Summary
Uma descrição da indução cirúrgica de endometriose em camundongos e ratos por auto-transplante de tecido do útero para a cascata arterial do mesentério intestinal.
Abstract
A endometriose é uma doença crônica e dolorosa cuja etiologia permanece desconhecida. Além disso, o tratamento da endometriose pode exigir a remoção laparoscópica de lesões e / ou gestão farmacêutica crônico de dor e os sintomas de infertilidade. O custo associado com endometriose tem sido estimado em 22 bilhões de dólares por ano nos Estados Unidos 1. Para continuar a nossa compreensão dos mecanismos subjacentes a esta doença enigmática, modelos animais têm sido empregados. Primatas espontaneamente desenvolver endometriose e, portanto, modelos de primatas mais semelhantes ao da doença em mulheres. Modelos de roedores, no entanto, são mais rentáveis e prontamente disponíveis 2. O modelo que descrevemos aqui envolve uma transferência autólogo de tecido uterino ao mesentério intestinal (Figura 1) e foi desenvolvido pela primeira vez no rato 3 e mais tarde transferido para o mouse 4. O objetivo do modelo de roedor autólogo de endometriose cirurgicamente induzida é imitarda doença em mulheres. Nós e os outros já haviam demonstrado que o padrão de expressão alterada do gene observada em lesões de endometriose de camundongos ou ratos espelhos que a observada em mulheres com a doença 5,6. Uma vantagem de realizar a cirurgia em ratos é que a abundância de linhagens de camundongos transgênicos disponíveis podem ajudar os pesquisadores a determinar o papel de componentes específicos importantes no estabelecimento e crescimento da endometriose. Um modelo alternativo no qual excisadas humana fragmentos do endométrio são introduzidos no peritônio de ratos imunocomprometidos também é amplamente utilizada, mas é limitado pela falta de um sistema imunológico normal que é pensado para ser importante na endometriose 2,7. Importante, o modelo do rato da endometriose induzida cirurgicamente é um modelo versátil, que tem sido usado para estudar como o sistema imunológico 8, 9,10 hormônios e fatores ambientais afetam 11,12 endometriose, bem como os efeitos da endometriose sobre fertility 13 e 14 a dor.
Protocol
1. Planejamento para a cirurgia de animais vivos
- Certifique-se que a aprovação apropriada foi recebido para trabalhar com animais de laboratório.
- Camundongos ordem e permitir que pelo menos uma semana de aclimatação ao novo ambiente.
- Camundongos fêmeas alojadas na ausência de exposição a feromônios do sexo masculino pode parar de pedalar, um fenômeno conhecido como o efeito Whitten 15,16. Para manter os ratos ciclismo transferência da cama encharcada de urina masculino para o feminino gaiola a cada cinco dias. Alternativamente, se o open-top gaiolas são usadas, coloque a gaiola do sexo feminino entre duas gaiolas dos machos para manter as fêmeas de bicicleta regularmente.
- Assegurar que os ratos são ciclismo por meio da análise de citologia vaginal diária por pelo menos uma semana antes da cirurgia (Tabela 1) 17.
- Use um lápis de cera para criar oito partições numa lâmina de vidro para que esfregaços vaginais de vários mouses podem ser coletados.
- Lave a vagina com 0,2-0,25 salina normal ou mL de água destilada através de um conta-gotas. Seja sure para colocar o conta-gotas apenas no orifício vaginal, como a estimulação do colo do útero com o conta-gotas pode causar pseudociese. Coloque a lavagem vaginal na lâmina de vidro para análise de tipos de células. Slides podem ser lidos fresco (úmido) ou, alternativamente, fixado por uma série de métodos e examinadas com um microscópio de luz padrão 17.
- Recolher, limpar e esterilizar todos os equipamentos necessários cirúrgico para uma bem sucedida cirurgia asséptica (ver secção Material) 18.
- Prepare a solução de buprenorfina para analgesia em PBS usando técnica estéril para entregar 0,2 mg / kg final. A concentração da solução de buprenorfina deve ser 0,0333 mg / ml assumindo que o adulto médio C57BL / 6 do rato pesa aproximadamente 0,025 kg e um volume de injeção subcutânea de 0,15 ml por mouse. Buprenorfina pode ser preparado com antecedência e armazenado como alíquotas. Note-se que a buprenorfina é uma substância controlada III exigindo uma licença DEA e log inventário detalhado.
- Prepare PBS estéril com penicilina (100 U / ml) e estreptomicina (100 mg / ml).
- Sincronizar os ciclos de cio através da transferência de urina embebida cama do sexo masculino para o feminino gaiolas 72 horas antes da indução 15.
2. Prepare a área cirúrgica para a cirurgia de animais vivos
- Prepare a área cirúrgica, como descrito anteriormente 18.
- Prepare a área de preparação através da definição de tosquiadeiras elétricas, pomada oftálmica, e esfrega cirúrgico.
- Prepare a área cirúrgica, colocando uma almofada de aquecimento de recirculação de água quente na área cirúrgica para manter a temperatura corporal durante toda a cirurgia. Coloque uma almofada impermeável estéril sobre a almofada de aquecimento de recirculação de água quente. Organizar instrumentos cirúrgicos, suturas, estéreis de vidro Placa de Petri, biópsia com punch, gaze esterilizada, clips ferida e ferida aplicador de clipe sobre o campo estéril cirúrgico.
- Prepare área de recuperação, colocando almofadas de recirculação de água quente de aquecimento metade under uma gaiola vazia para permitir ratos para afastar-se do calor, se assim o desejar.
3. Anestesiar e preparar o mouse para a cirurgia
- Registre o peso do mouse e determinar o estágio do cio através da avaliação da citologia vaginal.
- Para indução da anestesia, coloque o mouse em uma câmara de anestesia vazia (gaiola vazia com tampa sólida contendo portal de isoflurano). Ligue isoflurano sistema anestésico não-reinalação e definir o vaporizador para 4% isoflurano (com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,5 a 1 L / min).
- Quando o mouse está sob anestesia mudar o fluxo de isoflurano a um cone (30-60 bainha seringa ml) e do nariz do mouse lugar ea boca no cone na tabela de preparação. Adequada anestesia pode ser mantida com uma menor concentração de isoflurano durante todo o restante da cirurgia (~ 2,5-3,5% de isoflurano). Profundidade adequada de anestesia deve ser determinada por uma resposta negativa ao estímulo pitada dedo do pé.
- Aplicar t pomada oftálmicao evitar o ressecamento dos olhos durante a cirurgia.
- Usando pequenos cortadores elétricos, raspar o local da cirurgia.
- Desinfectar e preparar o local da cirurgia com três golpes alternados de mato clorexidina e álcool 70%.
- Drape animal com um campo estéril.
4. Ligadura uterina
- Faça uma incisão (~ 1 cm) pequena midline usando uma tesoura pequena ou uma lâmina de bisturi terminando 0,5-1,0 cm rostral à abertura vaginal.
- Inserir uma tesoura fechada para a abertura de tal forma que as lâminas são entre a parede do corpo e da parede abdominal. Suavemente blunt dissecar a área ao redor da incisão por lentamente abrindo e fechando a tesoura de tal forma que a parede abdominal é suficientemente destacada da pele. Restantes aderências visível entre a parede abdominal e pele ao redor do local da incisão pode ser cuidadosamente cortada. Falha em adequadamente blunt dissecar o local da incisão fará fechamento da parede abdominal mais difícil.
- F usando pequenosorceps, gentilmente localizar o corno uterino. O útero é dorsal ao intestino, que é o que você verá ao primeiro entrar no local da incisão. Em alguns casos é mais fácil localizar primeiro o ovário ea almofada de gordura associado ovário. Gentilmente puxe o corno uterino e deslize uma pinça aberta debaixo dela, para servir como uma válvula. Se desejar, nota a aparência dos ovários e do útero neste momento para obter informações adicionais sobre o estágio na indução do estro (Tabela 1).
- Deslize suavemente duas peças 6-8 5-0 cm de sutura de seda preto trançado (sem agulha) debaixo do chifre esticada uterina.
- Ligadura segura o chifre na junção útero-tubual (apenas caudal nas trompas de falópio) e na junção útero-cervical (apenas rostral para o colo do útero), usando um nó quadrado em cada localidade. Deixe as pontas da sutura para o momento.
- Cortar a secção do corno uterino entre as duas ligaduras e colocar o tecido em um vidro esterilizado Petri prato ContaIning ~ 100 mL de PBS contendo penicilina (100 U / ml) e estreptomicina (100 mg / ml). Corte as pontas do fio de seda passado. Se a sutura se soltar ou houver sangramento, procure o coto e gravata outro nó.
5. Prepare implantes de endometriose do útero extirpado
- Enquanto o útero extirpado está sendo manipulado, cobrir o abdome com gaze estéril e manter a hidratação com PBS estéril contendo penicilina e estreptomicina, conforme necessário.
- Tira o chifre retirado do útero de gordura.
- Se desejar, pesar o chifre retirado do útero.
- Abra o corno uterino através da inserção de uma lâmina de tesoura pequena (14 comprimento da lâmina mm) para a luz e deslizando a tesoura para baixo o corno uterino, mantendo o chifre com uma pinça.
- Na placa de Petri de vidro, use de 2 mm biópsia com punch para cortar três implantes igual porte.
6. Sutura implantes de endometriose na cavidade peritoneal
- Steril lugargaze e imediatamente acima do local da incisão e completamente molhado com PBS estéril contendo penicilina e estreptomicina.
- Com pequenas, pinça alisa suavemente encontrar o ceco e mover rostralmente ao longo do intestino delgado. Puxe uma seção (4-5 cm) do intestino pequeno que é pelo menos duas artérias longe do ceco e organizá-lo como um fã sobre o pré-gaze molhada para que a cascata arterial do mesentério intestinal é claramente visível. Certifique-se de manter a umidade do intestino em todas as vezes com solução salina estéril. Nota: não use uma pinça de dentes de rato durante o manuseio do intestino.
- Use 6-0 ethilon preto com um P-1, 11 mm, 3 / 8 círculo, inverta agulha cortante para sutura gentilmente um implante para uma artéria de aproximadamente 0,5 cm do intestino.
- Nota: O mesentério intestinal é coberta por uma fina camada de peritônio. Tenha o cuidado de fazer um passe limpo por esta camada, enquanto sutura ao redor da artéria. Puxe sutura através devagar e com cuidado, para não rasgar o peritônio ou rupturaa artéria.
- Completa dois nós de um lance cada um, tomando cuidado para não apertar a sutura muito difícil, pois isso pode resultar em perda de fluxo sanguíneo e subsequente necrose do intestino e morte. Guarnição da sutura dentro de 2 mm do implante. Intestinal molhado novamente para continuar a manter a hidratação antes de passar para implante seguinte.
- Movendo em uma direção rostral, puxe a centímetros do intestino próximos 3-4 e gentilmente substituir a parte que já contém um implante. Ignorar uma ou duas artérias do local do implante anterior e sutura do implante seguinte. Repita o procedimento para o implante terceiros.
- Substituir todos os intestinal na cavidade abdominal.
7. Cirurgias Sham
- Sham cirurgias são realizadas usando os mesmos passos como as cirurgias endometriose, exceto que nenhum tecido é suturado ao mesentério intestinal.
- Chifre do consumo uterina esquerda como no passo 4.
- Os implantes de endometriose (passo 5) não estão preparados na cirurgia sham. Oexcisadas corno uterino podem ser descartados ou utilizados para outros fins, se desejado.
- Suturas, mas não tecidos, são colocados cerca de três artérias na cascata arterial do mesentério intestinal como no passo 6.
8. Fechamento da ferida cirúrgica
- Garantir que todos os órgãos são aproximadamente de volta à sua posição anatômica.
- Use 5-0 sutura vicryl revestido em um ponto não-interligadas contínua para fechar a parede abdominal.
- Use 9 clipes ferida milímetros para fechar a pele.
9. Recuperar animais
- Administrar 0,33 mg / ml buprenorfina em 0,15 g do mouse ml/25 via injeção subcutânea de uma dose de 0,2 mg / kg. A buprenorfina é administrada no pós-operatório para evitar uma maior depressão cardiovascular / respiratório que pode prolongar o processo de recuperação.
- Seque suavemente com o mouse kimwipes ou toalhas de papel, se ela ficou molhada durante a cirurgia.
- Coloque o lado ventral para baixo animais na gaiola partially em cima de uma almofada de recirculação de água aquecida até que o animal é recuperado e recuperou decúbito esternal (dentro de cinco minutos como o anestésico inalante rapidamente desaparece).
10. Cuidados pós-operatório
- Camundongos devem ser observados a cada 15 minutos até que eles são capazes de manter decúbito esternal, depois de hora em hora até que recupere o seu comportamento normal após a cirurgia.
- Camundongos normais deve aparecer dentro de 24 horas de cirurgia. Camundongos devem ser monitorados diariamente por sete a dez dias para sinais de recuperação e boa saúde.
- Indicações de que um animal é mal de saúde, dor, ou sofrimento incluem diminuição da actividade, auto-mutilação, a aparência ungroomed, ou postura arqueada.
- Se um animal não parece estar em boa saúde dentro de 24 horas de cirurgia, quer administrar a buprenorfina (0,2 mg / kg) ou eutanásia do animal. Se o animal não melhorar dentro de 8 horas de suplementar a administração da buprenorfina shoul animaisd ser sacrificado como necrose intestinal é provável.
- Remova os grampos ferida 7-10 dias pós-indução.
- Continuar a acompanhar a ciclicidade estral por exame de citologia vaginal para a duração do experimento. Sincronizar os ciclos de estro 72 horas antes da coleta de urina, transferindo-embebida da cama do sexo masculino para o feminino gaiolas como descrito no passo 1.3.
11. Necropsia e excisão de tecido
- O momento da necropsia é dependente da questão de investigação particular e é discutido nos resultados representativos e discussão.
- Euthanize o mouse por asfixia dióxido de carbono.
- Coleta de sangue por punção cardíaca, utilizando uma agulha de calibre 23 em uma seringa 1cc (se desejado).
- Coletar uma mancha da citologia vaginal, como descrito acima para determinar estágio estro no momento da coleta de 17.
- Corte restantes corno uterino no útero-tubária de junção e no colo do útero, remover gordura, peso, e processo comodesejado (ver 11,14 e 11,15).
- Localize as suturas preto ao redor das lesões de endometriose. Fotografia intacta lesões de endometriose, se desejar.
- Dissecar cuidadosamente as adesões em torno das lesões de endometriose com uma tesoura pequena e uma pinça, tomando cuidado para não lance as lesões. Trabalhar rapidamente e com cuidado para evitar a degradação do RNA.
- Medir e registrar o comprimento ea largura das lesões de endometriose com paquímetro.
- Extirpar as lesões de endometriose e coloque sobre uma toalha de papel umedecido com PBS. Remover qualquer tecido não-endometriotic das lesões. Um posto de vidro dissecando microscópio ou lupa pode ser utilizada para auxiliar na dissecção.
- Pesar os três fluidos cheia de lesões de endometriose antes de remover a sutura.
- Remova cuidadosamente a sutura das lesões de endometriose.
- Para histologia, corrigir formalina um fluido cheio lesão de endometriose por duas horas seguidas por três e meia lava minutos PBS e armazenamento final in etanol 70%. Desidratam e parafina embed.
- Lance duas das lesões de endometriose. Pesar estes novamente. Desde cíclica alterações hormonais podem alterar a quantidade de líquido do cisto, o que dá uma medida do peso úmido de tecido-, além do peso do cisto mais o fluido medido em 11,10.
- RNA para isolamento e estudos de expressão gênica, imediatamente homogeneizar uma das lesões de endometriose lanced (ou ~ 20 mg de tecido uterino) em solução de lise de ligação e armazenar a -80 ° C para o isolamento do RNA futuro com o kit RNAqueous (Ambion) ou outro método como desejado.
- Para o isolamento futuro da RNA, DNA ou proteína, imediatamente snap-congelar a lesão lanced segundo endometriotic (ou ~ 20 mg tecido uterino) em nitrogênio líquido e armazenamento a -80 ° C.
Resultados representante
Lesões de endometriose no modelo do rato da endometriose induzida cirurgicamente morfológica e histologicamente semelhantes aos observados emmulheres. Análise histológica da endometriose em mulheres e do modelo do mouse indica que as lesões de endometriose contêm glândulas endometriais e estroma (Figura 2A). Lesões de endometriose em ratos também contêm acúmulo de hemossiderina em macrófagos, que são uma característica comum de endometriose em mulheres (Figura 2B) 19.
Lesões de endometriose retirados de ratos três dias pós-indução parecem inflamadas e hemorrágico (Figura 3A). Após 2-4 semanas de lesões de endometriose crescimento no modelo do rato são: cisto-como fluido, repleto e rodeado por aderências peritoniais (Figuras 3B e 3C). Comparado com o peso na indução de lesão, o fluido lesões foram preenchidas 306% e 862% maiores em um e dois meses pós-indução e lesões lanced foram 51% e 172% maiores, respectivamente (Figuras 4A e 4B). Temos obtido de fluidos consistentes e cheias lanced pesos lesão de endometriose em um mês pós-indução ao longo de cinco diferentes experimentos (Figura 5). Menos um mês pós-inprodução cheia de fluido (7,44 ± 3,75 mg) e lanced (2,92 ± 1,23 mg), peso lesão de endometriose foram significativamente correlacionados (coeficiente de correlação de Pearson = 0,669, p <0,001).
Idade do mouse não afetou o tamanho da lesão de camundongos entre três e 10 meses de idade. Nem o cheio de líquido ou lanced peso lesão de endometriose em um mês pós-indução foi significativamente correlacionada com a idade do animal (r = -0,136, p = 0,380 e r = -0,063, p = 0,698, respectivamente).
O útero do mouse passa por mudanças em tamanho, retenção de líquidos, a proliferação celular e aparência devido à influência dos hormônios esteróides durante o ciclo estral. Nós comparamos o peso lesão de endometriose com o peso dos restantes chifre intacta uterina de animais em diferentes estágios de estro. Não encontramos uma correlação significativa entre o peso uterino e cheio de líquido ou lanced l endometrioticesion peso em um mês pós-indução (r = -0,046, p = 0,765 e r = 0,232, p = 0,155, respectivamente).
O padrão de expressão gênica observado nas lesões de endometriose de ratos perto espelhos que relatada em mulheres com a doença 5. Por três dias pós-indução genes que regulam a remodelação da matriz extracelular, adesão celular e angiogênese são altamente regulada e muitos desses genes permanecem upregulated através de um mês de crescimento.
Figuras e Tabelas
Figura 1. Indução cirúrgica de endometriose por transferência de tecido autólogo uterina no mouse. O corno uterino é ligada, excisadas, e aberto longitudinalmente para expor o endométrio. Três biópsias de 2 mm 2 são preparados e cada um é suturada a uma artéria na cascata arterial do mesente intestinalry. Por um mês pós-indução das lesões de endometriose são fluidos cheia e rodeada por aderências.
Figura 2 hematoxilina e eosina seção manchada de uma lesão endometrial a partir do modelo do rato de endometriose em um mês pós-indução demonstrando (A) a presença de glândulas endometriais e estroma;. Barra de escala = 50 mm e (B) acúmulo de hemossiderina em macrófagos, alguns dos quais são indicadas por setas; barra de escala = 20 mM.
Figura 3. Lesões de endometriose no modelo do rato após a eutanásia, ou três dias pós-indução (A) ou um mês pós-indução (B e C).
Figura 4. Lesões de endometriose de camundongos induzida cirurgicamente ter endometriosis foram excisadas e pesava menos um ou dois meses pós-indução. Os dados são média ± SEM. Os dados foram log transformados e letras diferentes indicam significância dentro de cada painel, one-way ANOVA seguido pelo menos um lado de Fisher Comparações Mulitple diferença significativa. (A) Cisto gosta, cheio de líquido lesões de endometriose (N = 10, 7 ou 5 para a indução, um mês ou dois meses pós-indução, respectivamente). (B) lanced lesões de endometriose (N = 10, 8 ou 7 para a indução, um mês ou dois meses pós-indução, respectivamente).
Figura 5. Lesão de endometriose peso molhado com o líquido e lanced menos um mês pós-indução a partir de cinco experimentos separados. Os dados são média ± SEM. Camundongos N = 10, 6, 8, 7 e 7 para fluido lesões preenchido e 0, 7, 10, 8, e 8 para lesões lanced no experimento 1, 2, 3, 4 e 5, respectivamente.
![Tabela 1]("files/ftp_upload/3396/3396table1.jpg)
Tabela 1. Observação de estro Stage por citologia vaginal e aparência visual de ovários e útero e de indução.
Aparecimento de ovário e útero será dependente do tempo. A seguir são baseadas no sacrifício de cerca de 8h00 da manhã de cada dia do ciclo. Além disso, as observações são subjetivos e comparando o ovário e cornos uterinos será uma melhor estimativa de cornos uterinos só. Estas observações são destinados a complementar as informações obtidas a partir de leituras diárias citologia vaginal.
Tabela 2. Comparação de cirurgia em ratos e ratinhos.
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Discussion
Existem vários parâmetros críticos que devem ser observadas durante a realização da indução cirúrgica de endometriose em camundongos. Primeiro, a endometriose é uma doença estrogênio dependente e, como tal, esta cirurgia deve ser realizada em animais intactos ou, alternativamente, em animais ovariectomizados suplementado com estrógenos 20. Segundo, suturar as biópsias endometriais para a cascata arterial deve ser realizada com extremo cuidado. Nós descobrimos que o uso de apenas dois nós relativamente flexível com um lançamento a cada mantém a biópsia no local, evitando a ligadura do suprimento de sangue para o intestino e necrose do tecido e posterior morte do animal. Recomendamos fortemente a prática de vários ratos antes da experiência real para garantir que as suturas são colocadas de forma segura o suficiente para que o tecido não está perdido, mas não muito apertado a ponto de causar necrose intestinal. Terceiro, é muito importante para manter o tecido do intestino hidratado com PBS estéril contendo penicilina e estreptomicina durante a surgery. Quarta, os esforços devem ser tomadas para garantir que o tamanho do implante de endometriose é consistente. Para este efeito usamos uma biópsia com punch de 2 mm para criar tamanho consistente implantes de endometriose da excisadas tecido uterino.
Existem várias modificações que podem ser feitas a este protocolo para atender às necessidades individuais e questões científicas do pesquisador. Um potencial pertence a modificação do perfil hormonal do animal. Sistema de gene e expressão da proteína nas lesões de endometriose, permanecendo intacta chifre uterina e imune pode ser diretamente influenciado pelo momento da coleta em relação ao estágio do ciclo estral. Existem várias abordagens para o controle para a fase estro no momento da coleta, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Por exemplo, intacta animais, andar de bicicleta podem ser sincronizados através da transferência de urina embebida cama macho fêmea na gaiola três dias antes da indução ou cobrança de tal forma que os animais são cirurgicamente induced e recolhidos durante a fase de estro mesmos 15. Se os animais são usados ciclismo intacta, ciclicidade estro deve ser monitorado diariamente pelo exame da citologia vaginal 17. Isto tem a vantagem de ser mais fisiologicamente relevantes, mas a sincronicidade do ciclo não é atingir 100% de sucesso. Alternativamente, animais intactos podem ser sincronizadas por gonadotrofinas exógenas administração 21,22. Enquanto um pouco mais preciso, esse método cria altos níveis de estrogênio do que o normal. Outra abordagem tem sido a ovariectomize animais e dar a volta um nível constante de hormônios exógenos, quer através de uma cápsula de silastic, mini-osmótica da bomba, ou injeções diárias de 4,8. Este método tem a vantagem de obter um perfil hormonal uniforme em muitos animais, mas é desvantajoso porque os animais não são ciclismo.
Sham cirurgias podem ser realizadas para avaliar quais os efeitos são o resultado de se submeter a cirurgia versus efeitos attributable à endometriose. Em cirurgias farsa do corno uterino é removida e suturas são colocadas em volta das artérias na cascata arterial do mesentério intestinal, mas não implantes de endometriose são suturadas 5,8,23. Alternativamente, a gordura removida do corno uterino extirpado pode ser suturado ao mesentério intestinal 3,14. Recentemente, informou que existem diferenças relativamente poucos na expressão gênica, medida pelo microarray de cDNA entre sham útero ea trompa uterina intactas de animais cirurgicamente induzido a ter endometriose 5. Além disso, usando quantitativa PCR em tempo real por sete genes relacionados com a endometriose, descobrimos que a expressão haptoglobina somente foi significativamente diferente nos úteros de ratos sham e endometriose. Lee et al. entretanto, relataram a expressão diferencial de cinco genes no útero de ratos induzidos a ter endometriose comparados aos controles sham 23. Isto sugere que a presença do lesio endometrioticns pode causar a expressão do gene alterado no útero eutopic.
O período de recolha de camundongos induzida cirurgicamente ter endometriose deve ser determinada pela pergunta da pesquisa particular. Coleção de camundongos três dias pós-indução permite avaliar a crítica, os primeiros eventos no estabelecimento da endometriose, incluindo os neutrófilos inicial e infiltração machrophage e produção de citocinas como tem sido relatado previamente 8. Temos mostrado que as lesões de endometriose coletadas três dias pós-indução são pequenos, hemorraghic, e alteraram significativamente a expressão do gene em relação ao corno restante 4. Por duas semanas pós-indução de lesões de endometriose estão bem estabelecidos e muitas vezes formado cisto estruturas semelhantes. No mouse, lesões de endometriose continuam a aumentar de tamanho, conforme avaliado pelo peso do fluido e cheio lanced lesões (figura 4), bem como pelo volume da lesão determinada pelo comprimento, largura e height medições através de dois meses pós-indução 9.
Como mencionado acima, o modelo cirúrgico da endometriose foi desenvolvido pela primeira vez no rato e ainda é amplamente utilizado 3. Ao realizar esta cirurgia em ratos que fazer as seguintes modificações ao protocolo, conforme resumido na Tabela 2. No rato, todas as suturas utilizadas são de tamanho 4-0 e pode e deve ser amarrado com mais força. Além disso, seis de sutura 5 mm 2 implantes de endometriose no mesentério intestinal da cavidade peritoneal.
Neste protocolo descrevemos a utilização de um anestésico inalatório, o isoflurano. Alternativamente, combinado anestésico injetável composto de cetamina e Domitor (cloridrato de medetomidina) ou de outra alfa-2 agonista pode ser usado, embora o tempo de recuperação é um pouco mais longo. Cetamina, administrada a 75 mg / kg por injecção intraperiotneal, é um agente anestésico dissociativo com dor aguda mínima aliviar as propriedades de umnd é uma droga da programação III exigindo uma licença DEA e estoque de drogas detalhadas. Domitor, administrado em 1 mg / kg, é um agonista alfa-2 adrenérgicos e é facilmente revertida com Antisedan administração (cloridrato de atipamezol). Domitor é um sedativo que proporciona relaxamento muscular e alívio da dor. Domitor e ketamina pode ser preparado com antecedência em combinação com PBS usando técnica estéril. Antisedan, o agente de marcha atrás dos Domitor, podem ser preparados em PBS, em combinação com buprenorfina e deve ser administrado a 1 mg / kg no pós-operatório. A buprenorfina é também um Schedule III drogas e alternativas estão a não-esteróides anti-inflamatórios Banamine (flunixin meglumine) e cetoprofeno.
Tal como acontece com todos os modelos existem algumas limitações associadas com a indução cirúrgica de endometriose em roedores. Mais importante é que os roedores não têm um ciclo menstrual e, portanto, não espontaneamente desenvolver endometriose. Em um esforço para fazer o mod de roedoresel mais fisiologicamente similar à condição de seres humanos em alguns pesquisadores optaram por injetar autólogo ou homólogo fragmentos de tecido do útero de animais singênicos na cavidade peritoneal diretamente sem sutura 24,25. Em camundongos, o tecido injetado formas quisto-como lesões de endometriose, no entanto, o método de injeção de indução não parecem funcionar em ratos que o tecido não consegue conectar e invadir na cavidade peritoneal 3.
O modelo de roedores tem sido amplamente utilizada para estudar a etiologia, patologia e os fatores de risco de endometriose 2,8,26-29, bem como para explorar novas terapêuticas 14,30-34. O modelo de roedor da endometriose induzida cirurgicamente demonstra muitas semelhanças com a doença em humanos, incluindo a redução da fertilidade e fecundidade e gene alterado e expressão da proteína 5,6,35,36. Tomados em conjunto, com seus custos relativamente baixos e disponibilidade, o modelo de roedor cirurgicamente induendometriose ced é um excelente modelo para a endometriose nas mulheres.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecimentos especiais a Chris Bailey Kassotis e Audrey para a revisão crítica do manuscrito e ao Dr. Scott Korte, Beeman Joseph, Curfman Alison, Kimball Paulo, Neibreggue Bridget, Redel Jacob, Schroder Amy, Steinberg Maija e Winkeler Stacey, o auxílio na otimização deste modelo em nosso laboratório. O financiamento foi fornecido pela Clínica Biodetectives Training Grant (NIH T90) (KEP), University of Missouri Life Sciences Research Graduação Programa de Oportunidades, Pesquisa MU Conselho, Research Board MU subvenções e R21HD056441 NIH (SCN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax pencil | Fisher Scientific | NC9954135 | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-433 | |
| Eyedropper | Fisher Scientific | S79383 | |
| Standard light microscope for evaluating vaginal cytology smears | |||
| Buprenorphine HCL c3 (CARJET) 10X1ml | Butler Animal Health Supply | 022891 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14040-117 | |
| 10,000U/ml Penicillin, 10,000μg/ml Streptomycin in 0.85% NaCl | Hyclone | SV30010 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane non-rebreathing anesthetic system | |||
| Recirculating hot water heating pad | |||
| 30 ml syringe sheath | Fisher Scientific | 14-823-16G | |
| Powder free sterile gloves | Fisher Scientific | 19020558 | |
| Ophthalmic ointment | Major Pharmaceuticals | 10033691 | |
| Small electrical clippers | Wahl Clipper Corp. | 9861-600 | |
| Chlorhexidine scrub | Fisher Scientific | NC9863042 | |
| 70% Ethanol | |||
| Polylined sterile field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Size 3 scalpel | Fisher Scientific | 22-079-657 | |
| Number 10 scalpel blades | Fisher Scientific | 22-079-681 | |
| Small surgical scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5850 | |
| Small serrated semi-curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 5-0 black braided silk suture | Ethicon Inc. | K870H | |
| Sterilized pyrex glass Petri dishes | Corning | 70160-101 | |
| 2 mm biopsy punch | Miltex Inc. | 33-31 | |
| Sterile gauze | Kendall | 1806 | |
| 6-0 black monofilament ethilon nylon suture | Ethicon Inc. | 697G | |
| Needle drivers (optional) | World Precision Instruments, Inc. | 500023 | |
| 5-0 undyed braided coated vicryl suture | Ethicon Inc. | J490G | |
| 9mm Autoclip wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Autoclip applier & remover | BD Biosciences | 427630 | |
| 23G needle | BD Biosciences | 305193 | |
| 1cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 5X magnifying glass stand (optional) | Fisher Scientific | 14-648-23 | |
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Calipers | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6466 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 15-197-700A | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| RNAqueous RNA isolation kit | Ambion | AM1912 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Snap cap microcentrifuge flat top tube | Fisher Scientific | 02-681-240 | |
| Ketamine (optional) | Sigma-Aldrich | K4138 | |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) (optional) | Tocris Bioscience | 2023 | |
| Antisedan (atipamezole) (optional) | Sigma-Aldrich | A9611 |
References
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