitrogen, Carlsbad, CA) ou streptavidine-Alexa Fluor 488 ou 555 (Cat. # S11223 pour les 488 et Cat. # S21381 pour les 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), lavage en PBS puis monter avec FLUORO-GEL. Pour DAB, des coupes de tissus incuber une nuit dans un tampon de réaction de l'ABC (Cat. # PK-4000, Vecteur Laboratories, Inc Burlingame, CA), rincer 3 fois en PBS puis réagir pendant 5-10 minutes en DAB (0.5mg/ml, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA) complété avec 10 ul de 30% de H ₂ O ₂ pour chaque solution 50ml DAB.

3. L'immunohistochimie

1. L'immunohistochimie a été réalisée comme décrit précédemment (Sillitoe et coll. 2008). Brièvement, incuber les coupes de tissus dans 0,1 M PBS contenant 10% de NGS (END; Sigma, St. Louis MO), 0,1% de Tween-20 et les anticorps primaires (voir ci-dessous) pendant 16-18 heures à température ambiante. Laver les coupes de tissus à trois reprises dans du PBS, puis de les incuber dans des anticorps secondaire (voir ci-dessous) pour un maximum de 2 heures à température ambiante. Rincez le tissu nouveau et de révéler l'immunoréactivité comme décrit ci-dessous.
2. Pour déterminer la relation entre les cellules de Purkinje et les fibres moussues nous avons co-marqué libre coupes de tissus flottants utilisant des méthodes classiques de double coloration. Nous avons utilisé WGA-Alexa 555pour le traçage et Alexa 488 conjugué âne anti-souris des anticorps secondaire (Invitrogen / Molecular Probes Inc, Carlsbad, CA) pour détecter ZebrinII (1:250; aimable don du Dr Richard Hawkes, l'Université de Calgary, Calgary, Canada). ZebrinII est un anticorps monoclonal de souris et a été utilisé directement à partir de moyennes hybridomes culture dépensé. Le fluorophore conjugué anticorps secondaire ont été utilisés à une dilution de 1:1500. Après coloration des coupes de tissus ont été montés sur lames de verre chargé, puis lamelle avec FLUORO-gel dans un tampon Tris (Sciences de la microscopie électronique, Hatfield, PA) ou avec Vectashield hardset milieu de montage avec le DAPI (Cat. # H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) pour l'imagerie de fluorescence de couleur triple.
3. Nous avons testé la spécificité de l'anticorps secondaire par le traitement des coupes de tissus en l'absence d'anticorps primaires. Aucun signal n'a été détecté dans des expériences de contrôle, indiquant que la coloration, nous avons observé n'est pas dû aux signaux non spécifiques du ee Alexa anticorps conjugués (données non présentées).

4. Microscopie et analyse des données

1. Nous captons microphotographies des coupes de tissus en utilisant Leica DFC360 FX (fluorescence) et DFC490 (DAB et TMB a réagi coupes de tissus) des caméras montées sur un Leica DM5500 microscope.
2. Nous acquérir et d'analyser les images de coupes de tissus en utilisant Leica Application Suite et Leica Application Suite paquets logiciels FX.
3. Photomicrographies des échantillons entiers sont capturées en utilisant un Leica DFC3000 FX caméra montée sur un stéréomicroscope Leica MZ16 FA courir Leica Application Suite FX logiciel.
4. Tant de nos microscopes sont équipés de Leica Cy3 (modèle # 11600231) et FITC (modèle # 11513880) filtres, et la DM5500 avec une A4 supplémentaires DAPI / Filtre UV (modèle n ° 11504162).
5. Les images sont acquises après l'optimisation pour les sous / sur-exposition telle que déterminée en utilisant le logiciel Leica. Nous importons toutes les données brutes dans Adobe Photoshop CS4 et si nécessaire we corriger l'ensemble du champ de chaque image de la netteté, luminosité, contraste ou de niveaux seulement. Autres logiciels de retouche photo peut être utilisé comme préféré.
6. Les schémas présentés ici ont été élaborés dans Adobe Illustrator CS4.
7. Alexa 555 et CY3 neurones colorés, qui sont détectés comme le rouge en utilisant nos filtres, sont des pseudo-couleur magenta dans les images présentées dans le manuscrit.

Animaux

Toutes les études animales ont été réalisées selon un protocole animaux IACUC approuvé conformément aux directives institutionnelles au Albert Einstein College of Medicine. Mâle et femelle consanguine suisses Webster (Taconic, Albany, NY) ou consanguines C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) des souris ont été maintenues dans notre colonie et utilisé pour toutes les études. À midi le jour un bouchon vaginal a été détecté a été considéré comme jour embryonnaire 0,5.

5. Les résultats représentatifs:

Afférences spinocérébelleuse fin en parasagibandes ttal dans le cervelet (fig. 3; Voogd et al 1969;. Grishkat et Eisenman 1995; Vogel et Prittie 1994; Vig et al 2005;. Apps et Hawkes 2009; Sillitoe et al 2010;.. Reeber et al 2011). Nous avons injecté WGA-Alexa traceurs dans les bas-thoracique de la moelle épinière lombaire supérieure à démontrer: 1) que ces traceurs peuvent être utilisés pour toujours l'étiquette sous-ensembles spécifiques de terminaux dans le cervelet (fig. 3; Reeber et al 2011), 2). que WGA-Alexa traceurs sont intensément lumineux et peut être utilisé pour visualiser le schéma global de la topographie des fibres moussues dans cervelets ensemble (fig. 3;. Reeber et al 2011), 3) que WGA-Alexa 488 et 555 peut être utilisé en combinaison pour le traçage voies multiples chez le même animal (fig. 4), et 4) que WGA-Alexa traceurs sont compatibles avec la coloration immunohistochimique (fig. 5). Dans un travail récent, nous avons montré que WGA-Alexa terminaux étiquettes traceurs dans le cervelet dès 6 heures après la livraison du traceur dans la moelle épinière et sont un excellent choix pour retracer l'architecture des voies de développement (Reeber et al., 2011).

Figure 1. Installation de l'équipement pour fournir des traceurs in vivo. A. Une image de notre secteur chirurgical. B. Le bas-thoraciques supérieures région lombaire peuvent être identifiés en exécutant vos doigts le long des vertèbres de se sentir pour une bosse dans la colonne vertébrale. La laminectomie dorsale devrait être effectué à peu près au milieu de la «bosse», ce qui est indiqué par la flèche jaune.

Figure 2 Illustration d'une baisse thoracique -... Du segment vertébral supérieur lombaires avant et après laminectomie dorsale schématique d'un segment A. intacte vertébrale de la région inférieure du bois-thoracique-supérieure de la colonne vertébrale de souris B. Un Dorsalaminectomie L est effectuée en enlevant les apophyses épineuses de un ou deux segments vertébraux, après la coupe à mi-chemin entre la lamina articulaire et le processus dorsale épineuse.

Figure 3. WGA-Alexa traceurs sont intensément lumineux et peut être utilisé pour visualiser la topographie de projection afférentes à haute résolution. A. Le schéma illustre l'origine et la terminaison de WGA-Alexa 555 neurones marqués spinocérébelleuses. Image B. d'un site d'injection après avoir livré WGA-Alexa 555 dans la région lombaire, thoracique inférieure supérieure de la moelle épinière adulte. C. l'image de l'Wholemount lobules antérieurs suite d'une injection de WGA-Alexa 555 dans le bas du thorax-dessus région lombaire de la moelle épinière. D. WGA-Alexa 555 antérograde traçage des voies spino-cérébelleuse révèle des bandes de fibres moussues comme on le voit sur ​​une coopérationsection de tissu Ronal. Les lobules sont définis par des chiffres romains et les bandes les numéros d'étiquette des fibres moussues de chaque côté de la ligne médiane (s'applique à toutes les images). Barres d'échelle: B, C 500 um, 500 um D, 200 um.

Figure 4. WGA-Alexa traceurs sont efficaces pour l'étiquetage de multiples voies neurales chez le même animal. A. Wholemount schématique du cervelet de souris résumant le schéma global de spinocérébelleuse bandes de fibres moussues. WGA-Alexa 555 a été injecté dans la partie droite de la moelle épinière lombaire et WGA-Alexa 488 dans le même segment sur ​​le côté gauche. B. Comme vu sur une section de tissu coronaire couper à travers les lobules postérieurs, à la fois traceurs de WGA-Alexa étaient transporté vers le cervelet et étiquetée correctement sous-ensembles distincts de terminaux (voir aussi Reeber et al. 2011). Abréviations: taupeculier couche (ml); couche de cellules de Purkinje (PCL); couche de cellules granulaires (GCL); matière blanche (WM). Barres d'échelle: B, 100 um.

Figure 5. WGA-Alexa traceurs peuvent être utilisés en combinaison avec l'immunohistochimie et d'histologie pour triple marquage des neurones et des projections. A. WGA-Alexa 555 est déposé dans les terminaux des fibres moussues au lobule III. B. ZebrinII coloration révèle un tableau de cellules de Purkinje dans des bandes lobule III. C. DAPI coloration des noyaux des neurones et cellules gliales. D. Fusionné l'image des panneaux A, B, , et C montrant triple marquage de bandes afférentes, bandes de cellules de Purkinje, et cytoarchitecture général. EH. Des images à fort grossissement des régions boîte montré dans l'AD panneaux. Bandes de cellules de Purkinje sont numérotées comme décrit précédemment (revuedans (Apps et Hawkes 2009)). Abréviations: couche moléculaire (ml); couche de cellules de Purkinje (PCL); couche de cellules granulaires (GCL). Barres d'échelle: D, 500 um (AC), H, 500 um (pour EG).

Discussion

Nous avons décrit les détails chirurgicaux et techniques nécessaires à la réussite de traçage axonal et dendritique en utilisant un roman fluorescentes approche fondée sur des projections neurales étiquetage rapide dans le développement et la souris adulte. En utilisant WGA-Alexa, nous montrons comment les traceurs et marqueurs peuvent être utilisés pour analyser la topographie des circuits à motifs à haute résolution et en trois dimensions.

Beaucoup de traceurs sont disponibles pour le traçage des circuits neuronaux incluant la sous-unité B du choléra toxine, biocytine, Neurobiotin, leucoagglutinin Phaseolus vulgaris (PHAL), fluororuby, fluoremerald et fluorogold. En outre, les récents génétiques et viraux traceurs basée ont démontré que les sous-ensembles distincts moléculairement neuronale sont topographiquement reliés à leurs cibles avec une grande précision. Notez que bien que certains traceurs neuronaux sont essentiellement transportés soit dans le sens antérograde ou rétrograde (par exemple 10.000 MW par rapport BDA 3000 MW), des molécules traceurs sont souvent transportés dans les deuxles directions. Dans nos études, nous introduisons WGA-Alexa traceurs base comme des outils fiables pour les analyses neuroanatomiques des modèles de projection topographique. Nous montrons que WGA-Alexa fluorescence vive, est transporté rapidement, et est suffisamment polyvalent pour être couplé avec des marqueurs immunohistochimiques y compris ceux pour cérébelleuse compartiments sagittal (Fig. 3).

Nous avons trouvé plusieurs limites d'utilisation de WGA-Alexa en comparaison à d'autres traceurs disponibles neuroanatomiques. Contrairement à la BDA (Wu et al. 1999), nous avons précédemment montré que WGA-Alexa (et WGA-HRP) ne révèlent pas toute la morphologie des terminaisons terminaux complexes (Reeber et al. 2011). Toutefois, nous avons amélioré la valeur de l'information anatomique acquise bornes tracées par le jumelage de WGA-Alexa traçage avec coloration immunohistochimique pour transporteur du glutamate vésiculaire 2 (VGLUT2) et la cocaïne et les amphétamines peptide transcription réglementés (CART) immunohistochimie (Reeber et al 2011;. Reeber et Sillitoe, 2011). Uneautre défaut de WGA-Alexa est que le signal se dégrade assez rapidement sur les coupes de tissus, en dépit d'être monté dans les médias qui protègent le signal fluorescent. Par conséquent, nous avons généralement l'image des tissus immédiatement après la coupe, bien que l'imagerie dans les 2 jours de la coupe permet toujours fibres étiquetés et les terminaux à succès imagée. Il ya une tendance pour le signal de WGA-Alexa à perdre d'intensité au cours de l'immunomarquage des coupes de tissus. En utilisant moins de lave et de plus courte pendant la coloration peut minimiser ce problème. Une autre recommandation est de toujours monter et l'image d'un ensemble de sections de tissus tracé sur le jour de la coupe pour un ensemble de référence pour comparer avec les sections adjacentes qui seront traitées pour l'immunohistochimie. Dans nos mains OCT (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) intégré blocs de tissus conservés à -80 ° C après perfusion et cryoprotection peuvent être stockés pendant de longues périodes de temps sans aucune perte d'intensité du traceur.

Notre approaCH de fibres de traçage pourrait être facilement adapté pour le traçage des cartes neurales dans les voies corticales, le tronc cérébral, et la colonne vertébrale. Nous étudions actuellement la possibilité d'utiliser WGA-Alexa traceurs pour l'imagerie in vivo de la formation des circuits chez les animaux génétiquement modifiés et pour étudier la dynamique de la formation des circuits après des lésions des voies sélectives et les manipulations pharmacologiques. Depuis le transport rapide de WGA-Alexa traceurs permet d'analyse à court terme de notre approche a le potentiel pour révéler les changements dynamiques qui se produisent pendant la plasticité structurelle des circuits topographiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bead sterilizer	Fine Science Tools	Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Cauterizer	Fine Science Tools	Cat. # 18000-00
Borosilicate glass capillaries	Harvard Apparatus	Cat. # 300056
Dual stage Glass Micropipette Puller	Narishige International	Model 001-PC-10
Micrometer syringe	Gilmont Instruments	Cat. # GS-1100
Small Animal Stereotaxic Instrument	Kopf Instruments	Model 940-A
Electrode Manipulator	Kopf Instruments	Model 960
Vetcare chamber	Harvard Apparatus	Cat. # 340508
Heating Pad	Harvard Apparatus	Cat. # 341241
Leica DFC360 FX camera	Leica Microsystems	DFC360 FX
Leica DFC490 camera	Leica Microsystems	DFC490
Leica DM5500 microscope	Leica Microsystems	DM5500
Leica DFC3000 FX camera	Leica Microsystems	DFC3000 FX
Leica MZ16 FA microscope	Leica Microsystems	MZ16 FA
CY3 Filter	Leica Microsystems	Model # 11600231
FITC Filter	Leica Microsystems	Model # 11513880
A4 DAPI/UV filter	Leica Microsystems	Model # 11504162
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Cat. #W11261
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate	Invitrogen	Cat. #W32464