Summary
Vi presenterer en protokoll for effektiv omprogrammering av humane somatiske celler inn i menneskeskapt påvirkning pluripotent stamceller (hiPSC) bruker retrovirale vektorer som koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) og identifisering av korrekt omprogrammeres hiPSC av levende farging med Tra- 1-81 antistoff.
Abstract
Heri vi presentere en protokoll for omprogrammering voksent menneske fibroblaster inn menneskeskapt påvirkning pluripotent stamceller (hiPSC) bruker retrovirale vektorer som koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) i nærvær av natrium butyrate 1-3. Vi brukte denne metoden for å omprogrammere sent passasje (> P10) voksent menneske fibroblaster derivert fra Friedreich er ataksi pasient (GM03665, Coriell Repository). Den omprogrammering tilnærming inkluderer svært effektiv transduksjon protokollen ved hjelp av repeterende sentrifugering av fibroblaster i nærvær av virus-holdige medier. De omprogrammeres hiPSC kolonier ble identifisert ved hjelp av levende farging for Tra-1-81, en overflate markør for pluripotent celler, atskilt fra ikke-omprogrammeres fibroblaster og manuelt passaged 4,5. Disse hiPSC ble deretter overført til Matrigel plater og vokst i mater-frie forhold, direkte fra omprogrammering plate. Fra den første gangen, hiPSC kolonier demonstrere karakteristiske HMS-lIke morfologi. Ved hjelp av denne protokollen mer enn 70% av utvalgte kolonier kan være vellykket utvidet og etablert i cellelinjer. De etablerte hiPSC linjene vises karakteristiske pluripotency markører inkludert overflatevann markører TRA-1-60 og SSEA-4, samt kjernefysiske markører Oct3 / 4, Sox2 og Nanog. Protokollen som presenteres her er etablert og testet med voksne fibroblaster hentet fra Friedreich sine ataksi pasienter og kontroll enkeltpersoner 6, menneskelige nyfødte fibroblaster, samt menneskelige keratinocytter.
Protocol
1. Virus produksjon og transduksjon
- Plate Phoenix Ampho cellene ved en tetthet på ~ 7-8x10 6 per 10 cm plate i 10 ml DMEM medium (DMEM høy glukose, 10% FBS varme inaktivert, 2 mm L-glutamin, ingen antibiotika). Plass i kuvøse og kultur over natten ved 37 ° C, 5% CO 2.
- De neste dag transfektere Phoenix celler ved hjelp av 12 mikrogram av en vektor koding enten Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc, eller GFP-genet (Addgene 17217 plasmider, 17218, 17219, 17220) og 35 mL Fugene 6. Forbered transfeksjon mix i 500 mL av DMEM medium (DMEM høy glukose, 2 mm L-glutamin, ingen FBS og antibiotika). Inkuber 20 min. Forsiktig Pipetter DNA komplekser i de 10 cm plater som inneholder 70-80% konfluent Phoenix celler.
- Bytt medier 6-8 timer etter transfeksjon med DMEM medium (DMEM høy glukose, 10% FBS varme inaktivert, 2 mm L-glutamin) inneholder penicillin og streptomycin.
- Deretter samler virus som inneholder media 4 ganger i 12 hintervaller, kombinere alle deler og filtrert ved hjelp av en 0,45 mikrometer filter for å fjerne frittliggende celler og rusk (media inneholder viruspartikler kan oppbevares i kjøleskap i 2 uker uten å miste smittsomme aktivitet, men frysing anbefales ikke).
- For retrovirale transduksjon, plate voksent menneske fibroblaster (passasje 10, Coriell Laboratories) fra en frossen lager 24 timer før den siste dagen i retrovirale mediesamling. Seed cellene på 6-brønnen gelatin omfattet plater på tettheten 1x10 5 celler per brønn i DMEM høy glukose, 10% FBS, 2 mm L-glutamin, penicillin, streptomycin og ikke-essensielle aminosyrer.
- Dagen erstatning DMEM medier med medier som inneholder viruspartikler hentet fra Phoenix celler. Legg viral media (1 ml av hver Oct4, Sox2, Klf4, og c-myc media, 4 ml totalt) supplert med 6 mikrogram / ml polybrene til hver brønn på seks-brønns plate av fibroblast kulturer og sentrifuger ved 1600g for 1t ved 20 ° C. Omtrent 12 h afTer det transduksjon, erstatte de virale mediene med fibroblast kultur medium. Utfør viral infeksjon og sentrifugering 3 ganger i 24 t intervaller.
- Kultur fibroblaster i DMEM media for 48 timer etter siste infeksjon. Sjekk effektiviteten av smitte med parallelle transductions med retrovirale media uttrykker GFP. Figur 1 illustrerer effektiviteten i sentrifugering-rette retrovirale infeksjon av humant fibroblast.
2. Omprogrammering
- Forbered 6 vel plater med γ-bestrålte MEF mater lag ved såing MEF celler ved en tetthet på ~ 2x10 5 celler per brønn av gelatin behandlet 6 bra plate i fibroblast vekst medium. Dagen etter splitte infisert menneske fibroblaster bruker 0,05% trypsin / EDTA og frø dem på tettheten av ~ 1.2x10 4 per brønn i fibroblaster vekst medium.
- Dagen erstatte medier med HMS media (DMEM/F12, 20% Knockout Serum Replacement, ikke-essensielle aminosyrer, penicillin / streptomycin, 2 mm L-glutamin, 0,1 mm β-mercaptoethanol, 20 ng / ml basal fibroblast vekstfaktor (bFGF), supplert med 0,5 mm natrium butyrate for de første 7 dagene av omprogrammering. Endre media daglig.
- Overvåk morfologiske endringer i transduced celler daglig. Kolonier av hoftene-lignende celler begynner å dukke opp ca 5 - 10 dager etter å ha overført transduced fibroblaster inn på mater celler. De hiPSC koloniene er klare til å bli isolert ca 14 - 28 dager etter plating dem på MEF mater cellene.
3. Isolering av hiPSC kolonier
- En dag før du plukker de hiPSC koloniene forberede 24-brønns plater med γ-bestrålte MEF mater celler (~~~HEAD=NNS 4x10 4 celler per brønn) i fibroblaster vekst medium. På dette stadiet hiPSC kolonier kan også overføres til mater fri kultur hjelp Matrigel og mTeSR1 medium.
- Før isolering av hiPSC kolonier forberede MEF platene ved å fjerne fibroblaster vekst medium og skylling MEFs med PBS for å fjerne spor av FBS. Deretter tilsett 0,5 ml HMS medium (eller mTeSR1 medium i tilfelle av Matrigel belagt brønner) med 10 mm ROCK hemmer Y27632 til hver brønn 7,8.
- Om nødvendig, fjern fibroblaster omgir hiPSC kolonier med en 21 gauge nål under et mikroskop montert i en laminær hette (Figur 2A - C). Skyll platene med PBS og legge ferske HMS medier som inneholder Tra-1-81 StainAlive spesifikt antistoff (1:200, Stemgent). Etter 30 min., Erstatte media som inneholder antistoff med ferske HMS media supplert med 10 mM ROCK hemmer. Undersøk platene under fluorescerende mikroskop og mark Tra-1-81 positive kolonier bruker en objektiv markør (figur 2D).
- Skjær Tra-1-81 positive hiPSC kolonier under et mikroskop i en laminær hette, i flere små biter med en 21 gauge nål som vist i Figur 2E og F.
- Bruke en automatisk pipette (P200) overføre fragmenter av hiPSC kolonier i individual brønner på 24-brønnen plate med MEFs eller Matrigel. Unngå å overføre ikke-hofter celler. Plasser platene i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator og la hiPSC koloniene å feste for 24-36 timer.
- Endre HMS eller mTeSR1 (for kolonier dyrket på Matrigel) media daglig. De hiPSC kolonier med riktig HMS-lignende morfologi vil være synlig 48 timer etter den første overføringen på en 24-brønns plate.
- Manuelt passasje hiPSC kolonier hver 6 - 8 dager inn på en 12-brønnen og deretter på en seks-brønns plate.
- Etter klonal ekspansjon og etablere hiPSC linjene, analysere uttrykk av pluripotency markører TRA-1-60, SSEA-4, Oct3 / 4, Sox2 og Nanog bruker immunocytochemistry som vist i Figur 3. Vurdere genomisk integritet og differensiering potensialet de innhentede linjer ved hjelp karyotype og teratom dannelse analyser 6,9.
4. Representative Resultater
Effektiv transduksjon med retrovirus som inneholder media is kritisk for vellykket omprogrammering. Det anbefales å gjennomføre hele transfeksjon / infeksjon prosedyren med en GFP uttrykke virus hvert eneste omprogrammering eksperiment for å overvåke effektiviteten som vist i Figur 1. Den titer av GFP uttrykke viruset bestemmes, som beskrevet i 10, gjennom transduksjon av menneskelige fibroblaster med ikke-konsentrerte viral media var typisk i området 0,5 - 5 x 10 7 viruspartikler per ml (VP / ml).
Fibroblaster endre morfologi så tidlig som 2 dager etter siste infeksjonen. Trypsinized menneskelige fibroblaster bør nøye telles før såing dem på MEF mater cellene. Det anbefales å seed celler på 3 forskjellige tettheter (6x10 3, 1.2x10 4, 2.5x10 4 per enkelt brønn av en 6 brønn plate) siden hver celle linje demonstrerer forskjellig vekst karakteristisk og seeding tetthet er avgjørende for effektiviteten av omprogrammering. Sodium butyrate brukes tilførste 7 - 14 dager etter omprogrammering øker effektiviteten hiPSC formasjonen ca 5 ganger. Ofte, spesielt når infiserte fibroblaster ble sådd ved høyere tetthet, kan fibroblast-lignende celler overgrow en kultur tallerken og dekk hiPSC kolonier som vist i figur 2A. I dette tilfellet kan fibroblast laget nøye løftes og fjernes for å avdekke hiPSC kolonier (figur 2B). Deretter bør hiPSC kolonier skylles med HMS media og farget med Tra-1-81 antistoff. Avhengig av fibroblast celler, ca 20 - 40% av koloniene demonstrere med iPSC-aktig morfologi ikke flekker med Tra-1-81 antistoff. Identifiserte hiPSC kolonier kan overføres fra en plate i løpet av neste 12 - 24 timer. Langvarig inkubasjon vil resultere i rask differensiering av hiPSCs. Kolonier kan manuelt passaged på enten MEF mater celler eller Matrigel-belagte plater. Etter ekspansjon etablert hiPSC kloner bør testes ved hjelp immunocytochemistry (ICC) for uttrykket av pluripotency markører som demonstrert i figur 3. I tillegg bør en detaljert molekylær karakterisering av de genererte iPS cellelinjene er: analyser av pluripotency genekspresjon ved hjelp RT-PCR, demonstrasjon av DNA demetylering ved arrangører av pluripotency gener og analyser av transgener Silencing 9.
Figur 1. Effektiviteten av viral transduksjon bestemmes ved hjelp av GFP uttrykke retrovirus. (A, B) voksent menneske fibroblaster derivert fra Friedreich er ataksi pasient (GM03665, Coriell Repository) var visualisert etter to påfølgende infeksjoner med GFP retrovirale media. (C, D) Human fibroblaster ble smittet med den samme batch av GFP retrovirale media etterfulgt av sentrifugering av cellene direkte på de seks-brønns plater for 1t på 1600g. Bilder ble tatt til fange 48t etter smitte.
Figur 2. Identifisering og isolering av hiPSC kolonier. (A) fasekontrast bilde av en plate som inneholder hiPSCs omgitt av fibroblaster. Cellene ble dyrket i 21 dager på HMS medier. (B, C) Det samme hiPSC kolonien etter fjerning av omkringliggende fibroblast laget. (D) Korrekt omprogrammeres hiPSC kolonier er identifisert med levende farging med Tra-1-81 overflate markør antistoff, klippes ved hjelp av en steril nål (E, F) og overført til egne brønner på en 24-brønns plate.
Figur 3. Uttrykk for de pluripotency spesifikke markører Oct3 / 4, Nanog, Sox2, SSEA4 og Tra-1-60 i hiPSCs ble bestemt av immunocytochemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studerer menneskelige sykdommer, spesielt nevrologiske og nevrodegenerative, har vært spesielt utfordrende på grunn av utilgjengelighet av tilstrekkelige menneskelige mobilnettet modeller. Muligheten til å omprogrammere lett tilgjengelig somatiske celler til induserte pluripotent stamceller og potensialet for å skille dem i forskjellige celletyper åpnet en mulighet for å lage cellulære modeller av genetiske sykdommer. I tillegg iPSCs holder en meget lovende i fremtiden av regenerativ medisin. Derfor er det viktig å utvikle og optimalisere pålitelige, effektive og trygge metoder for omprogrammering somatiske celler til pluripotency.
Fra perspektivet til terapeutiske applikasjoner, er det avgjørende å utvikle sikre tilnærminger av iPSC generasjon mangler footprint mutasjoner i verten genomet. Metoder for somatisk celle omprogrammering uten å innføre permanente endringer i genomet av omprogrammeres celler som transfeksjon av episomal vektorer, bruk av excisable transposons og adenoviral infeksjon, og direkte levering av mRNA eller proteiner allerede er etablert 11-15. Så langt omprogrammering effektivitet ved hjelp av disse transgene-gratis metoder er lite og er avhengig av karakter, type og alder på omprogrammeres somatiske celler. Derfor er disse protokollene er ikke egnet for omprogrammering sent passasje, voksne somatiske celler ofte avsatt i celle repositories. I tillegg, for å muliggjøre detaljert karakterisering av flere iPSC linjer og å etablere nye modeller av menneskelige sykdommer og å utføre high-throughput narkotika-skjermer, omprogrammering av somatiske celler ved hjelp av viral levering av transkripsjonsfaktorer er en tilstrekkelig strategi. Til dags dato mer enn 20 studier rapporterte generasjon av pasient-spesifikke iPSCs å modellere menneskelige nevrologiske og nevromuskulære sykdommer. I alle men en tilfeller iPSCs ble generert ved hjelp lentiviral eller retrovirale transduksjon 16.
Våre data viser at en enkel protokoll basert på the retrovirale levering av OSKM transkripsjonsfaktorer kan brukes til å effektivt reprogrammere voksent menneske fibroblaster, selv om en høy passasje. Mengden av viruset hentet fra en enkelt transfeksjon av Phoenix celler på 10 cm plate er tilstrekkelig for mer enn 10 omprogrammering eksperimenter. Det er tre viktige skritt i vår omprogrammering protokoll av voksne fibroblaster: (i) svært effektiv viral transduksjon tilrettelagt av en ekstra sentrifugering trinnet under transduksjon som dramatisk øker effektiviteten av transduksjon, (ii) seeding tetthet av transduced fibroblast på MEFs og ( iii) bruk av levende farging med den Tra-1-81 markør antistoff for å forenkle valg av potensielt fullt omprogrammeres kolonier som kan bli direkte overført til mater-frie kulturer. Effektiviteten av omprogrammering er betydelig forbedret ved hjelp av natrium butyrate under andre uken av omprogrammering. Videre observerte vi at en større andel av de iPSC koloniene dyrket itilstedeværelse av stoffet kan utvides og etableres i fullt omprogrammeres iPSC linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Friedreich sin Ataksi Forskning Alliance og en pilot stipend fra Arnold Family Foundation og The Center for Stem Cells og utviklingsbiologi ved MD Anderson Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| KSR | Invitrogen | 10828 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| bFGF | Stemgent | 03-0002 | |
| Tra-1-81 antibody | Stemgent | 09-0069 | |
| Oct3/4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8628 | |
| Nanog antibody | Cell Signaling Technology | 4903S | |
| Tra-1-60 antibody | EMD Millipore | MAB4360 | |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579S | |
| SSEA4 | EMD Millipore | MAB4304 | |
| CF1 MEFs | Globalstem | GSC-6201G | |
| Objective marker | Nikon Instruments | MBW10010 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 05850 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Fugene 6 | Roche Group | 11814443001 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Object marker | Nikon Instruments | MBW10010 |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28, 713-720 (2011).
- Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines. Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).
- Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability. Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).
- Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O'Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).
- Yu, J., Thomson, J. A. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. Essentials of Stem Cell Biology. Lanza, R. , Elsevier Inc. 331-337 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron. 70, 626-644 (2011).
