מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

Summary

כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים בשמרים

Abstract

Misfolding חלבון קשורה עם מחלות אנושיות רבות, במיוחד מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון ^1. מחלת הנטינגטון (HD) נגרמת על ידי התרחבות חריגה של האזור polyglutamine (polyQ) בתוך huntingtin חלבון. חלבון polyQ-מורחבת huntingtin משיגה קונפורמציה סוטה (כלומר misfolds) וגורם רעילות הסלולר ^2. לפחות שמונה מחלות ניווניות נוספות נגרמות על ידי polyQ למוצרי הרחבות, כולל Ataxias Spinocerebellar ומחלת קנדי ^3.

שמרים אורגניזם מודל יש להקל תובנות משמעותיות על בסיס תאית ומולקולרית של רעילות-polyQ, כולל ההשפעה של הגורמים התוך והבין המולקולרי של polyQ-רעילות, וכן זיהוי של מסלולים תאיים כי לקויי בתאים לבטא polyQ-הרחבה חלבונים ^3-8. חשובלי, היבטים רבים של רעילות-polyQ שנמצאו השמרים היו לשכפל מערכות ניסיוניות אחרות ובמידה מסוימת בדגימות מחולים HD, ובכך מפגין את המשמעות של המודל שמרים על גילוי מנגנונים בסיסיים בבסיס polyQ-רעילות.

בדרך ישירה ופשוטה יחסית כדי לקבוע polyQ-רעילות בשמרים היא למדוד פגמים הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. כתב יד זה מתאר שלוש גישות משלימות הניסוי כדי לקבוע polyQ-רעילות בשמרים על ידי מדידת הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. הראשון שתי גישות ניסיוניות לעקוב אחר הצמיחה השמרים על צלחות, הגישה 3 מנטרת את הצמיחה של תרבויות שמרים נוזליים באמצעות מכשיר BioscreenC.

יתר על כן, כתב היד הזה מתאר קשיים ניסויים שיכולים להתרחש בעת טיפול polyQ מודלים שמרים מתאר אסטרטגיות שיעזרו למנוע אולמזער את הקשיים הללו. פרוטוקולים המתוארים כאן יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין מסלולים גנטיים ומולקולות קטנות לווסת polyQ-רעילות. יתר על כן, מבחני המתוארים יכולים לשמש תבניות עבור ניתוחים מדויקים של רעילות הנגרמת על ידי מחלה הקשורים חלבונים אחרים misfolded במודלים של שמרים.

Protocol

1. ביטוי PolyQ-הרחבה חלבונים רעילים שמרים

ניתוח שיטתי הקימה את רצף חומצות האמינו המדויק של חלבון polyQ-הרחבת שנדרש כדי לייצר רעילות בשמרים ^7. זה חלבון רעיל polyQ-הרחבה מכילה אמינו מסוף הדגל תג ואחריו 17 חומצות האמינו הרצף המקורי של חלבון huntingtin, אזור polyQ, ו-Fusion carboxy מסוף חלבון פלואורסצנטי (או GFP או CFP, ראה תרשים 1). ביטוי של חלבונים עם הרחבות polyQ של 46 glutamines או יותר (למשל 72 ו 103 glutamines) מייצרת רעילות בשמרים כאשר הביע בשליטת מושרה ויחסי האמרגן חזקה GAL1 ^{7, 9.}

כפי שתואר קודם לכן, רעילות polyQ בשמרים ניכר רק בתאים הנושאים את Rnq1p חלבון קונפורמציה הפריון שלה, [RNQ +], למשל זן שמרים W303 ^9. חלבון רעיל polyQ-הרחבת Recapitulates ההיבטים המרכזיים של הביולוגיה, polyQ בשמרים, כגון רעילות אורך תלוי polyQ (ראה להלן) צבירה (איור 1 ב). יש לציין, רעילים polyQ-הרחבה חלבונים לא להרוג תאים שמרים באופן מיידי, הם ולא לפגוע או לעצור את מחזור התא במטריקס התא, ובכך מאט או מעכב את הצמיחה של מושבות שמרים על צלחות או תרבויות נוזלי (נתונים שלא פורסמו שלנו).

2. בעיות אפשריות עם תאים שמרים הבעת רעילים PolyQ-הרחבה חלבונים

בתאי שמרים המבטאים את החלבונים הרעילים אחרת polyQ הרחבה לא יכול להראות כל פגם הצמיחה ^9. הטבע הגנטי של אלה מדכאי של polyQ-רעילות לא נראה להתבסס על מוטציות מנדל פשוטים ולכן יכול להתרחש בתדירות גבוהה יחסית (שלא פורסמו התוצאות שלנו). אנו משערים כי אלה מדכאי ספונטניות נגרמות על ידי ריפוי של פריונים בלתי מזוהים אשר פועלות באופן דומה [RNQ +] בקביעת toxicity.Thes polyQמדכאי ספונטניות אלקטרוני של רעילות polyQ יכול לסכן את התוצאה המוצלחת של הניסוי כל שמטרתו לאפיין רעילות polyQ או לזהות ולאפיין מכפילי של רעילות polyQ.

כדי למנוע תופעה מתמשכת של אלה מדכאי ספונטניות, בצע באמצעי הזהירות המפורטים להלן, אשר הוכח כיעיל ביותר:

1. שימוש בתאי שמרים טריים לניסויים רעילות. אין לאחסן השמרים במשך פרקי זמן ארוכים. לעתים קרובות להחזיר מושבות שמרים טריים ממניות קפואים.
2. לעתים קרובות לפקח על הביטוי צבירה של polyQ-הרחבה חלבונים רעילים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
3. לשמור על התאים שמרים בתקשורת כי לדכא את הביטוי של רעילות polyQ רעילים בכל עת (כלומר בתקשורת סלקטיביים המכילים גלוקוז כמקור פחמן יחיד) לפני תחילת כל המידות רעילות.
4. השתמש לפחות שלוש transformants עצמאיים לניסוי polyQ-רעילות זה. </ Li>

3. הצמיחה מבחני

1. עבור כל תנאי הניסוי, ולחסן 1 כל המושבה משלושה transformants עצמאיים של תאים שמרים מחסה חלבון רעיל polyQ-התרחבות מ"ל 3 של התקשורת שמרים סלקטיבית עם גלוקוז כמקור פחמן יחיד.
2. דגירה אלה תרבויות לילה ב 30 ° C. בתנאים אלה, התאים לא מבטאים את החלבון polyQ-הרחבת בגלל הגלוקוז בינוני מדכא הביטוי שלהם. אל תתנו אלה לגדול יותר תרבויות, לשמור על OD ₆₀₀ (ספיגת אור באורך גל 600 ננומטר) של תרבויות לילה מתחת 1.
3. אנו משתמשים באופן שגרתי שלושה מבחני שונות כדי לעקוב אחר ליקויים הצמיחה של תאים שמרים המבטאים את חלבון רעיל polyQ-הרחבה:

3.1 גידול על צלחות

1. לדלל את התרבויות שמרים לילה (גדל עם הרעידות 220 סל"ד) ל OD ₆₀₀ של 0.0005 (כלומר דילול של 1:1000 תרבות OD600 = 0.5) ב סלקטיבית ליקוטר ⁷ המכילה גלוקוז.
2. להתפשט באופן שווה 50 μl (וכתוצאה מכך CA. 700 מושבות בכל צלחת) של כל תרבות בדילול מלא על צלחת 1 (10 ס"מ קוטר) עם בינוני סלקטיבית המכילה גלוקוז כמקור פחמן יחיד ואחד בינוני עם צלחת סלקטיבית המכיל גלקטוז כמקור פחמן יחיד.
3. דגירה צלחות במשך שלושה עד ארבעה ימים על 30 ° C. לאחר הדגירה, לצלם כל צלחת ולספור את מספר המושבות על רמת הסוכר ואת מספר מושבות על צלחות גלקטוז. בתנאים אידיאליים, לא אמורה להיות מושבות מעט מאוד או לא רק על הצלחת גלקטוז בעת שימוש בתאי שמרים להביע רעיל מאוד polyQ-הרחבה חלבון (103Q, איור 2 א).

3.2 מבחני הבחינה

Assay זה כמותי יותר assay ציפוי המתואר לעיל ולכן יכול לחשוף שאפילו הבדלים דקים רעילות polyQ עם הניסוי אותו על אותה צלחת.

1. לדלל את overnתרבויות ight גדל בינוני עם סוכר כדי OD של ₆₀₀ 0.1.
2. פיפטה 200 μl של תרבויות אלו המדולל לתוך 96-גם צלחות סטריליות ולהכין חמש דילולים סדרתי פי חמישה בתוך מים סטריליים באמצעות פיפטה רב ערוצי.
3. שימוש Frogger, (המכונה גם הצופה, עם 8 x 6 פינים להעברת השעיות סלולריים) להעביר את המתלים סלולריים על צלחות המכילות מדיה סלקטיבית עם גלוקוז כמקור פחמן הבלעדית צלחות המכילות מדיה סלקטיבית עם גלקטוז כמקור פחמן יחיד.
4. אפשר הצלחות להתייבש לפני דוגרים אותם 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים.
5. לאחר הדגירה, לצלם כל צלחת (איור 2b).

3.3. מעקב אחר רעילות polyQ בשמרים על ידי צמיחה של תרבויות נוזלי

פרוטוקול זה הוא כמותי ביותר (OD600 מספרים) של שלושת מבחני המתוארים כאן והוא יכול גם לזהות הבדלים דקים מאוד רעילות polyQ. הנ"ל OCcurrence של מדכאי ספונטניות, לעומת זאת, עלולה להביא לתוצאות מטעות. לכן אני ממליץ שילוב זה assay עם לפחות אחד משני מבחני ציפוי שתוארו לעיל. אנו מציעים להשתמש במכשיר BioscreenC לניסויים אלה. BioscreenC הוא מכשיר אוטומטי מודד את צפיפות אופטית של תרבויות השמרים 100-גם צלחות תוך מודגרות בטמפרטורות מוגדרים בהתרגשות מוגדר. שיטות אחרות לגידול תאים שמרים ומדידת צפיפות אופטית שלהם עשוי לחול גם.

1. שוטפים את התאים שמרים מהתקשורת מינימלי המכילים גלוקוז כמקור פחמן יחיד שלוש פעמים במים 3 מ"ל סטרילי.
2. לדלל את התרבויות לילה שגודלו בינוני עם גלקטוז כדי OD של ₆₀₀ 0.1.
3. ממלאים כל טוב צלחת 100-גם BioscreenC עם 300 μl של תרבויות שמרים.
4. פתח את התוכנית Easy ניסוי Bioscreen. לקבוע את מספר דגימות ברצונך לעקוב אחר (כולל החסר ובינוניים בלבדשולטת), להגדיר את הטמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס, להגדיר את משך הניסויים עד 3 ימים, לקבוע את המרווחים המדידה 15 דקות, קבע את המסנן 600 ננומטר / בראון, להגדיר את מצב רעד של 15 שניות לפני כל מדידה ב בינוני כוח.
5. מכשיר BioscreenC והתוכנה המצורפת יפיק Excel גיליונות אלקטרוניים של נקודת נתונים כל נלקח במהלך הניסוי.
6. להכין עקומות גדילה עם Excel עבור מדגם זה והשווה הצמיחה של מדגמים שונים (איור 2 ג). תיאור מפורט של ניתוח נתונים המיוצרים על ידי ניסויים BioscreenC סופק לפני ^10.

4. נציג תוצאות

באיור 1. שמרים polyQ המודל. א) ייצוג סכמטי של חלבון רעיל polyQ ב-הרחבה.) מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה בתאי שמרים המבטאים קצר, רעיל polyQתאים חלבון הרחבה (25Q, פאנל משמאל) שמרים ביטוי רב, חלבון רעיל polyQ-הרחבה (לוח 103Q, נכון).

איור 2. תוצאות נציג של מבחני הצמיחה של תאים שמרים המבטאים polyQ-הרחבה חלבונים. א) ציפוי assay. כ 700 תאים שמרים פוזרו על צלחות מודגרות במשך שלושה ימים ב 30 ° C. הפאנל העליון מציג את צלחת ובה בינוני הגלוקוז, כלומר את הביטוי של החלבון polyQ-הרחבת רעילים (103Q) לא מושרה. הפאנל התחתון מציג את צלחת השמרים המכיל בינוני גלקטוז, כלומר את הביטוי של החלבון polyQ-הרחבת רעילים מושרה. שימו לב בניסוי המוצג כאן, לא מדכא ספונטנית התרחשה. ב) הבחינה assay. חמש סדרתי פי חמישה דילולים של תאים שמרים מחסה או חלבון רעיל polyQ (25Q) או רעילים polyQ-הרחבת protein (103Q) נראו על צלחות גלוקוז כי לדכא את הביטוי של חלבונים (פאנל משמאל) או על צלחות גלקטוז כי להשרות הביטוי שלהם. הצלחות היו מודגרות מכן במשך שלושה ימים ב 30 ° C. ג) ניסוי BioscreenC. צמיחה של תרבויות של תאים המבטאים שמרים או חלבון רעיל polyQ (25Q) או חלבון רעיל polyQ-הרחבה (103Q) נוטרו על ידי BioscreenC המכשיר. תנאי הניסוי וניתוח של ניסויים BioscreenC מתוארים בטקסט הראשי.

Discussion

כתב יד זה מתאר שלוש גישות ניסיוניות משלימות כדי למדוד polyQ-רעילות בשמרים אורגניזם מודל המבוסס על צמיחה מופחתת של תאים שמרים המבטאים רעילים polyQ-הרחבה חלבונים. עבודה שמרים הציעה תובנות עמוקות לתוך המנגנונים תאית ומולקולרית הבסיסיים של misfolding חלבון ו רעילות שהתפתח שלה, כולל misfolding ורעילות של polyQ-הרחבה חלבונים ^9,11,12. ניסויים המבוססים על הפרוטוקולים שהוצגו כאן כבר עזרו לזהות ולאפיין משפרי גנטיים או מדכאי של רעילות polyQ, מכפילי מולקולה קטנה של רעילות polyQ, ואת המנגנונים התאיים בבסיס polyQ רעילות ^5-8,13,14.

הפרוטוקולים שהוצגו יכול בקלות להיות מותאמים לחקור מכפילי אחרים של רעילות polyQ כגון תנאי גידול שונים או מוטציות גנטיות מפחיתה או להחריף את רעילות polyQ. יתר על כן, פרוטוקול הניסוי שהוצגיכול בקלות להיות מותאם כדי לבדוק את רעילות של אחרים חלבונים misfolded רעילים שמרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Frogger (6x8 pins)	V&P Scientific	VP 407 AH
BioscreenC	Growth Curves USA	5101370
100-well Honeycomb plates	Growth Curves USA	9602550