Summary
इस पांडुलिपि खमीर में पॉलीग्लुटामाइन की विषाक्तता (polyQ) विस्तार प्रोटीन का आकलन करने के लिए तीन पूरक प्रोटोकॉल का वर्णन
Abstract
प्रोटीन misfolding कई मानव रोगों, अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, और हंटिंगटन 1 बीमारी के रूप में विशेष रूप से neurodegenerative रोगों, के साथ जुड़ा हुआ है. है Huntington रोग (HD) प्रोटीन huntingtin भीतर एक पॉलीग्लुटामाइन क्षेत्र के (polyQ) के असामान्य विस्तार के कारण होता है. polyQ-विस्तारित huntingtin प्रोटीन एक न्यायपालिका रचना (यानी यह misfolds) के उपलब्ध हो जाता है और सेलुलर विषाक्तता 2 का कारण बनता है. कम से कम आठ आगे neurodegenerative रोगों Spinocerebellar ataxias और कैनेडी 3 रोग सहित polyQ विस्तार, की वजह से कर रहे हैं.
मॉडल जीव खमीर polyQ विषाक्तता के सेलुलर और आणविक आधार में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि में मदद की है polyQ-विषाक्तता का अंतर और अंतर - आणविक कारकों के प्रभाव है, और सेलुलर मार्ग है कि कोशिकाओं में प्रभावित कर रहे हैं की पहचान polyQ विस्तार व्यक्त सहित, 3-8 प्रोटीन. महत्वपूर्णly, polyQ विषाक्तता के कई पहलुओं है कि खमीर में पाया गया है अन्य प्रायोगिक प्रणाली में और HD रोगियों से नमूनों में कुछ हद तक reproduced रहे थे, इस प्रकार polyQ विषाक्तता अंडरपाईनिंग बुनियादी तंत्र की खोज के लिए खमीर मॉडल के महत्व का प्रदर्शन.
एक प्रत्यक्ष और अपेक्षाकृत सरल खमीर में polyQ विषाक्तता का निर्धारण करने के लिए व्यक्त polyQ विस्तार प्रोटीन खमीर कोशिकाओं की वृद्धि दोष उपाय है. इस पांडुलिपि तीन पूरक प्रयोगात्मक खमीर में polyQ विस्तार प्रोटीन व्यक्त खमीर कोशिकाओं के विकास को मापने के द्वारा polyQ विषाक्तता का निर्धारण दृष्टिकोण का वर्णन करता है. पहले दो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्लेटों पर खमीर विकास की निगरानी, तीसरे दृष्टिकोण तरल खमीर BioscreenC साधन का उपयोग संस्कृतियों के विकास पर नज़र रखता है.
इसके अलावा, इस पांडुलिपि प्रायोगिक कठिनाइयों का वर्णन है कि जब खमीर polyQ मॉडल से निपटने हो सकता है और रणनीति है कि या बचने में मदद मिलेगी रूपरेखाइन कठिनाइयों को कम से कम. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल की पहचान करने और आनुवंशिक रास्ते और छोटे अणुओं है कि polyQ विषाक्तता मिलाना विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, वर्णित assays के खमीर मॉडल में अन्य रोग संबद्ध misfolded प्रोटीन की वजह से विषाक्तता की सटीक विश्लेषण के लिए टेम्पलेट के रूप में सेवा कर सकता है.
Protocol
1. खमीर के में विषाक्त PolyQ के विस्तार प्रोटीन की अभिव्यक्ति
एक व्यवस्थित विश्लेषण सटीक polyQ विस्तार है कि के खमीर 7 में विषाक्तता का उत्पादन करने के लिए आवश्यक है एक प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम स्थापित किया है. यह विषाक्त प्रोटीन polyQ विस्तार एक एमिनो टर्मिनल 17 huntingtin प्रोटीन, polyQ क्षेत्र के, और एक carboxy टर्मिनल संलयन की मूल अनुक्रम से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (या तो GFP या CFP अमीनो एसिड के बाद झंडा - टैग होते हैं, देखें चित्र 1) एक. 46 glutamines या अधिक की polyQ विस्तार के साथ प्रोटीन की अभिव्यक्ति (72 और 103 glutamines जैसे) खमीर में विषाक्तता का उत्पादन जब inducible और रिश्तेदार मजबूत GAL1 7 प्रमोटर, 9 के नियंत्रण के तहत व्यक्त की है.
जैसा कि पहले वर्णित है, polyQ विषाक्तता में खमीर कोशिकाओं है कि के prion रचना में प्रोटीन Rnq1p ले जाने में ही स्पष्ट है, [RNQ] उदाहरण के लिए, खमीर तनाव W303 9. विषाक्त प्रोटीन polyQ विस्तार आरecapitulates खमीर में polyQ जीव विज्ञान की केंद्रीय polyQ लंबाई पर निर्भर (नीचे देखें) विषाक्तता और एकत्रीकरण (चित्रा 1 ख) जैसे पहलुओं. विशेष रूप से, विषाक्त polyQ विस्तार प्रोटीन खमीर कोशिकाओं को तुरंत नहीं मार नहीं है, बल्कि वे क्षीण या सेल चक्र और कोशिका devision गिरफ्तार, जिससे धीमा या बाधा प्लेटों या तरल संस्कृतियों (हमारे अप्रकाशित डेटा) पर खमीर कालोनियों के विकास.
2. खमीर कोशिकाओं के साथ संभावित समस्याओं विषाक्त PolyQ विस्तार प्रोटीन व्यक्त
अन्यथा विषाक्त polyQ विस्तार प्रोटीन व्यक्त खमीर कोशिकाओं कोई वृद्धि 9 दोष नहीं दिखा सकते हैं. polyQ विषाक्तता के इन दमन की आनुवंशिक प्रकृति सरल Mendelian परिवर्तन पर आधारित होना प्रकट नहीं होता और इस प्रकार अपेक्षाकृत उच्च आवृत्ति (हमारे अप्रकाशित परिणाम) के साथ हो सकता है. हम सोचते हैं कि इन सहज दमन अज्ञात prions है कि इसी तरह [RNQ] polyQ toxicity.Thes का निर्धारण में समारोह का इलाज करने की वजह से कर रहे हैंpolyQ विषाक्तता की ई सहज दमन कि polyQ विषाक्तता विशेषताएँ या polyQ विषाक्तता के संशोधक की पहचान और विशेषताएँ करना है किसी भी प्रयोग के सफल परिणाम ख़तरे में डालना कर सकते हैं.
आदेश में इन सहज दमन के लगातार घटना से बचने के लिए एहतियाती उपाय, नीचे उल्लिखित है जो बहुत प्रभावी होना सिद्ध कर दिया है का पालन करें:
- विषाक्तता प्रयोगों के लिए ताजा खमीर कोशिकाओं का उपयोग करें. समय की विस्तारित अवधि के लिए खमीर की दुकान मत करो. अकसर जमे हुए स्टॉक से ताजा खमीर कालोनियों को पुनः प्राप्त.
- अकसर माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति द्वारा विषाक्त polyQ विस्तार प्रोटीन एकत्रीकरण अभिव्यक्ति की निगरानी.
- मीडिया है कि किसी भी विषाक्तता मापन शुरू करने से पहले हर समय विषाक्त polyQ विषाक्तता (चयनात्मक एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज युक्त मीडिया में IE) की अभिव्यक्ति को दबाने में खमीर कोशिकाओं रखें.
- प्रत्येक प्रयोग polyQ विषाक्तता के लिए कम से कम तीन स्वतंत्र transformants का प्रयोग करें. </ Li>
3. विकास Assays
- प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए, खमीर एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज के साथ चयनात्मक खमीर मीडिया की 3 मिलीलीटर में विषाक्त प्रोटीन polyQ विस्तार के शरण कोशिकाओं के तीन स्वतंत्र transformants में से एक कॉलोनी प्रत्येक टीका लगाना.
- इन संस्कृतियों रातोंरात सेते हैं 30 में डिग्री सेल्सियस इन शर्तों के तहत, कक्षों प्रोटीन polyQ विस्तार नहीं व्यक्त क्योंकि मध्यम में ग्लूकोज उनकी अभिव्यक्ति represses रहे हैं. इन संस्कृतियों ऊंचा हो जाना मत देना, 1 नीचे रात भर संस्कृतियों के 600 (600 एनएम तरंगदैर्ध्य के प्रकाश के absorbance के) आयुध डिपो रखना.
- हम नियमित रूप से तीन अलग assays के उपयोग के लिए खमीर कोशिकाओं को विषाक्त प्रोटीन polyQ विस्तार व्यक्त की वृद्धि दोष की निगरानी:
प्लेटों पर 3.1 की वृद्धि
- रात में खमीर संस्कृतियों 600 आयुध डिपो के .०,००५ की (यानी एक OD600 = 0.5 संस्कृति के 1:1000 मन्दन) पतला (220 rpm के झटकों के साथ हो) मुझे चयनात्मक मेंव्यास 7 युक्त ग्लूकोज.
- बराबर भागों में एक प्लेट (10 सेमी व्यास) पर चयनात्मक एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूकोज युक्त मध्यम और एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में चयनात्मक galactose युक्त मध्यम के साथ एक थाली के साथ प्रत्येक पतला संस्कृति की 50 μl (ca में जिसके परिणामस्वरूप प्लेट प्रति 700 कालोनियों) फैल.
- 30 डिग्री सेल्सियस पर तीन से चार दिन के लिए प्लेटें सेते हैं ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक प्लेट की तस्वीरें लेने के लिए और ग्लूकोज और galactose प्लेटों पर कालोनियों की संख्या पर कालोनियों की संख्या गिनती. आदर्श परिस्थितियों के अंतर्गत, वहाँ जब galactose थाली पर नहीं है या केवल बहुत कुछ कालोनियों के खमीर कोशिकाओं का उपयोग कर एक बेहद जहरीला प्रोटीन polyQ विस्तार (103Q, 2a चित्रा) व्यक्त करना चाहिए.
3.2 खोलना assays के
इस परख अधिक मात्रात्मक से चढ़ाना परख ऊपर वर्णित है और इस प्रकार एक ही थाली पर ही प्रयोग के साथ polyQ विषाक्तता में भी सूक्ष्म अंतर को प्रकट कर सकते हैं.
- Overn पतलाight संस्कृतियों एक 600 आयुध डिपो के लिए ग्लूकोज के साथ 0.1 के माध्यम में हो.
- विंदुक बाँझ 96 अच्छी तरह से प्लेट में 200 इन पतला संस्कृतियों के μl और बाँझ पानी में पांच पांचगुना धारावाहिक dilutions के एक विंदुक मल्टी चैनल का उपयोग कर तैयार.
- Frogger, (भी एक हवाई जहाज़ की सेल निलंबन के हस्तांतरण के लिए 8 x 6 पिन के साथ, कहा जाता है) का प्रयोग एकमात्र कार्बन स्रोत और एकमात्र स्रोत के रूप में कार्बन galactose के साथ चयनात्मक मीडिया वाले प्लेटों के रूप में ग्लूकोज के साथ चयनात्मक मीडिया को रोकने के प्लेट पर सेल निलंबन हस्तांतरण.
- प्लेटों उन्हें incubating के ° 30 में तीन से चार दिनों के लिए सी से पहले शुष्क करने की अनुमति.
- ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक प्लेट (चित्रा 2b) की तस्वीरें ले लो.
3.3. तरल संस्कृतियों के विकास के द्वारा खमीर में polyQ विषाक्तता की निगरानी
यह प्रोटोकॉल का सबसे अधिक तीन यहाँ वर्णित assays के मात्रात्मक (OD600 संख्या) है और यहां तक कि polyQ विषाक्तता में बहुत ही सूक्ष्म अंतर का पता लगा सकते हैं. इस aforementioned ocसहज दमन की currence बहरहाल, संभावित भ्रामक परिणाम का उत्पादन कर सकते हैं. इसलिए मैं कम से कम दो चढ़ाना assays के ऊपर वर्णित के साथ इस परख के संयोजन की सलाह देते हैं. हम इन प्रयोगों लिए BioscreenC साधन का उपयोग करने का प्रस्ताव है. BioscreenC एक उपकरण है कि स्वचालित रूप से 100 अच्छी तरह से प्लेट में खमीर संस्कृतियों की ऑप्टिकल घनत्व उपायों जबकि को परिभाषित आंदोलन के साथ परिभाषित तापमान पर incubated है. खमीर कोशिकाओं से बढ़ रही है और उनके ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए अन्य तरीकों में भी लागू हो सकता है.
- खमीर कोशिकाओं को एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में कम से कम ग्लूकोज 3 मिलीग्राम बाँझ पानी में तीन बार से युक्त मीडिया से धो लें.
- रात भर संस्कृतियों पतला 0.1 के एक 600 आयुध डिपो के लिए galactose के साथ मध्यम में हो.
- खमीर संस्कृतियों की 300 μl के साथ 100 अच्छी तरह से BioscreenC प्लेट की हर अच्छी तरह से भरें.
- आसान Bioscreen प्रयोग कार्यक्रम खोलें. तुम पर नजर रखने की इच्छा (कारतूस और केवल मध्यम सहित नमूनों की संख्या का निर्धारण) नियंत्रण, 30 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट, 3 दिन के लिए प्रयोगों की लंबाई सेट, 15 मिनट के लिए माप के अंतराल सेट, सेट करने के लिए फिल्टर 600 एनएम / ब्राउन, और प्रत्येक माप से पहले मिलाते हुए 15 सेकंड के लिए मोड सेट पर मध्यम ताकत.
- BioscreenC साधन और संलग्न सॉफ्टवेयर के प्रत्येक डेटा बिंदु के प्रयोग के दौरान लिया Excel स्प्रेडशीट्स का उत्पादन होगा.
- Excel के साथ विकास घटता प्रत्येक नमूना के लिए तैयार विभिन्न नमूने (चित्र 2c) की वृद्धि की तुलना. BioscreenC प्रयोगों द्वारा उत्पादित डेटा के विश्लेषण की एक विस्तृत वर्णन 10 से पहले प्रदान की गई है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
आकृति 1. खमीर polyQ मॉडल. विषाक्त प्रोटीन polyQ विस्तार ख.) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दिखा खमीर कोशिकाओं व्यक्त एक छोटी, गैर विषैले polyQविस्तार प्रोटीन (25Q, पैनल बाएं) और खमीर कोशिकाओं को एक लंबे, विषाक्त प्रोटीन polyQ विस्तार (103Q, सही पैनल) व्यक्त.
चित्रा 2. खमीर polyQ विस्तार प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की वृद्धि assays के प्रतिनिधि परिणाम है. a) चढ़ाना परख लगभग 700 खमीर कोशिकाओं प्लेटों पर फैल रहे थे और 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे तीन दिन के लिए ऊपरी पैनल एक ग्लूकोज माध्यम युक्त थाली से पता चलता है, यानी विषाक्त polyQ विस्तार प्रोटीन (103Q) की अभिव्यक्ति नहीं प्रेरित है. कम पैनल एक खमीर युक्त थाली galactose माध्यम से पता चलता है, यानी विषाक्त polyQ विस्तार प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित है. नोट करें कि प्रयोग में यहाँ दिखाया, कोई सहज शमन हुई. ख) परख खोलना पांच खमीर कोशिकाओं के धारावाहिक पांच गुना dilutions के या तो एक गैर विषैले polyQ (25Q) प्रोटीन या एक जहरीले polyQ विस्तार protei शरणn (103Q) ग्लूकोज प्लेटें कि प्रोटीन (बाईं पैनल) की या galactose प्लेटें कि उनकी अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित पर अभिव्यक्ति को दबाने पर देखा गया. प्लेट तो 30 से कम तीन दिनों के लिए incubated रहे थे डिग्री सेल्सियस ग है) BioscreenC प्रयोग. खमीर कोशिकाओं या तो एक गैर विषैले polyQ (25Q) प्रोटीन या एक जहरीले प्रोटीन polyQ विस्तार (103Q) व्यक्त की संस्कृतियों के विकास के द्वारा निगरानी की गई BioscreenC साधन. प्रयोगात्मक शर्तों और BioscreenC प्रयोगों के विश्लेषण के मुख्य पाठ में वर्णित हैं.
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Discussion
इस पांडुलिपि तीन पूरक प्रयोगात्मक मॉडल जीव खमीर खमीर कोशिकाओं को विषाक्त polyQ विस्तार प्रोटीन व्यक्त की कम वृद्धि पर आधारित में polyQ विषाक्तता को मापने के दृष्टिकोण की रूपरेखा. खमीर में काम प्रोटीन misfolding की बुनियादी सेलुलर और आणविक तंत्र और इसकी आगामी विषाक्तता और 9,11,12 polyQ विस्तार प्रोटीन की misfolding विषाक्तता सहित, में गहन अंतर्दृष्टि की पेशकश की है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पर आधारित प्रयोगों को पहले से ही की पहचान करने और आनुवंशिक enhancers हैं या polyQ विषाक्तता के दमन, polyQ विषाक्तता के छोटे अणु संशोधक, और सेलुलर तंत्र polyQ विषाक्तता 5-8,13,14 अंडरपाईनिंग विशेषताएँ मदद की है.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल को आसानी से अलग विकास की स्थिति या आनुवंशिक परिवर्तन कि या तो कम या polyQ विषाक्तता बढ़ा जैसे polyQ विषाक्तता के अन्य संशोधक का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉलआसानी से करने के लिए खमीर में अन्य विषाक्त misfolded प्रोटीन की विषाक्तता का परीक्षण करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
Duennwald प्रयोगशाला में काम एजिंग रिसर्च (दूर), वंशानुगत रोग फाउंडेशन (HDF) और विलियम वुड फाउंडेशन के लिए अमेरिकी संघ से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frogger (6x8 pins) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100-well Honeycomb plates | Growth Curves USA | 9602550 |
References
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