Summary
يمكن الاختلاف المظهري لصفات نتيجة طفرات في رابطة الدول المستقلة التنظيم متواليات (CRE) العناصر التي تحكم أنماط التعبير الجيني. ويمكن اشتقاق طرق لاستخدامها في melanogaster ذبابة الفاكهة مقارنة كميا مستويات الأنماط المكانية والزمانية في التعبير الجيني بوساطة لجنة المساواة العرقية المتغيرات تعديل أو طبيعيا.
Abstract
يتم تحديد أنماط التعبير الجيني من قبل رابطة الدول المستقلة التنظيم متواليات (CRE) عنصر ، والتي تسمى أيضا القدرة على رابطة الدول المستقلة أو وحدات تنظيمية. إن لجنة المساواة العرقية نموذجية تمتلك ترتيب المواقع ملزمة لعدة بروتينات عامل النسخ التي تمنح منطق تنظيمية تحدد متى وأين ، وعلى أي مستوى يتم التعبير عن هذا الجين للوائح (ق). مجموعة كاملة من CREs داخل الجينوم الحيواني بترميز البرنامج الحي للتنمية 1 ، والتجريبية ، وكذلك الدراسات النظرية تشير إلى أن طفرات في CREs لعبت دورا بارزا في تطور المورفولوجية 2-4. علاوة على ذلك ، الجينوم البشري واسعة جمعية دراسات تشير إلى أن الاختلاف الجيني في CREs يسهم بشكل كبير في الاختلاف المظهري 5،6. وبالتالي ، فهم المنطق التنظيمي ، وكيف تؤثر الطفرات هذا المنطق هو الهدف الرئيسي لعلم الوراثة.
الجينات المحورة مراسل توفير وسيلة قوية لدراسة في FUNC فيفونشوئها من CREs. هنا يقترن تسلسل CRE معروفة أو يشتبه في المروج غيروي وتسلسل الجين الترميز لترميز مراسل منتج البروتين يمكن ملاحظتها بسهولة. عندما يتم إدراج التحوير الصحفي إلى كائن المضيف ، ونشاط لجنة المساواة العرقية لتصبح مرئية في شكل البروتين مراسل المشفرة. وقد استخدمت ف العنصر transgenesis توسط في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة الأنواع (دال) melanogaster 7 على مدى عقود لإدخال الجينات المحورة المراسل في هذا الحي النموذجي ، على الرغم من أن التنسيب الجينومية من الجينات المحورة عشوائي. وبالتالي ، يتأثر بقوة مراسل نشاط الجينات من لونين الجينات المحلية والبيئة ، والحد من المقارنات لجنة المساواة العرقية النوعي الحاضر. في السنوات الأخيرة ، تم تعديل نظام التكامل phiC31 استنادا لاستخدامها في melanogaster دال لادخال الجينات المحورة في مواقع محددة الجينوم الهبوط 8-10. جعلت هذه القدرة على القياس الكمي للجينات ، وذات الصلة هنا ، لجنة المساواة العرقية النشاط 11-13 الحديدasible. ويمكن إنتاج ذباب الفاكهة المعدلة وراثيا يمكن الاستعانة بمصادر خارجية ، بما في ذلك على أساس التكامل phiC31 ، مما يلغي الحاجة لشراء معدات باهظة الثمن و / أو لديها الكفاءة في البروتوكولات المتخصصة حقن التحوير.
هنا ، نقدم بروتوكول عام لتقييم كمي لنشاط لجنة المساواة العرقية ، وتبين كيف يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس الآثار المترتبة على الطفرة أدخلت على نشاط لجنة المساواة العرقية ومقارنة أنشطة CREs orthologous. على الرغم من أن الأمثلة المذكورة هي لجنة المساواة العرقية نشط خلال التحول ذبابة الفاكهة ، يمكن تطبيق النهج المتبع في مراحل النمو الأخرى ، وأنواع ذبابة الفاكهة ، أو الكائنات النموذج. في نهاية المطاف ، يجب استخدام أكثر انتشارا لهذا النهج إلى CREs دراسة مسبقة لفهم منطق التنظيمية والمنطق كيف يمكن أن تختلف وتتطور.
Protocol
نظرة عامة :
هذا الفيديو يوضح بروتوكول قادرة على قياس الكمي لأنشطة تنظيمية لرابطة الدول المستقلة الجين التنظيم متواليات (CRE) عنصر في melanogaster (دال) ذبابة الفاكهة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للمقارنة بين الأنشطة التنظيمية التي تمتلكها : نوع البرية وأشكال متحولة لجنة المساواة العرقية ، طبيعيا وجدت لجنة المساواة العرقية الأليلات ضمن الأنواع ، أو بين الأنواع CREs orthologous تباينت.
1. مواقع محددة من الجينات المحورة مراسل التكامل في جينوم ذبابة الفاكهة melanogaster
ألف البناء مراسل التحوير
- كخطوة أولى ، أي يجب أن تكون لجنة المساواة العرقية تقييمها بشكل منفصل المستنسخة في ناقلات المراسل الذي يحتوي على (1) المرفق attB موقع البكتيرية تسلسل المستخدمة في مواقع محددة التكامل التحوير 11/08 ، (2) موقع الاستنساخ متعددة من المنبع (3) غيروي المروج التي تبعتها تسلسل (4) ترميز لالفلورسنتالبروتين (مثل EGFP أو DsRed).
- بينما يمكن إجراء أي متجه متوافقة لphiC31 بوساطة الاندماج موقع محدد من خلال إدخال تسلسل attB في العمود الفقري النواقل ، ويمكن الحصول على ناقلات pS3aG12 - 14 من مستودع البلازميد addgene (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG هو نسخة مخصصة من التحول ف تستند vector15 التي تم استبدال العوازل واحدة من اثنين من الغجر عازل SfIb ، انها تحتوي على تعزيز موقع الاستنساخ متعددة ، وتمتلك 250 زوج من قاعدة تسلسل تحتوي على موقع مرفق attB. تندس CREs الفائدة في موقع الاستنساخ متعددة من المنبع المروج an hsp70 والحد الأدنى من الجينات التي تكود EGFP وهو نسخة مطورة من البروتين الفلوري الأخضر الذي يموضع إلى النواة.
باء بمواقع محددة من الجينات المحورة مراسل التكامل
- لمجموعة من الأنشطة التي CREs أن تكون مقارنةد كجزء من ناقلات مراسل التحوير ، وحدة متكاملة لإنشاء ناقلات في موقع الهبوط الجيني نفسه. هنا integrase بالعاثية phiC31 بروتين يحفز على إعادة التركيب أحادي الاتجاه بين موقع البكتيرية المرفق (attB) في ناقلات التحوير وبالعاثية يقع genomically (attP) موقع المرفق 9. جعلت عدة مجموعات 8-11 مجموعة متنوعة من خطوط المعدلة وراثيا والتي تشتمل على موقع attP (مواقع الهبوط ما يسمى) وتحتوي على 8 من مصدر الجينومية phiC31 التي تعبر عن هذا البروتين في الخلايا الجرثومية. يمكن لهذه المخزونات يمكن الحصول عليها بسهولة يطير من مركز بلومينغتون الأسهم ذبابة الفاكهة (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
- بروتوكول نشر موجود بالتفصيل كيفية إنشاء موقع على ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا على وجه التحديد باستخدام phiC31 integrase 16. المعدات والخبرات التقنية اللازمة لجعل ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا لىلم يعد مطلوبا الأخبار كباعة وجود عدة (الجدول 1) لهذه الخدمة الذي يمكن الاستعانة بمصادر خارجية.
- يمكن التحوير السلوك تختلف اختلافا كبيرا من الأنسجة في 11 المقبل. وبالتالي هبوط attP موقع واحد ليست الأمثل لتحليل جميع CREs ، ومراحل النمو ، و / أو أنسجة من الدراسة. فمن المستحسن لتقييم نشاط لجنة المساواة العرقية في المصالح في العديد من مواقع الهبوط مختلفة من أجل العثور على الموقع حيث نشاط لجنة المساواة العرقية هو ممثل الجينات المستهدفة الذاتية (ق) نمط التعبير.
- لخطوط المعدلة وراثيا التي تم الحصول عليها فإنه من المستحسن لجعلها متماثلة اللواقح بالنسبة للالتحوير. لجنة المساواة العرقية النشاط عموما أكثر قوة في الأفراد مع نسختين من التحوير والقياسات الكمية من الضروري أن يتم إجراء مقارنات بين الأفراد مع نفس العدد من النسخ التحوير. ويمكن الحصول على الأفراد من خلال استخدام متماثل من الكروموزومات موازن. لمواقع الهبوط على الرغم من تميز جيدا ، غالبا ما يكون لياليimpler لجمع الذكور والإناث البكر ، وعبر تلك العين مع النمط الظاهري أكثر كثافة اللون التي يمنحها هذا الجين صغيرة بيضاء (الشكل 1) ، وإنقاذ بيضاء متحولة التي قدمتها ناقلات التحوير المتكاملة هي أكثر درامية في الأفراد مع اثنين من ناقلات نسخة.
2. الحصول على عينات من أنسجة أو المرحلة التنموية المناسبة
الحصول على عينات لتحليلها في ذلك الوقت في التنمية عندما نمط التعبير الجيني (ق) من الفائدة تحدث (ق) التطور الطبيعي ، وبالتالي الوقت الذي يكون فيه لجنة المساواة العرقية في إطار التحقيق يجب تفعيل مراسل التعبير الجيني. لذبابة الفاكهة ، وهذا يمكن أن يكون ، إما اليرقات الجنينية ، ومراحل العذراء أو الكبار. أدناه وصفنا أسلوبا لمرحلة الذباب الكبار والمتحولة ، وهذه الأخيرة التي تجري داخل puparium ، والجلد من الصعب اليرقات التي تحتوي على عينة جامدة حتى ecloses كشخص بالغ.
- توسيع خطوط المعدلة وراثيا لضمان specimENS للمرحلة المناسبة عندما تتوفر على استعداد لتحليل التعبير الجيني مراسل بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. إنشاء شركتين في كل قارورة مع (~ 5 -- 10) عدة الذباب الذكور والإناث. في أيام بالتناوب ، نتوء الذباب من إحدى القنينات إلى قارورة غير المستخدمة. كرر هذا لمدة أسبوع. بحلول نهاية الاسبوعين المقبلين ذباب الفاكهة المعدلة وراثيا أن تكون متاحة لمجموعة من مراحل تطور اليرقات الكبار.
- التدريج الذباب الكبار : مدة من الوقت الذي يقضيه داخل puparium هو 98 ساعة للإناث و 102 ساعة للذكور عندما تربى عند 25 درجة مئوية. يمكن جمعها بسهولة الذباب الكبار عندما تخرج من puparium (تسمى eclosion). ويمكن اعتبار هذا timepoint 0 eclosion آخر ساعة. يمكن تربيتها الذباب الكبار حتى timepoint المطلوبة للتحليل. على سبيل المثال ، ودعا لجنة المساواة العرقية oe1 ميل ، التي تسيطر على التعبير عن الجينات desatF في oenocytes الكبار د. melanogaster الإناث غير نشطة على الفور بعد ولكن لجنة المساواة العرقية eclosion السويسري النشاطtches يوم بعد يوم واحد 14. عندما يتم الحصول على مرحلة تصحيح ، تخدير الذباب وضعه في قطرة من النفط الهالوكربون على شريحة والشروع في تقييم مبائر.
- التدريج العينات خلال التحول : في ختام المرحلة الثالثة واليرقات طور مرحلي يتم تشكيل puparium. في هذه المرحلة على الرغم من هذا الحيوان هو من الناحية الفنية لا يزال طور مرحلي اليرقة الثالثة ، وهذه المرحلة التنموية التي يسهل التعرف عليها باعتبارها العينة غير المتنقلة ، وpuparium لينة والأبيض ، ولقد spiracles مقلوبة (الشكل 2A). ويمكن اعتبار هذا timepoint 0 ساعة بعد تشكيل Puparium (hAPF). في هذه المرحلة ، يمكن التمييز بين الذكور من الاناث ، من خلال وجود الغدد التناسلية التي تقع بالقرب من نقطة الوسط ثنائيا من الجسم التي تظهر كدوائر شفافة (محاصر في الشكل 2A ويشار إليه السهم الأسود في 2A ").
1. التدريج على أساس طول التحول :
في hAPF 0 ، يمكن نقل العينات إلى قارورة جديدةطبق بتري أو مبلل باستخدام فرشاة الطلاء. للحفاظ على عينات من الجفاف ، إضافة إلى قطعة من Kimwipe وبلل بالماء. قارورة نقل أو الطبق إلى الحاضنة 25 درجة مئوية حتى hAPF المطلوب.
2. التدريج من المميزات الشكلية وضوحا :
غالبا ما يكون غير مناسب لتحليل العينات لنشاط لجنة المساواة العرقية في timepoint المحددة التالية جمع العينات hAPF 0. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن يحدد بشكل صحيح العينات نظموا في وقت مناسب للتحليل على أساس وجود وموقف العديد من علامات المورفولوجية (مفصلة أدناه) التي هي واضحة من خلال puparium أو بعد إزالة puparium (الشكل 2).
2A. المورفولوجية معايير لتقريب المرحلة المتحولة :
- مقلوبة spiracles الأمامي (السهم في الشكل 2A) ؛ ؛ الابيض prepupa مرحلة اليرقة حيث تتوقف عن التحرك القصبة الهوائية الجانبية مرئية ؛ الناعمة البيضاء puparium (الشكل 2A) : 0 hAPF.
- ~ 14 hAPF :المدبوغة وتصلب Puparium ؛ رأسه كيس مقلوبة ؛ القصبة الهوائية الجانبية والغدد التناسلية أقل وضوحا ؛ أرجل وأجنحة ممتدة على طول البطن تماما ؛ نبيبات مالبيغي يست بارزة بعد والخضراء (المنطقة محاصر متقطع في الشكل 2B) ؛ وشعر عديم الصبغة العينين (الشكل 2B ') .
- ~ 25 hAPF : اثنان نبيبات مالبيغي متوازية بارزة ولون أخضر (متقطع المنطقة محاصر في الشكل 2C).
- ~ 40 hAPF : الجسم الأصفر الأخضر الداكن وضعه بين طرفي الأمامي من نبيبات مالبيغي (رأس السهم الأحمر في الشكل 2D).
- ~ 50 hAPF : الجسم الأصفر وضعه في منتصف لنبيبات مالبيغي (المنطقة محاصر في الشكل 2E وتوسيعها في ''2E) والعينين ولون العنبر في حال البرية لنوع الجينات البيضاء (اللازمة للون العين الحمراء) . لون العين غير موجودة في هذه المرحلة عندما يتم انقاذ النمط الظاهري الأبيض بواسطة الجينات الطافرة الصغيرة البيضاء التي هي جزء من ناقلات مراسل التحوير المتكاملة (الشكل 2E ').
- ~ 80 hAPF : نصائح الجناح الرمادي ، الواقعة بين النبيبات مالبيغي الأمامي إلى منتصف البطن (المنطقة محاصر في شكل موسع في 2G و 2G ") ؛ طيات البطن وبين شرائح شعيرات على البطن tergites مرئية (الشكل و2G 2G ") ، وانقذ لون العينين أحمر مشرق (الشكل 2G').
- ~ 90 hAPF : أجنحة مظلمة إلى الأسود ؛ نبيبات مالبيغي والجسم الأصفر تحجب دباغة tergites ؛ الصدري (السهم) والبطن شعيرات تنضج وأظلمت (الشكل 2H) ، والعقي الأخضر ويظهر في الطرف الخلفي الظهرية من البطن ( التين. 2H '').
ملاحظات :
- في Laالشركة المصرية للاتصالات من مراحل التحول ، يمكن تحديد جنس العينات التي التشكل التناسلية (النصال في الشكل و2I 2J) أو وجود الجنس أمشاط مظلمة على أول مجموعة من الساقين من الذكور.
- ويمكن تحقيق مزيد من الدقة في النظر في التدريج بواسطة علامات المورفولوجية إضافية كما هو موضح سابقا 17.
دال خطوات لإزالة عينة من puparium :
- باستخدام شريط المختبر التقيد قطعة من الشريط التعبئة والتغليف إلى لوحة تشريح مع السطح لزجة تواجه صعودا.
- الرطب فرشاة الدهان والرطوبة تنطبق على العينات pupariated. باستخدام فرشاة الطلاء ، ونقل العينات إلى Kimwipe.
- باستخدام الملقط أو نقل العينات الفرشاة ، على الشريط التعبئة والالتزام مع السطح الظهري مواجهة (الجانب المنحني puparium).
- تسمح عينات لتجف لمدة 15 دقيقة ~. puparium الجافة هي أسهل بكثير لفتح من تلك التي تكون رطبة. عند هذه النقطة يمكن أن تكون العينات التي قام خشنا المورفولوجيةمرئية من خلال puparium علامات.
- باستخدام ملقط ، فتح تدريجيا حتى بداية puparium في الوصاد الأمامي والمضي قدما نحو نهاية الخلفي. ويمكن في حال الحاجة إلى مزيد من تشريح غرامة النطاق لعزل الأنسجة محددة يمكن القيام بذلك في كوب مشاهدة برنامج تلفزيوني مع الحل. خلاف ذلك ، ونقل الشرانق إلى قطرة من النفط اللزج الهالوكربون HC700 (سيغما الدريخ) على شريحة المجهر.
- وضعه في العينات على شريحة ، وذلك باستخدام stereomicroscope ، واستخدام المعايير الموصوفة أعلاه (القسم 2A) ويمكن تحديد مرحلة لعينة..
3. المجهرية التقييم مبائر التعبير الجيني في عينة مراسل جبل كامل
- لعينات جبل بأكمله ، استخدم أحد أهداف 4X أو 10X. باستخدام مضان يحفزه التعرض مصباح الزئبق ، أو بدلا من ذلك عن طريق عرض في هذا المجال مشرق ، وضبط المرحلة مجهر لعينة الموقف في حقل بصري ثم جلب عينات إلى التركيز.
- باستخدام microsco مبائربي البرمجيات ، وضبط الطول الموجي للالإثارة EGFP (أو طول موجة مناسبة عند استخدام بروتين آخر الفلورسنت).
- لمنع photobleaching عينة ، تبدأ كثافة الليزر من 5-10 ٪. إذا الإشارة مخيب ثم زيادة كثافة حسب الحاجة.
- من أجل تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء عن الصور مبائر ، تمكين إعدادات البرامج التي قياسات متوسط بكسل من تكرار عمليات التفحص ؛ مثل كالمان المتوسط أو خط المتوسط والمكدس. في تجربتنا كالمان في المتوسط لمدة ثلاثة بمسح يحسن إشارة إلى نسبة الضوضاء دون اتخاذ الوقت لجمع الصور وقتا طويلا.
- لإجراء المقارنات الكمية للنشاط لجنة المساواة العرقية فمن الضروري أن كثافة مضان لعينة لم تشبع بكسل كثيرة. باستخدام Z - المقطع الذي يظهر مضان على أشده ، وضبط الإعدادات بحيث تكون مشبعة بكسل قليلة. ويمكن القيام بذلك عن طريق التحول إلى جدول بحث تشبع الإنذار وضبط الجهد القناة ، واكتساب ، ويقابلإلى المواقع التي يكون فيها المشبعة بكسل قليلة. أخيرا ، من أجل جمع ما يكفي من الإشارات عينة غالبا ما يكون من الضروري تعديل الفتحة مبائر.
- مرة واحدة يتم تحديد الإعدادات المثلى ، تشغيل ض الفحص.
- عند اكتمال التفحص تحويل المكدس الصورة في إسقاط هذه الصورة وحفظها في ملف تنسيق الصورة المرتبطة دلاليا أو "TIFF".
ملاحظة :
- فمن الضروري استخدام نفس الإعدادات مبائر لجميع العينات وتكرار خطوط التحوير مراسل التي سيتم تضمينها في مقارنة كمية من أنشطة لجنة المساواة العرقية.
4. قياس نشاط رابطة الدول المستقلة التنظيم العنصر
في حين أن بعض البرامج اقتناء مبائر يسمح لمزيد من المعالجة للصور الإسقاط ، ونحن نفضل استخدام J صورة متاحة بحرية برنامج حاسوبي لتقييم الصور مبائر 18. باستخدام صورة J 18 سجلت أنماط التعبير GFPيمكن كميا على أنها إحصاءات قيمة بكسل ضمن منطقة محددة. على الرغم من أن الصور لا تحتاج إلى أن تكون في نطاق والرمادي كننا نفضل ان نفعل ذلك.
- مع برنامج J بدأت صورة ، افتح صورة TIFF التي يتم تقييمها.
- انقر على زر اختيار يدوي ومخطط المنطقة للعينة حيث الكميات المطلوبة ، على سبيل المثال في المنطقة في الشكل (3) ضمن الحدود أصفر متقطع. (انظر الملاحظة ألف أدناه فيما يتعلق باختيار منطقة لquantitate).
- للحصول على قيمة إحصائية بكسل ، انقر فوق علامة التبويب تحليل ثم حدد الاجراء. وسوف تظهر النتائج تظهر مربع في المنطقة ، وقيمة بكسل عشرات يعني الحد الأدنى والأقصى. سجل قيمة بكسل يعني درجة وتكرار لتوليد إحصاءات قيمة بكسل لعينات تكرار (انظر ب ملاحظة حول عدد تكرار).
- نوصي جمع بكسل يعني second قيمة من منطقة التحكم فيها لجنة المساواة العرقية ليست نشطة ، على سبيل المثال في المنطقة في الشكل (3) ضمن الحدود الحمراء متقطع. هذا الأخير فالويمكن طرح رق من القيمة السابقة لإزالة آثار الخلفية من القياس للحصول على بكسل يعني تعديل القيمة. في تجربتنا هذه كذلك يقلل من التباين بين العينات تكرار (انظر ج مذكرة بشأن اختيار حجم لمنطقة التحكم).
- استخدام تعديل قيم بكسل يعني من عينات تكرار لحساب متوسط النشاط التنظيمي لجنة المساواة العرقية والخطأ المعياري للمتوسط. ويمكن مقارنة هذه القيمة النشاط التنظيمي وقياس الخطأ إلى الجينات المحورة مراسل الأخرى حيث تسلسل لجنة المساواة العرقية يختلف (على سبيل المثال الشكل 3).
ملاحظات :
- صورة J يسمح للمستخدم لتحديد شكل المنطقة المحددة والتي سيتم تحديد قيمة بكسل يعني النتيجة. لكن ، وكما يختلف حجم العينة غالبا ما نفضل استخدام أداة اختيار حر لتحديد المنطقة التي سيتم تقييمها لكل عينة.
- عدد أكبر من يكرر (N) عن نتائج أفضل في تقدير يعني regulatory نشاط لجنة المساواة العرقية معين. نجد أن N بين 4 و 8 عموما كافية.
- في تجربتنا حجم منطقة التحكم المحدد له تأثير ضئيل على القيمة يعني بكسل قياس للمنطقة المراقبة. بشكل عام ، ونحن حدد مساحة النسبي في حجم لمساحة الفائدة.
5. ممثل النتائج :
وهناك نسخة من نوع البرية دال melanogaster لجنة المساواة العرقية ، ودعا العنصر ديمبرافيك 13 محركات على مستوى عال من التعبير مراسل EGFP في البطن الجزء A6 من الشرانق الإناث (الشكل 3A). وعثر على 13 قاعدة الزوج ضمن تسلسل هذا العنصر ليكون موقع ملزم للعامل النسخ DSX ، ويمكن أن يدل على أهمية المجراة من هذا التسلسل عن طريق قياس النشاط التنظيمي لهذا عندما تحولت لجنة المساواة العرقية في هذا الموقع ملزمة. النظر في النشاط التنظيمي للعنصر نوع ديمبرافيك البرية لتكون 100 ± 5 ٪ ، وخفض طفرة في هذا الموقع ليموزين DSXulatory النشاط إلى 28 ± 3 ٪. ويمكن أن يتم إجراء مقارنات مماثلة من النشاطات التنظيمية للجنة المساواة العرقية الأليلات intraspecific أو بين CREs orthologous من الأنواع منفصلة. على سبيل المثال ، النظر في مستويات EGFP في الجزء A6 الإناث يقودها د. melanogaster كانتون S سلالة كنشاط التنظيمية من 100 ± 4 ٪ ، CREs orthologous للأنواع دال simulans ودال. تم العثور على willistoni لامتلاك الأنشطة التنظيمية على التوالي تساوي 75 ± 4 ٪ و 0 ٪ ± 0 (الشكل 3B).
الشكل 1. استخدام كثافة النمط الظاهري العين البيضاء الانقاذ المعدلة وراثيا لجعل خطوط متماثل. من أجل تقييم كمي الجينات المحورة مراسل المهم أن كل العينات لديها نفس النمط الجيني مراسل التحوير. (أ) يستخدم الجين الطافر أبيض الخلفية الجينية مع موقع attP تسلسل الهبوط ليالي الموقع pecific التحوير التكامل. المعدلة وراثيا يمكن الأفراد (B) وعادة فرداني الزيجوت (C) متماثلة اللواقح بالنسبة للناقلات متكاملة يمكن تمييزها من شدة النمط الظاهري لون العين انقاذ من قبل عدد من نسخ من الجين مصغرة متكاملة الأبيض. لا يمكن إنشاء خطوط متماثلة اللواقح عن طريق الذباب (C) معبر الذكور والإناث مع النمط الظاهري العين أحلك اللون.
الشكل 2. المورفولوجية باستخدام علامات لتحديد المرحلة المتحولة لذبابة الفاكهة. خلال التحول من يرقة ذبابة الفاكهة إلى الكبار ، والتحولات عينة من خلال سلسلة من morphologies النمطية التي يمكن استخدامها لتحديد الجنس والاقتراب من مرحلة التطوير. تمت إزالة العينات في البوسنة والهرسك من puparium بهم. مربعات في لوحات A ، E ، F ، G و H تشير إلى التكبير في مناطق على التوالي لوحات ألف "هاء" ، واو "، ز" و "ح.
"الشكل 3" SRC = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" />
الشكل 3. المقارنة الكمية للأنشطة رابطة الدول المستقلة عنصر التنظيم. لجميع العينات تم تقييم EGFP - مراسل التعبير الجيني بوساطة عنصر ديمبرافيك سيما في الإناث بنسبة 80 بعد ساعات من تشكيل puparium. رقم في أعلى كل صورة هي التعبير عن مستوى EGFP للعينة التي يتم حسابها كقيمة بكسل يعني للجزء البطن A6 (المشار إليها للصورة اليسار العلوي ومعظم المنطقة الحدودية داخل الأصفر متقطع) ناقص يعني قيمة بكسل للجزء A4 (تصحيح الخلفية ؛ وتبين للصورة اليسار العلوي ومعظم المنطقة ضمن الحدود الحمراء متقطع). وجرى تقييم لكل مراسل التحوير four متماثلة لحساب الجزء A6 يعني قيمة بكسل. وتفيد التقارير النشاط التنظيمي كما ٪ من نوع (A) أو البرية (ب) سلالة كانتون S الإناث يعني قيمة بكسل ± SEM. (أ) للإناث GFP التعبير امتلاك أليل من النوع البريديمبرافيك العنصر ونسخة متحولة حيث ablated موقع واحد ملزم للعامل النسخ DSX. خفض هذا الموقع متحولة ملزمة ديمبرافيك النشاط العنصر إلى 28 ± 3 ٪ من تسلسل نوع البرية. (ب) مقارنة بين الأنشطة التنظيمية للتسلسل orthologous إلى دال melanogaster ديمبرافيك العنصر (السلالة كانتون S). النظر في التعبير GFP بوساطة من قبل د. melanogaster أليل العنصر ديمبرافيك الى 100 ٪ ، وتسلسل orthologous من الأنواع ذات الصلة دال simulans ودال. willistoni تملك على التوالي أنشطة 75 ± 4 ٪ و 0 ٪ ± 0.
6. المواد
| اسم المادة | نوع | شركة | كتالوج رقم | تعليق |
| موقع على حدة التكامل التحوير | خدمة | أفضل الجينات | خطة H | اختيار موقع الهبوط ، تتلقى خطوط transformant |
| الهالوكربون النفط | الكاشف | سيغما الدريخ | H8898 | تستخدم لتركيب العينات للتصوير مبائر |
| دومون # 5 الملقط | أداة | أدوات العلوم غرامة | 11252-40 | غرامة وأشار ودائم للتشريح |
| SZ61 مجهر تكبير ستيريو | أداة | اوليمبوس | تخصيص | البصريات ممتازة للعمل مع ذبابة الفاكهة |
| FluoView مجهر متحد البؤر | أداة | اوليمبوس | تخصيص | ويوفر صور عالية الدقة مبائر |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم ترميز البرنامج الجيني الذي يحدد أنماط التعبير الجيني ، وبالتالي في عملية التنمية 1 ، ومواقع بارزة لكل من الطفرات الكامنة وراء تطور المورفولوجية 2-4 والتباين المظهري لصفات الإنسان 5،6،19. على الرغم من هذه الأهمية ، لا تزال غير مفهومة تماما المنطق التنظيمي لCREs. وكان أحد الأسباب البارزة لهذا العجز في فهم عدم وجود طرق مناسبة للمقارنة كميا متواليات الوظيفية للCREs. هنا نقدم البروتوكول الذي تستفيد من وسائل لتحسين transgenesis D. melanogaster إضافة إلى الجانب الكمي لدراسة CREs.
في تجربتنا عند قياس نشاط لجنة المساواة العرقية والتنظيمية ، والتباين بين عينات من تكرار هو 10 ٪ أو أقل من قيمة بكسل يعني عندما يتم تعديلها (1) من المرحلة التنموية ويكرر نفسه (2) ومراسل والتحويرفي موقع هبوط الجيني نفسه. هذا القدر من التباين ويتفق مع هذا العزم لCREs المعروضة في الشكل 3 ، وأماكن وجود قيود على استخدام هذا الأسلوب الكمي لحالات حيث إصدارات متميزة وراثيا من لجنة المساواة العرقية تختلف في النشاط التنظيمي من خلال قيمة أكبر من 10 ٪. على الرغم من الأهمية ، وهذا القيد هو تحسن كبير على نوعية من أوصاف "تخفيض" أو "زيادة" أن أولئك الذين يدرسون CREs سبق لاستخدامها عند وصف النشاط متفاوتة.
عندما يكون معروفا من إصدارات لجنة المساواة العرقية أو من الناحية الكمية وجدت أن تختلف في أنشطتها التنظيمية ، وهذا البروتوكول الذي يجعل من الممكن تحديد الاختلافات طفرية أو مسؤولة عن المساهمة في النشاط الفرق 12،13. القدرة على تحديد هذه الطفرات وظيفيا ذات الصلة هو خطوة أولى ضرورية لتحديد الآليات الجزيئية ، مثل مكسب أو خسارة transcriمواقع ption عامل ملزم ، مما تسبب في أنشطة لجنة المساواة العرقية في الاختلاف. نتطلع إلى الأمام ، وينبغي استخدام هذا البروتوكول لCREs ذبابة الفاكهة الأخرى ، وتطبيق أساليب مماثلة في البروتوكولات نموذج للكائنات أخرى تسمح لفهم أفضل لمنطق لجنة المساواة العرقية في الظهور. وهذا يشمل القدرة على التمييز وظيفيا ذات الصلة الطفرات لجنة المساواة العرقية من مستنقع وظيفيا محايدة الطفرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نشكر : نيكولا Gompel وبنيامين برودوم لمساهماتها في تطوير هذا البروتوكول ؛ ميليسا ويليامز ، وأربعة للحصول على تعليقات المراجعين المجهولين على المخطوطة ، وكلية الدراسات العليا في جامعة دايتون للزمالات الأبحاث لحرب ، وعلم الأحياء في جامعة دايتون القسم ومعهد البحوث (UDRI) لدعم البحوث لTMW. وأيد هذا العمل من قبل أمريكا 11BGIA7280000 القلب المنح لجمعية TMW.
References
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , Academic Press. (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , England. (2007).
- Drosophila: A laboratory handbook. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
