Summary
Bu yazıda maya poliglutamin toksisite (polyQ)-genişletme proteinlerin değerlendirilmesi için üç tamamlayıcı protokoller açıklar
Abstract
Protein hatalı katlanması, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı 1 olduğu kadar çok insan hastalığı, nörodejeneratif hastalıkların, özellikle, ile ilişkilidir. Huntington hastalığı (HD) protein Huntinğtin içinde bir poliglutamin (polyQ) bölgenin anormal genişlemesi nedeniyle oluşur. PolyQ-genişletilmiş Huntinğtin proteini Aberan konformasyonu (yani misfolds) ulaşır ve hücresel toksisite 2 neden olur. En az sekiz daha nörodejeneratif hastalıklar Spinoserebellar ataksiler ve Kennedy hastalığı da dahil olmak üzere 3 polyQ-açılımları, kaynaklanır.
Model organizma maya polyQ-genişleme ifade polyQ-toksisite intra-ve inter-moleküler faktörlerin etkisi ve hücre bozulmaktadır hücresel yollarının belirlenmesi de dahil olmak üzere, polyQ-toksisite hücresel ve moleküler temeli içine önemli anlayışlar kolaylaştırdı proteinler 3-8. Önemlily, maya bulundu polyQ-toksisite birçok yönü dolayısıyla polyQ-toksisite yatan temel mekanizmaların keşfi için maya modelinin önemini gösteren diğer deney sistemleri ve HD hastalardan alınan örnekleri bir ölçüde yeniden üretildi.
Maya polyQ-toksisite belirlemek için doğrudan ve nispeten basit bir şekilde polyQ-genişleme proteinleri maya hücrelerinin büyüme kusurları ölçmektir. Bu yazının polyQ-genişleme proteinleri maya hücrelerinin büyümesini ölçerek maya polyQ-toksisite belirlemek için üç tamamlayıcı deneysel yaklaşımlar anlatılmaktadır. İlk iki deneysel yaklaşımlar plakalar üzerinde maya büyüme izlemek, üçüncü bir yaklaşım BioscreenC aracı kullanarak likit maya kültürlerinin büyümesi izler.
Ayrıca, bu yazının maya polyQ modelleri işlerken meydana gelebilir deneysel zorlukların açıklanır ve veya önlemek için yardımcı olacak stratejileri ana hatlarıylaBu zorlukların en aza indirmek. Burada anlatılan protokoller tespit etmek ve genetik yollar ve polyQ-toksisite modüle küçük moleküllerin karakterize etmek için kullanılabilir. Ayrıca, açıklanan deneyler maya modelleri diğer hastalığı ile ilişkili katlanan proteinleri neden olduğu toksisite doğru analizler için şablon olarak hizmet verebilir.
Protocol
1. Maya toksik PolyQ-genişleme Proteinlerin Anlatım
Sistematik analizi maya 7 toksisite üretmek için gerekli olan bir polyQ-genişletme proteinin amino asit sekansı hassas oluşturmuştur. Bu toksik polyQ-genişletme proteini Şekil, Huntinğtin protein, bir polyQ bölgeye ve bir karboksi-terminal füzyon orijinal bir flüoresan sekansı protein (GFP veya CFP ya ila 17 amino asit, ardından bir amino-terminal bayrak-etiketi içerir 1. a). Indüklenebilir ve nispi kuvvetli GAL1 promotör 7, 9 kontrolü altında eksprese olduğunda glutamines 46 ya da daha fazla polyQ açılımı olan proteinlerin ifade (72 ve 103 glutamines gibi) maya toksisite üretir.
Daha önce açıklandığı gibi, maya polyQ toksisitesi olan prion konformasyonundadır proteini Rnq1p taşıyan hücrelerin sadece açıktır, [RNQ +], örneğin, maya suşu W303 9. Toksik polyQ-genişleme protein rBöyle polyQ boyu bağımlı toksisite (aşağıya bakınız) ve kümeleme (Şekil 1 b) maya polyQ-biyoloji ecapitulates merkezi yönleri. Özellikle, toksik polyQ-genişleme proteinler hemen maya hücrelerini öldürmek değil; onlar yerine bozan veya hücre döngüsü ve hücre devision tutuklu, böylece plaklar veya sıvı kültürler (bizim yayınlanmamış bulgular) maya kolonisi büyümenin yavaşlaması ya da engellenmesi.
2. Maya Hücreleri ile Potansiyel Sorunları Toksik PolyQ-genişleme Proteinler ifade
Aksi takdirde zehirli polyQ genişleme proteinleri Maya hücreleri herhangi bir büyüme kusuru 9 göstermeyebilir. PolyQ-toksisite bu bastırıcılarının genetik yapısı basit Mendel mutasyonlara dayalı görünmüyor ve dolayısıyla nispeten yüksek frekans (bizim yayımlanmamış sonuçlar) ile oluşabilir. Biz bu spontan bastırıcılarının benzer için [RNQ +] polyQ toxicity.Thes belirlenmesinde işlev tanımlanamayan prionlar kür neden olduğu spekülasyonpolyQ toksisite e spontan bastırıcılarının polyQ toksisite karakterize etmek ya da tanımlamak ve polyQ toksisite değiştiriciler karakterize amaçlayan bir deney başarılı sonuç tehlikeye sokabilecek.
Bu spontan bastırıcılarının sık görülmesi önlemek için, çok etkili olduğu kanıtlanmış aşağıda belirtilen önlemler, izleyin:
- Toksisite denemeleri için taze maya hücreleri kullanın. Uzun süre için maya saklamayın. Sıkça dondurulmuş stokları taze maya kolonileri almak.
- Sıkça floresan mikroskop ile ifade ve toksik polyQ-genişleme proteinlerin agregasyonu izlemek.
- Herhangi bir zehirlenme ölçümler başlamadan önce her zaman toksik polyQ toksisite (tek karbon kaynağı olarak glukoz içeren seçici ortam yani) ifadesi bastırmak medyasında maya hücreleri tutun.
- Her polyQ-toksisite deneyi için en az üç bağımsız transformantlar kullanın. </ Li>
3. Büyüme Tahliller
- Her deneysel koşul için, tek karbon kaynağı olarak glukoz ile seçici maya medya 3 ml toksik polyQ-genişleme protein barındıran maya hücrelerinin üç bağımsız transformatlardan her biri koloni aşılamak.
- 30 gece boyunca bu kültürlerin inkübe ° C Ortamda glukoz bunların ifadesi bastıran, çünkü bu koşullar altında, hücrelerin polyQ-genişletme proteini ifade değildir. Bu kültürlerin büyümek izin vermeyin; 1 Aşağıdaki gece kültürlerin OD 600 (600 nm dalga boyundaki ışık absorbans) tutmak.
- Biz rutin olarak toksik polyQ-genişleme proteini ifade maya hücrelerinin büyümesini kusurları izlemek için üç farklı testler kullanabilirsiniz:
Plakalar üzerine 3.1 Büyüme
- Bana seçici 0.0005 bir OD 600 (yani bir OD600 = 0.5 kültürün bir 1:1000 dilüsyon) için gece maya kültürleri (220 rpm çalkalama ile yetiştirilen) sulandırınızdia 7 içeren glikoz.
- Eşit seçici tek karbon kaynağı olarak glukoz içeren orta ve tek karbon kaynağı olarak galaktoz içeren seçici besiyeri ile bir levha ile bir tabak (10 cm çapında) her seyreltilmiş kültürün 50 ul (ca sonuçlanan plaka başına. 700 koloni) yayıldı.
- 30 ° C'de 3-4 gün süreyle inkübe Inkübasyondan sonra, her plaka fotoğraflarını çekmek ve galaktoz tabaklarda glikoz ve kolonilerin sayısı kolonilerin sayısı. Çok zehirli bir polyQ-genişleme protein (103Q, Şekil 2a) ifade maya hücreleri kullanırken İdeal koşullar altında, galaktoz plaka üzerinde hiç ya da çok az koloniler olmalıdır.
3.2 Spotting deneyleri
Bu test kaplama deneyi yukarıda açıklanan daha nicel ve böylece aynı plaka üzerinde aynı deneyi ile polyQ toksisite bile ince farklılıklar ortaya çıkarabilir.
- Overn sulandırınızight kültürlerin 0.1 bir OD 600 glukoz ile orta büyüdü.
- Pipet 200 steril 96-tabak içine bu seyreltilmiş kültürlerin ul ve çok kanallı pipet ile steril su içinde beş beş kat seri dilüsyonlar hazırlamak.
- Bir Frogger, (ayrıca hücre süspansiyonları transferi için 8 x 6 iğneli bir gözcü olarak adlandırılır) kullanarak tek karbon kaynağı ve tek karbon kaynağı olarak galaktoz seçici ortamı içeren plakalar olarak glukoz ile seçici ortam içeren plakalar üzerinde hücre süspansiyonları aktarın.
- Plaka 30 bunları kuluçkaya ° C'de üç dört gün için önce kurumasını bekleyin.
- Inkübasyondan sonra, her plaka fotoğrafları (Şekil 2b) alır.
3.3. Sıvı kültürleri büyüme maya polyQ toksisite izlenmesi
Bu protokol, burada açıklanan üç testlerinin (OD600 numaraları) en nicel ve hatta polyQ toksisite çok ince farkları tespit edebilir. Anılan ocspontan bastırıcılarının currence Ancak, potansiyel olarak yanıltıcı sonuçlar üretebilir. Bu nedenle yukarıda tarif edilen iki kaplama deneyleri en az biri ile bu tahlilde birleştirerek önermektedir. Biz bu deneyler için BioscreenC enstrüman kullanmayı öneriyoruz. BioscreenC tanımlanan ajitasyon ile tanımlanmış sıcaklıklarda inkübe ise otomatik olarak 100 de plaka maya kültürleri optik yoğunluğunu ölçen bir alettir. Maya hücreleri büyüyor ve optik yoğunluk ölçüm için başka yöntemler de uygulanabilir.
- 3 ml steril su içinde tek karbon kaynağı olarak üç kat glukoz ihtiva eden en az ortamından maya hücrelerinin yıkanır.
- 0.1 bir OD 600 galaktoz orta yetiştirilen gecede kültürleri sulandırınız.
- Maya kültürlerin 300 ul 100 kuyucuklu BioscreenC plakanın her doldurun.
- Kolay Bioscreen Deney programını açın. Eğer (boşlukları ve orta dahil olmak üzere sadece izlemek isteyen örneklerin sayısını belirlemekontrol), 30 ° C sıcaklığı ayarlamak 3 gün deneyler uzunluğunu ayarlamak, 15 dakika ölçüm aralıkları ayarlamak, 600 nm filtre / Kahverengi ayarlayın ve her ölçümden önce 15 saniye sallayarak modunu ayarlamak Orta kuvvette.
- BioscreenC alet ve ekli yaz deney sırasında alınan her bir veri noktasının Excel tabloları üretecek.
- Her numune için Excel ile büyüme eğrileri hazırlayın ve farklı örnekleri (Şekil 2c) büyüme karşılaştırın. BioscreenC deneyler tarafından üretilen verinin analizi ayrıntılı bir açıklaması 10 daha önce sağlanmıştır.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1.. Maya polyQ modeli. kısa, toksik olmayan polyQ ifade maya hücreleri gösteren zehirli polyQ-genişleme protein. b a) şematik) Floresans mikroskobugenişleme protein (25Q, sol panel) ve maya hücreleri uzun, toksik polyQ-genişleme protein (103Q, sağ panel) ifade.
Şekil 2. PolyQ-genişleme proteinleri maya hücrelerinin büyümesini tahlillerin Temsilcisi sonuçları. a) Kaplama testi. yaklaşık 700 maya hücreleri 30 ° C'de üç gün boyunca plakalar üzerine yayılmış ve inkübe edildi Üst panel glukoz ihtiva eden bir orta plaka gösterir, toksik polyQ-genişletme protein (103Q) ifadesi, yani uyarılan değildir. Alt panelini galaktoz içeren ortam, bir maya plakası gösterir, toksik polyQ-genişletme proteininin ifadesi yani indüklenir. Deneyde Burada gösterilen dikkat, herhangi bir spontan bastırıcı oluştu. B) assay Spotting. Maya hücrelerinin Beş beş kat seri seyreltiler ya bir toksik olmayan polyQ protein (25Q) veya bir toksik polyQ-genişletme protei barındırann (103Q) proteinleri (sol panel) veya onların ifadesi neden galaktoz tabaklarda ifade bastırmak glukoz plakalar üzerinde tespit edildi. Sonra plakalar ° C. C) BioscreenC deneyi. Ya bir toksik olmayan polyQ protein (25Q) veya bir toksik polyQ-genişletme protein (103Q) eksprese maya hücresi kültürlerinin büyümesi ile izlendi 30 az üç gün süreyle inkübe edildi BioscreenC alet. Deneysel koşullar ve BioscreenC deneylerin analizi temel Metin tarif edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazının toksik polyQ-genişleme proteinleri maya hücrelerinin azalması büyüme dayalı model organizma maya polyQ-toksisite ölçmek için üç tamamlayıcı deneysel yaklaşımlar özetliyor. Maya İş polyQ-genişleme proteinlerin 9,11,12 hatalı katlanması ve toksisite dahil proteinin hatalı katlanması temel hücresel ve moleküler mekanizmalar ve onun ardından gelen toksisitesi, içine derin kavrayışlar teklif etti. Burada sunulan protokolleri esas deneyler zaten polyQ toksisite 5-8,13,14 yatan genetik arttırıcılar veya bastırıcılarının polyQ toksisite, polyQ toksisitesi küçük molekül değiştiricileri ve hücresel mekanizmaları belirlemek ve karakterize etmek için yardımcı oldu.
Sunulan protokolleri kolay gibi farklı büyüme koşulları ya da polyQ toksisite azaltan veya arttıran genetik mutasyonların polyQ toksisite diğer değiştiriciler keşfetmek için adapte edilebilir. Dahası, sunulan deneysel protokolKolayca maya diğer toksik katlanan proteinleri ile toksisite test etmek için ayarlanabilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Duennwald laboratuvarda İş Yaşlanma Araştırma (uzaktan), Kalıtsal Hastalık Vakfı (HDF) ve William Wood Vakfı Amerikan Federasyonu hibe ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frogger (6x8 pins) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100-well Honeycomb plates | Growth Curves USA | 9602550 |
References
- Soto, C., Estrada, L. D.
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T.
- Meriin, A. B. Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains. FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).
- Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).
- Duennwald, M. L., Lindquist, S. Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity. Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).
- Meriin, A. B. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells. J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).
- Gitler, A. D. Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Giorgini, F., Muchowski, P. J. Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast. Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).
- Ehrnhoefer, D. E. Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models. Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).
