Summary
Özellikler için Fenotipik varyasyon cis-düzenleyici element (CRE) dizileri kontrol eden gen ekspresyonu mutasyonlar sonucu. Drosophila melanogaster kullanmak için türetilmiş yöntemler kantitatif değişiklikte ya da doğal olarak meydana gelen CRE türevleri aracılı gen ekspresyonu mekansal ve zamansal kalıplarının seviyelerini karşılaştırmak.
Abstract
Gen ekspresyonu arttırıcılar veya cis-düzenleyici modülleri de denir cis-düzenleyici element (CRE) dizileri, tarafından belirlenir. Tipik bir CRE için bağlayıcı siteleri nerede ve ne düzeyde düzenlenmiş gen (ler) ifade edildiği zaman, belirten bir düzenleme mantığı ile görevlendirebilir birkaç transkripsiyon faktörü proteinleri bir düzenleme sahiptir. Tam bir hayvan genom içinde Cres organizmanın gelişimi 1, ve ampirik için program, teorik çalışmaların yanı sıra Cres mutasyonlar morfolojik evrim 2-4 önemli bir rol oynadığını göstermektedir kodlar . Ayrıca, insan genomunun geniş dernek çalışmaları Cres bu genetik varyasyon fenotipik varyasyon 5,6 önemli ölçüde katkıda göstermektedir. Böylece, düzenleyici mantığını anlamak ve nasıl mutasyonların böyle bir mantık etkileyen genetik merkezi bir hedeftir.
Muhabir transgenlerin in vivo işlev çalışmak için güçlü bir yöntem sağlarCres TION. Burada bilinen ya da şüphelenilen bir CRE dizisi heterolog organizatörü ve kodlama kolayca gözlemlenebilir bir protein ürünü bir muhabir gen için kodlama dizileri birleştirilmiştir. Bir muhabir transgen bir konak organizma içine takıldığında, CRE faaliyet kodlanmış muhabiri protein formunda görünür hale gelir. Meyve sineği türleri Drosophila (D.) melanogaster 7 P-eleman aracılı transgenesis transgenlerin genomik yerleştirme rastgele olmasına rağmen, onlarca yıldır bu model organizma içine muhabiri transgenlerin tanıtmak için kullanılır olmuştur. Bu nedenle, muhabir gen aktivitesi güçlü olmayı niteliksel CRE karşılaştırmalar sınırlayan yerel Kromatin ve gen çevre tarafından etkilenir. Son yıllarda, phiC31 tabanlı entegrasyon sistemi, belirli bir genomu iniş siteleri 8-10 transgenlerin eklemek için D. melanogaster kullanım için adapte edilmiştir. Bu yetenek CRE faaliyet 11-13 fe gen kantitatif ölçümü yapılmış ve, ilgili, buradaasible. Transgenik meyve sinekleri üretim ihtiyacını ortadan kaldırarak, pahalı donanımları ve / satın almak veya uzman transgen enjeksiyon protokolleri yeterlilik, phiC31 tabanlı entegrasyon dahil, dış kaynaklı olabilir.
Burada, genel bir protokol kantitatif bir CRE faaliyet değerlendirmek ve bu yaklaşım, bir CRE faaliyet tanıtıldı mutasyon etkilerini ölçmek ve orthologous Cres faaliyetlerini karşılaştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermek için sunuyoruz. CRE aktif meyve sineği metamorfoz sırasında verilen örnekler olmasına rağmen, bu yaklaşım diğer gelişim evreleri, meyve sineği türleri, ya da model organizmalar uygulanabilir. Sonuçta, çalışma Cres bu yaklaşımı daha yaygın kullanımı, düzenleyici mantık bir anlayış geliştirmek ve nasıl mantık değişebilir ve gelişebilir.
Protocol
Bakış:
Bu video Drosophila (D.) melanogaster cis-düzenleyici element (CRE) dizileri için gen düzenleyici faaliyetlerin nicel ölçme yeteneğine sahip bir protokol göstermektedir. Bu protokol, sahip olduğu düzenleyici faaliyetlerini karşılaştırmak için kullanılabilir: yabani tip ve mutant CRE formları, doğal olarak meydana gelen türler arasında uzaklaştığı bir tür, ya da orthologous Cres içinde bulunan CRE allel.
1. Drosophila melanogaster genom içine muhabiri transgenlerin Site özel entegrasyon
A. Reporter transgen inşaat
- İlk adım olarak, herhangi bir CRE ayrı site özel transgen entegrasyon 8-11 için kullanılan bir (1) attB bakteriyel eklenti sitesi dizisi, yukarı (3) (2) çoklu klonlama yeri içeren bir muhabir vektör klonlanmış olmalıdır değerlendirilir bir floresan için kodlama (4) sırasını takip heterolog promotörprotein (gibi EGFP veya DsRed).
- Herhangi bir vektör vektör pS3aG12-14 addgene plazmid deposundan elde edilebilir vektör omurga içine attB dizisi tanıtan phiC31 aracılı siteye özgü entegrasyon için uyumlu hale olabilir iken (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG iki çingene izolatörler biri bir SfIb yalıtkan yerine edildiği P-temelli bir dönüşüm vector15 özelleştirilmiş bir versiyonu, gelişmiş bir çoklu klonlama sitesini içerir ve bir attB eklenti sitesi içeren 250 baz çifti dizisi sahip . Ilgi Cres hsp70 az organizatörü ve geliştirilmiş bir versiyonu çekirdeğe lokalize Yeşil Floresan protein kodlayan EGFP gen upstream çoklu klonlama siteye eklenir.
B. muhabiri transgenlerin Sitesi özel entegrasyon
- Karşılaştırmak olmak Cres bir dizi içind muhabiri transgen vektörlerin bir parçası olarak, oluşturulan vektörler ayrı ayrı aynı genomik iniş siteye entegre edilmiştir. Burada phiC31 faj integraz protein transgen vektör bakteri (attB) eklenti sitesi ve genomik bulunan faj (attP) eki sitesi 9 arasındaki tek yönlü rekombinasyon katalize eder. AttP sitesi (sözde açılış siteleri) ve germ hücreleri bu proteinin ifade phiC31 8 genomik kaynak içeren transgenik hatlarının 8-11 Çeşitli gruplar çeşitli yaptık. Bu sinek stokları Bloomington Drosophila stok merkezine kolayca elde edilebilir (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
- Yayınlanmış protokol transgenik Drosophila özellikle phiC31 integraz 16 site kullanarak nasıl oluşturulacağı ayrıntılarıyla mevcuttur. Transgenik Drosophila li yapmak için ekipman ve teknik uzmanlıkbazı satıcıları (Tablo 1) kime bu hizmeti dışarıdan olabilir mevcut eşya artık gerekli değildir.
- Transgen davranış bir doku sonraki 11 büyük ölçüde değişebilir. Böylece tek bir attP iniş sitenin tüm Cres, gelişim evreleri ve / veya çalışma dokuların analizi için en uygun değildir. CRE faaliyet endojen hedef gen (ler) ifade deseninin temsilcisi olan bir site bulmak için birkaç farklı açılış sitelerinde bir ilgi CRE aktivitesini değerlendirmek için tavsiye edilir.
- Elde edilen transgenik hatları için transgen için homozigot yapmak tavsiye edilir. CRE etkinliği genellikle iki transgen kopyalar ve kantitatif ölçümler için transgen kopya aynı numara ile bireyler arasında karşılaştırmalar yapılır zorunludur olan bireyler daha sağlamdır. Homozigot bireyler dengeleyici kromozom kullanımı yoluyla elde edilebilir. Olsa iyi karakterize iniş siteleri için, genellikle simpler bakir erkek ve kadın toplamak ve bu iki vektör ile entegre transgen vektör tarafından sağlanan beyaz mutant kurtarma kişilerde daha dramatik olduğu gibi mini-beyaz geni (Şekil 1), daha yoğun göz rengi fenotipi ile çapraz kopyalar.
2. Uygun gelişim aşamasında örnekleri veya dokuların alınması
Soruşturma altında CRE muhabiri gen ekspresyonu (ler) aktif hale getirmelisiniz endojen, dolayısıyla zaman ilgi gen ekspresyonu model (ler) ortaya çıktığında geliştirme anda analiz için numune alın. Drosophila için, bu ya embriyonik, larva, pupa veya yetişkin aşamaları olabilir. Aşağıda yetişkin ve metamorfik sinekler sahne için bir yöntem tarif; puparium, bir yetişkin olarak ecloses kadar hareketsiz bir örnek içeren bir sabit larva cilt içinde yer alır ikincisi.
- Specim sağlamak için transgenik hatları genişletinkonfokal mikroskobi muhabiri gen ekspresyonu analiz etmek için hazır ens uygun aşamada kullanılabilir. Dişi ve erkek sineklerin - birden fazla (10 ~ 5) ile her iki şişeleri ayarlayın. Alternatif günlerde, kullanılmayan bir flakon şişeleri sinekler tutabilirim. Bir hafta boyunca bunu tekrarlayın. Larva, yetişkin gelişim evreleri aralığı iki hafta sonunda, transgenik meyve sinekleri sunulacak.
- Sahneleme yetişkin sinekler: 25 yetiştirilen puparium içinde harcanan zaman süresi kadınlar için 98 saat ve erkekler için 102 saat ° C Puparium (eclosion denir) ortaya Yetişkin sineklerin kolayca toplanabilir. Bu timepoint 0 saat eclosion kabul edilebilir. Yetişkin sinekler, analiz için gerekli timepoint kadar yetiştirilen olabilir. Örneğin, CRE D. yetişkin oenocytes desatF gen ifadesini kontrol eden mel-OE1 denilen melanogaster kadın hemen eclosion ama CRE aktivite Swi sonra aktif değilbir gün 14 sonra tches. Doğru aşamada elde edildiğinde, sinekler uyutmak ve konumlandıran bir slayt Halokarbon petrol bir damla ve konfokal değerlendirilmesine devam.
- Başkalaşım sırasında örneklerin Evreleme: puparium oluşan üçüncü instar larva dönemi sonunda. Bu aşamada hayvan teknik olarak hala bir üçüncü instar larva olmasına rağmen örnek olarak mobil olmayan, bu gelişim aşamasında kolayca tanımlanabilen puparium, yumuşak ve beyaz, ve spiracles dışa dönük (Şekil 2A). Bu timepoint Puparium Oluşumu (hAPF) 0 saat sonra kabul edilebilir. Bu aşamada, erkekler (2A Şekil kutulu ve "2A siyah ok ile gösterilen) bilateral saydam daireler olarak görünen vücut orta noktası yakınında yer gonadlar varlığı kadın ayırt edilebilir.
1. Metamorfoz uzunluğu dayalı Evreleme:
0 hAPF, örnekler, yeni bir flakon transfer edilebilirPetri bir çanak boya fırçası nemlendirilmiş. Örneklerin kuruma tutmak için, bir parça Kimwipe ekleyin ve su ile nemlendirin. Istenilen hAPF kadar 25 ° C inkübatör Transfer flakon veya çanak.
2. Görünür morfolojik özellikleri ile Evreleme:
0 hAPF örneklerin toplanması, belirli bir timepoint CRE faaliyet için örnekleri analiz etmek için çoğu zaman zahmetli bir iştir. Alternatif olarak, bir doğru puparium ya da puparium çıkarılması (Şekil 2) sonra görünür birkaç morfolojik belirteçleri (aşağıda ayrıntılı) varlığı ve konumu dayalı analiz için uygun bir zamanda sahnelenen örneklerinde tespit edebilirsiniz.
2a. Metamorfik sahne yaklaştırmak için Morfolojik kriterleri:
- 0 hAPF: Beyaz prepupa aşamada larva hareket durur; ön spiracles (Şekil 2A ok) dışa dönük; yanal trakea görünür; yumuşak beyaz puparium (Şekil 2A).
- ~~ 14 hAPF:Asit ve sertleşmiş Puparium; kafası kese dışa dönük, lateral trakea ve gonadlar daha az belirgin; bacaklarını ve kanatlarını tamamen karın boyunca genişletilmiş; Malpighian tübüller (Şekil kesik kutulu bölgenin 2B) henüz belirgin değil ve yeşil gözleri pigmentsiz (Şekil 2B) .
- ~ 25 hAPF: belirgin renk ve yeşil İki paralel Malpighian tübüller (Şekil 2C kutulu bölge kesik.)
- ~ 40 hAPF: Koyu yeşil, sarı vücut Malpighian tübüller (Şekil 2B kırmızı ok ucu) ön uçları arasında konumlandırılmış.
- ~ 50 hAPF: Malpighian tübüller (Şekil kutulu bölge 2E ve 2E''genişlemiş) ve gözlerin orta noktada konumlandırılmış Sarı gövde renkli sarı beyaz genin (kırmızı göz rengi için gerekli) için vahşi tip . Göz rengi beyaz mutant fenotip entegre muhabiri transgen vektörü (Şekil 2E) bir parçası olan beyaz mini-gen tarafından kurtarıldı bu aşamada yoktur.
- ~ 80 hAPF: gri kanat uçları, karın orta noktası (kutulu Şekil 2G 2G ve genişletilmiş bölge ") anterior arasında yer Malpighian tübüller, karın segmentleri ve karın tergites üzerinde kıllar arasında kıvrım görünür (Şekil 2G ve 2G "); kurtarıldı ve göz rengi, parlak kırmızı (Şekil 2G).
- ~ 90 hAPF: Wings siyah karartılmış; tergites bronzlaşma tarafından gizlenmiş Malpighian tübüller ve sarı renkli gövde, torasik (ok) ve karın (Şekil 2H) olgun ve karanlık olan kıllar ve karın dorsal arka ucu (yeşil mekonyum görünür Şekil 2H'').
Notlar:
- La azmetamorfoz te aşamalarında, numunelerin seks genital morfoloji (Şekil 2I ve 2J ok başları) ya da erkek bacaklar ilk seti karanlık seks tarak varlığı tespit edilebilir.
- Evreleme daha fazla hassasiyet, daha önce 17 açıklandığı gibi ek morfolojik belirteçleri göz önüne alınarak elde edilebilir.
D. puparium örnek kaldırmak için Adımlar:
- Yapışkan yüzey yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon kurulu bant ambalaj laboratuvar bant kullanımı bir parça yapışır.
- Islak bir boya fırçası ve pupariated örneklerinin nem uygulamak. Bir boya fırçası kullanarak, bir Kimwipe örneklerinin transferi.
- Forseps veya bir boya fırçası, transferi örneklerin ambalaj bandını kullanarak ve (puparium kavisli tarafı) yukarı bakacak şekilde dorsal yüzey ile yapışır.
- Örnekler ~ 15 dakika kurumasını bekleyin. Kuru puparium, nemli olanlar daha açmak için çok daha kolay. Bu noktada numuneler kaba morfolojik tarafından sahnelenen olabilirpuparium görünür belirteçleri.
- Forseps kullanarak, aşamalı ön operculum'un puparium başında açık ve arka sonuna doğru devam edin. Belirli bir doku izole etmek için daha ince ölçekli diseksiyonu gerekli ise bu PBS solüsyonu ile bir saat cam yapılabilir. Aksi takdirde, viskoz HC700 Halokarbon yağı (Sigma-Aldrich) bir mikroskop lamı üzerine bir damla pupa aktarın.
- Stereomikroskopta kullanarak, bir örnek sahne tespit edilebilir yukarıda açıklanan kriterleri (bölüm 2a) kullanarak, bir slayt örneklerin bulunurdu ..
3. Bütün bir montaj örneği muhabiri gen ekspresyonu Konfokal mikroskopik değerlendirme
- Bütün montaj örnekleri için, 10X 4X ya da hedefleri ya kullanın. Cıva lambası maruz tarafından uyarılan floresan kullanarak, ya da alternatif olarak parlak alanında görüntüleyerek, sonra odak noktası haline getirmek numune optik alanında pozisyon örnek mikroskop sahne ayarlayın.
- Konfokal microscope yazılım, EGFP dalgaboyu (ya da başka bir floresan proteini kullanarak uygun bir dalga boyu) ayarlayın.
- Bir örnek photobleaching önlemek için, bir lazer yoğunluğu% 5-10 ile başlar. Sinyal underwhelming gerektiği gibi, o zaman yoğunluğunu artırabilir.
- Konfokal görüntü sinyal gürültü oranını artırmak amacıyla, yazılım ayarlarını etkinleştirmek çoğaltmak taramaları ortalama piksel ölçümleri; Kalman ortalama ya da çizgi ve yığın ortalama olarak. Deneyimlerimiz Kalman ortalama üç taramalar için resim koleksiyonu için çok uzun zaman vermeden gürültü oranı sinyali iyileştirir.
- CRE aktivitesinin kantitatif karşılaştırmalar için bir örnek için floresan yoğunluğu çok piksel doymuş olmadığını esastır. Böylece birkaç piksel doymuş floresan en yoğun görünen bir z bölümü kullanarak, ayarları. Bu bir doygunluk uyarı arama tablosu anahtarlama ve kanal gerilim, kazanç ayarlama yapılır ve ofset olabilirbirkaç piksel doymuş ayarları. Son olarak, bir örnek yeterli sinyal toplamak için genellikle konfokal diyafram ayarlamak için gereklidir.
- Optimum ayarları belirlendikten sonra, z-tarama çalıştırın.
- Tarama tamamlandığında bir projeksiyon görüntü yığını haline dönüştürmek ve Tagged Image File Format veya "TIFF" Bu görüntüyü kaydetmek.
Not:
- CRE faaliyetlerin nicel bir karşılaştırma dahil olacak tüm çoğaltmak örnekleri ve muhabir transgen hatları için aynı konfokal ayarlarını kullanmak için esastır.
4. Cis-düzenleyici element aktiviteyi belirleme
Bazı konfokal kazanım yazılım projeksiyon görüntüleri işlenmesi için olanak sağlarken, biz konfokal görüntüleri değerlendirmek için 18 serbestçe kullanılabilir Görüntü J yazılım programı kullanmayı tercih. Görüntüsü J 18 kayıtlı GFP ekspresyonupiksel değeri istatistikleri gibi belirli bir alan içinde belirlenebilir. Görüntüleri gri skala olması gerekmese de, biz bunu yapmak için tercih ediyor.
- Resim J programı başladı, değerlendirilmek üzere TIFF görüntüyü açmak.
- Freehand seçim düğmesini tıklayın ve kantitatif istenen numune alan ana hatlarıyla; örnek Şekil 3'te kesik sarı sınırları içinde bölge. (Not ölçmek için bir alan seçimine ilişkin aşağıdaki bakın.)
- Bir piksel değeri istatistik elde etmek için, analiz sekmesini tıklatın ve sonra ölçü birimini seçin. Bir sonuçları kutusunda yerini gösteren görünür ve ortalama, minimum ve maksimum piksel değeri puanlarının. Kaydedin ve ortalama piksel değeri skoru (Not b çoğaltmak sayısıyla ilgili) çoğaltmak örnekler için piksel değeri istatistikleri üretmek için tekrarlayın.
- Örneğin Şekil 3'te kesik kırmızı sınırları içinde bölgede; CRE aktif değil bir kontrol bölgesi ikinci bir ortalama piksel değeri toplama öneririz. Bu ikinci value, düzeltilmiş ortalama piksel değeri elde etmek için ölçüm arka plan efektleri kaldırmak için eski değeri düşülür. Bizim tecrübelerimize göre bu daha da çoğaltmak örnekleri (Not kontrol bölge için boyutu seçimi ile ilgili bkz c) arasında farklılık azaltır.
- CRE ve ortalama standart hata için ortalama düzenleyici aktivite hesaplamak için düzeltilmiş ortalama piksel değerlerini çoğaltmak örneklerinden kullanın. Bu yasal faaliyet değeri ve ölçüm hata CRE sıra farklıdır diğer muhabiri transgenlerin (Örneğin Şekil 3) ile karşılaştırılabilir.
Notlar:
- Resim J ortalama piksel değeri puanı belirlenecek olan belirli bir şekil ve alan seçmesini sağlar. Ancak, numune boyutunun sık sık değişir, her bir örnek için değerlendirilmek üzere bölgeyi belirtmek için Freehand seçim aracı kullanmayı tercih.
- Daha iyi bir ortalama düzenli tahmininde çoğaltır, daha fazla sayıda (N) sonuçlarıbelirli bir CRE için HastalarÛn adrenaline aktivite. Biz 4 ve 8 arasında bir K genellikle yeterli olduğunu bulabilirsiniz.
- Bizim tecrübelerimize göre seçilen kontrol alanı boyutunu biraz kontrol bölge için ölçülen ortalama piksel değeri üzerinde bir etkisi yoktur. Genel olarak, ilgi alanındaki bir alan büyüklüğü orantılı seçin.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
D. vahşi tip sürümü melanogaster CRE, dimorfik Element 13 olarak adlandırılan, yüksek düzeyde bir erkek pupa (Şekil 3A) A6 karın segment EGFP muhabir ifade sürücüler. Bu eleman içinde 13 baz çifti dizisi DSX transkripsiyon faktörü bağlayıcı bir site olduğu tespit edildi ve bu sıra in vivo önemi bu bağlayıcı sitenin mutasyona uğramış bu CRE için düzenleyici faaliyet nicel tarafından ortaya konabilir. 100 vahşi tip dimorfik Eleman düzenleyici faaliyet ±% 5, göz önüne alındığında bu DSX sitenin mutasyon Tescil azalttı- 28 ulatory faaliyet ± 3%. Benzer karşılaştırmalar intraspecific CRE allelleri için ya da ayrı türler orthologous Cres arasında düzenleyici faaliyetler yapılabilir. Örneğin, D. tarafından yönlendirilen kadın segmentinde A6 EGFP düzeyleri dikkate alınarak 100 düzenleyici bir faaliyet olarak melanogaster Canton S suşu ±% 4, türler için orthologous Cres D. simulans ve D. willistoni sırasıyla 75 eşit düzenleyici faaliyetler ± 4 ve% 0 ±% 0 (Şekil 3B) sahip bulundu.
Şekil 1 transgenik hatları homozigot beyaz-kurtarma göz fenotipi yoğunluğu kullanma. Muhabir transgenlerin kantitatif olarak değerlendirmek için her numune aynı muhabir transgen genotipi sahip olması çok önemli. (A) bir attP iniş sırası ile beyaz bir genin mutant genetik arka plan, site için kullanılmaktadır pecific transgen entegrasyon. Transgenik bireylerin (B) hemizygous ve entegre vektör (C) homozigot genellikle entegre mini beyaz gen kopya sayısına göre kurtarıldı göz rengi fenotipi yoğunluğu ile ayırt edilebilir. Homozigot hatları karanlık göz rengi fenotipi ile geçiş (C) dişi ve erkek sineklerin tarafından kurulabilir.
Şekil 2 morfolojik belirteçler kullanarak Drosophila metamorfik evresini belirlemek için. Bir larva yetişkin bir meyve sineği metamorfoz sırasında, cinsiyet ve geliştirme aşamasında yaklaşık olarak belirlemek için kullanılabilir stereotipik morfolojileri bir dizi örnek geçişler. BH örneklerini kendi puparium çıkarıldı. Paneller, A, E, F, G ve H kutuları "bölgelerde yakınlaştırılmış panelleri için sırasıyla A, E, F, G, ve H göstermektedir.
"Şekil 3" src = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" />
Şekil 3. cis-düzenleyici element faaliyetlerinin nicel karşılaştırma. Tüm örnekler için belirli bir dimorfik Eleman aracılı EGFP muhabiri gen ekspresyonu 80 saat puparium oluşumundan sonra kadınlarda değerlendirildi. A6 karın segment için ortalama piksel değeri (kesik çizgili sarı sınırları içinde bölge olarak sol üst çoğu görüntü için belirtilen) eksi ortalama olarak hesaplanan örnek için her resmin üst kısmında EGFP-ekspresyon seviyesi A4 segment için piksel değeri (arka plan düzeltme; kesik kırmızı sınırları içinde bölge olarak sol üst çoğu görüntü için gösterilir). Her muhabirin transgen dört çoğaltır ortalama segmentinde A6 piksel değeri hesaplamak için değerlendirildi. Düzenleme aktivitesi (A) vahşi tip% veya (B) Canton S suşu kadın piksel değeri ortalama ± SEM olarak bildirilir. (A) vahşi bir tip allel sahip kadınlar için GFP ifadeDimorfik Element ve DSX transkripsiyon faktörü tek bir bağlanma yeri ablasyon bir mutant versiyonu. Bu mutant bağlayıcı site 28 dimorfik Element aktivitesi azalır ±% 3 vahşi tip dizisi. D. (B) orthologous dizileri için düzenleyici faaliyetlerin karşılaştırılması melanogaster (Canton S suşu) dimorfik Eleman. D. tarafından GFP ifade aracılı göz önüne alındığında % 100 olarak melanogaster dimorfik Eleman allel, ilgili türlerin orthologous dizileri D. simulans ve D. willistoni sırasıyla 75 aktivitelere sahip ±% 4 ve% 0 ± 0.
6. Malzemeler
| Malzeme Adı | Tip | Şirket | Katalog Numarası | Yorum |
| Site özel transgen entegrasyon | Hizmet | En iyi Gen | Plan H | Transformant hat alan bir iniş alanı seçin |
| Halokarbon Yağ | Reaktif | Sigma-Aldrich | H8898 | Konfokal görüntüleme için numuneler monte etmek için kullanılır. |
| Dumont # 5 Forseps | Araç | Güzel Bilim Araçları | 11252-40 | Sivri Güzel ve dayanıklı diseksiyonu |
| SZ61 zoom Stereo mikroskop | Araç | Olympus | Özelleştirilebilir | Mükemmel optik meyve ile çalışmak için uçar |
| FluoView Konfokal Mikroskop | Araç | Olympus | Özelleştirilebilir | Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler sağlar. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cis-düzenleyici unsurlar, gen ekspresyonu ve böylece 1 geliştirme süreci belirten genomik programı kodlamak ve morfolojik evrim 2-4 insan özellikleri için 5,6,19 ve fenotipik varyasyon altında yatan iki mutasyonlar için önde gelen yerlerdir. Bu önem rağmen, Cres için düzenleyici bir mantık yeterince anlaşılamamıştır. Bu anlayış açığının önde gelen nedeni, kantitatif Cres fonksiyonel dizileri karşılaştırmak için uygun yöntemler eksikliği olmuştur. Burada D. melanogaster Cres çalışmada nicel bir boyut eklemek için geliştirilmiş transgenesis yöntemleri hakkında yararlanan bir protokol mevcut.
Çoğaltır (1) ve (2) aynı gelişimsel aşamada muhabiri transgen deneyimlerimizi bir CRE düzenleyici faaliyet nicel, çoğaltmak örnekleri arasında varyasyon düzeltilmiş ortalama piksel değeri% 10 veya daha azAynı genomik iniş sitede. Bu miktar varyasyon Şekil 3'te sunulan Cres için belirlenen tutarlı ve kantitatif genetik olarak farklı bir CRE sürümleri% 10 daha büyük bir değer düzenleyici aktivite farklı durumlar için bu yöntemi kullanımı konusunda bir sınırlama yerleştirir. Da önemlisi, bu sınırlama bu eğitim Cres daha önce değişik aktivite açıklayan kullanmak zorunda olduğu "azaltılmış" veya "artan" kalitatif tanımları üzerinde önemli bir gelişmedir.
Bir CRE sürümleri bilinen ya da kantitatif düzenleyici faaliyetlerde farklılık tespit edildiğinde, bu protokolü sorumlu olan veya faaliyet fark 12,13 katkıda mutasyon farklılıkları belirleyen olanaklı kılıyor. Bu işlevsel ilgili mutasyonları tespit etmek yeteneği transcri kazanç veya kaybı olarak moleküler mekanizmaları belirlemek için gerekli bir ilk adımCRE faaliyetleri farklı olmasına neden ption faktörü bağlayıcı siteleri,. İleriye yönelik olarak ortaya çıkmaya CRE mantığını daha iyi anlaşılması için, bu protokolün diğer Drosophila Cres ve protokoller diğer model organizmalar için benzer yöntemler uygulanması için izin vermelidir. Bu işlevsel ilgili CRE mutasyonlar işlevsel nötr mutasyonlar bataklık ayrımcılık bir yeteneğini de içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Biz teşekkür ederiz: Nicolas Gompel ve bu protokolün gelişmesine katkılarından dolayı Benjamin Prud'homme; Melissa Williams ve el yazması üzerinde yorum yapmak için dört anonim değerlendirenler; SAVAŞ için araştırma bursları için Dayton Enstitüsü Üniversitesi ve Dayton Üniversitesi Biyoloji Bölümü ve Araştırma Enstitüsü (UDRI) TMW için araştırma desteği. Bu çalışma TMW, Amerikan Kalp Birliği Hibe 11BGIA7280000 tarafından desteklenmiştir.
References
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , Academic Press. (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , England. (2007).
- Drosophila: A laboratory handbook. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
