Summary
Detta manuskript beskriver tre kompletterande protokoll för att bedöma toxicitet polyglutaminsystem (polyQ)-expansion proteiner i jästen
Abstract
Protein felveckning förknippas med många sjukdomar hos människan, i synnerhet neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom 1. Huntingtons sjukdom (HD) är orsakad av onormal utvidgning av en polyglutaminsystem (polyQ) regionen i proteinet huntingtin. Den polyQ-expanderade huntingtin protein uppnår en avvikande konformation (dvs det misfolds) och orsakar cellulär toxicitet 2. Minst ytterligare åtta neurodegenerativa sjukdomar orsakas av polyQ-expansioner, inklusive spinocerebellära ataxi och Kennedys sjukdom 3.
Modellen organismen jästen har underlättat betydande insikter i cellulära och molekylära grunden för polyQ-toxicitet, inklusive effekten av intra-och inter-molekylära faktorer polyQ-toxicitet, och identifieringen av cellulära vägar som är osäkra i celler som uttrycker polyQ expansion proteiner 3-8. Viktigtly har många aspekter av polyQ-toxicitet som hittades i jäst återges i andra experimentella system och i viss utsträckning i prover från HD patienter, vilket visar betydelsen av jästen modell för upptäckten av grundläggande mekanismer som ligger till grund polyQ-toxicitet.
En direkt och relativt enkelt sätt att bestämma polyQ-toxicitet i jäst är att mäta tillväxtdefekter av jästceller som uttrycker polyQ expansion proteiner. Detta manuskript beskriver tre komplementära experimentella metoder för att bestämma polyQ-toxicitet i jäst genom att mäta tillväxt av jästceller som uttrycker polyQ expansion proteiner. De två första experimentella metoder att övervaka jäst tillväxt på plattor, övervakar tredje metoden tillväxten av flytande jästkulturer använder BioscreenC instrumentet.
Vidare beskriver detta manuskript experimentella svårigheter som kan uppstå vid hantering av modellerna jäst polyQ och beskriver strategier som bidrar till att undvika ellerminimera dessa svårigheter. De protokoll som beskrivs här kan användas för att identifiera och karakterisera genetiska vägar och små molekyler som modulerar polyQ-toxicitet. Vidare kan de beskrivna analyserna tjäna som mallar för noggranna analyser av toxicitet orsakad av andra sjukdomar associerade med felveckade proteiner i jäst modeller.
Protocol
1. Uttryck av Toxic PolyQ expansion proteiner i jäst
En systematisk analys har visat att det exakta aminosyrasekvensen hos en polyQ-expansionen protein som krävs för att producera toxicitet i jäst 7. Detta giftiga polyQ-expansionen proteinet innehåller en amino-terminal FLAG-markör följt av 17 aminosyror från den ursprungliga sekvensen för huntingtin proteinet, en polyQ region, och en karboxi-terminal fusion till ett fluorescerande protein (antingen GFP eller GFP, se figur 1 en). Uttrycket av proteiner med polyQ expansion av 46 glutaminerna eller mer (t.ex. 72 och 103 glutaminerna) alstrar toxicitet i jäst när den uttrycks under kontroll av den inducerbara och relativt starka GAL 1-promotom 7, 9.
Såsom beskrivits tidigare är polyQ toxicitet i jäst endast uppenbar i celler som bär proteinet Rnq1p i sin prion konformation, [RNQ +], t.ex. jäststammen W303 9. Den toxiska polyQ-expansionen proteinet recapitulates centrala aspekter av polyQ-biologi i jäst, såsom polyQ längdberoende toxicitet (se nedan) och aggregering (Figur 1 B). Anmärkningsvärt, dödar giftiga polyQ expansion proteiner inte jästceller omedelbart, de hellre försämrar eller stoppa cellcykeln och cell devision därmed bromsa eller hämma tillväxten av jäst kolonier på plattor eller flytande kulturer (våra opublicerade data).
2. Potentiella problem med jästceller som uttrycker Giftiga PolyQ expansion proteiner
Jästceller som uttrycker de annars toxiska polyQ expansion proteiner kan inte visa någon tillväxt defekt 9. Den genetiska naturen hos dessa suppressorer av polyQ-toxicitet verkar inte vara baserad på enkla Mendel mutationer och därmed kan förekomma med relativt hög frekvens (våra opublicerade resultat). Vi spekulerar att dessa spontana suppressorer orsakas av härdningen av oidentifierade prioner som fungerar på liknande sätt som [RNQ +] för att bestämma polyQ toxicity.These spontana suppressorer av polyQ toxicitet kan äventyra det framgångsrika resultatet av något experiment som syftar till att karaktärisera polyQ toxicitet eller för att identifiera och karakterisera modifierare av polyQ toxicitet.
För att undvika den frekventa förekomsten av dessa spontana suppressorer, följ försiktighetsåtgärder som anges nedan och som har visat sig vara mycket effektivt:
- Använd färsk jäst celler för toxicitet experiment. Förvara inte jäst under längre tidsperioder. Ofta hämtar färsk jäst kolonier från frysta lager.
- Ofta övervaka uttryck och aggregering av giftiga polyQ expansion proteiner genom fluorescensmikroskopi.
- Håll jästceller i media som undertrycker uttryck av den giftiga polyQ effekter vid alla tider (dvs. selektiva medier innehållande glukos som enda kolkälla) innan några toxicitet mätningar.
- Använd minst tre oberoende transformanter för varje polyQ-toxicitet experiment. </ Li>
3. Tillväxtanalyser
- För varje experimentell betingelse, inokulera en koloni var från tre oberoende transformanter av jästceller, som hyste den toxiska polyQ-expansionen protein i 3 ml selektiva jäst medium med glukos som enda kolkälla.
- Inkubera dessa kulturer över natten vid 30 ° C. Under dessa betingelser är de celler som uttrycker inte den polyQ-expansionen proteinet eftersom glukos i mediet undertrycker expression därav. Låt inte dessa kulturer växa över, hålla OD 600 (absorbans av ljus med 600 nm våglängd) av natten kulturerna under 1.
- Vi använder rutinmässigt tre olika analyser för att följa tillväxten defekter av jästceller som uttrycker toxiska polyQ-expansionen proteinet:
3,1 Tillväxt på tallrikar
- Späd natten jästkulturer (odlades med 220 rpm skakning) till ett OD 600 av 0,0005 (dvs. en 1:1000 utspädning av ett OD600 = 0,5 kultur) i selektiv mindia 7 innehåller glukos.
- Jämnt fördelad 50 pl (resulterande i CA. 700 kolonier per platta) av varje utspädd kultur på en platta (10 cm diameter) med selektivt medium innehållande glukos som enda kolkälla och en platta med selektivt medium innehållande galaktos som enda kolkälla.
- Inkubera plattorna under tre till fyra dagar vid 30 ° C. Efter inkubationen ta fotografier av varje platta och räkna antalet kolonier på glukos-och antalet kolonier på galaktos-plattor. Under ideala betingelser, bör det inte finnas några eller endast mycket få kolonier på galaktos plattan vid användning jästceller som uttrycker en mycket giftig polyQ-expansionen proteinet (103Q, fig 2a).
3,2 Spotting analyser
Denna analys är mer kvantitativ än pläterings-analysen beskriven ovan, och kan sålunda avslöjar även små skillnader i polyQ toxicitet med samma experiment på samma platta.
- Späda ut overnight kulturer odlades i medium med glukos till en OD 600 på 0,1.
- Pipett 200 | il av dessa utspädda kulturer i sterila 96-brunnsplattor och förbereda fem femfaldigt seriespädningar i sterilt vatten med användning av en multikanalpipett.
- Användning av en Frogger, (även kallad en observatör, med 8 x 6 stift för överföring av cellsuspensioner) överföra cellsuspensionerna på plattor innehållande selektiva medier med glukos som enda kolkälla och plattor innehållande selektiva media med galaktos som enda kolkälla.
- Låt plattorna torka innan inkubera dem vid 30 ° C under tre till fyra dagar.
- Efter inkubationen ta fotografier av varje platta (figur 2b).
3,3. Övervakning polyQ toxicitet i jäst genom tillväxt av flytande odlingar
Detta protokoll är det mest kvantitativa (OD600 nummer) av de tre analyserna beskrivna här och kan till och med detektera mycket små skillnader i polyQ toxicitet. Den tidigare nämnda ocströmkälla av spontana suppressorer, kan emellertid potentiellt ge felaktiga resultat. I det rekommenderas därför att kombinera denna analys med åtminstone en av de två pläteringsprocesser analyserna beskrivna ovan. Föreslår vi att använda den BioscreenC instrumentet för dessa experiment. Den BioscreenC är ett instrument som automatiskt mäter den optiska densiteten av jästkulturer i 100-brunnsplattor medan inkuberades vid definierade temperaturer med definierad omröring. Andra metoder för växande jästceller och mätning av deras optiska densitet kan också tillämpas.
- Tvätta jästcellerna från minimala media innehållande glukos som enda kolkälla tre gånger i 3 ml sterilt vatten.
- Späd övernattskulturer odlade i medium med galaktos till en OD 600 på 0,1.
- Fylla varje brunn i 100 brunnar BioscreenC platta med 300 | il av de jästkulturer.
- Öppna Easy Bioscreen Experiment program. Bestäm antalet prov som du vill övervaka (inbegripet ämnen och medelstora barakontroller), ställa in temperaturen till 30 ° C, ange längden av experimenten till 3 dagar, ställa mätintervallen till 15 minuter, ställ in filtret till 600 nm / Brown, och ställ in skaka läget till 15 sekunder innan varje mätning vid medelhög styrka.
- Den BioscreenC instrument och den bifogade programvaran kommer att producera Excel för varje datapunkt tas under experimentet.
- Framställ tillväxtkurvor med Excel för varje prov och jämföra tillväxt av olika prover (figur 2c). En detaljerad beskrivning av analys av uppgifter från BioscreenC försök har lämnats före den 10.
4. Representativa resultat
Figur 1. Jästen polyQ modell. A) Schematisk representation av den toxiska polyQ-expansionen proteinet. b) Fluorescensmikroskopi visar jästceller som uttrycker en kort, icke-toxisk polyQexpansionen protein (25Q, vänster fält) och jäst-celler som uttrycker en lång, toxiskt polyQ-expansionen proteinet (103Q, högra panelen).
Figur 2. Representativa resultat av tillväxt analyser av jästceller som uttrycker polyQ expansion proteiner. a) strykning av analysen. Cirka 700 jästceller spreds på plattor och inkuberades under tre dagar vid 30 ° C. Det övre fältet visar en platta innehållande glukos-medium, dvs expressionen av den toxiska polyQ-expansionen proteinet (103Q) inte induceras. Det nedre fältet visar en jäst-platta innehållande galaktos mediet, dvs expressionen av den toxiska polyQ-expansionen proteinet induceras. Notera att i det experiment som visas här, förekom ingen spontan suppressorn. B) spotting-analysen. Fem seriella fem-faldiga utspädningar av jästceller som hyser antingen en icke-toxisk polyQ protein (25Q) eller en toxisk polyQ-expansionen protein (103Q) sattes i fläckar på glukos-plattor som undertrycker uttrycket av proteinerna (vänstra panelen) eller på galaktos-plattor som inducerar deras uttryck. Plattorna inkuberades sedan under tre dagar vid 30 ° C. c) BioscreenC experimentet. Tillväxten av kulturer av jästceller som uttrycker antingen ett icke-toxiskt polyQ protein (25Q) eller en toxisk polyQ-expansionen proteinet (103Q) övervakades genom BioscreenC instrumentet. De experimentella betingelserna och analysen av de BioscreenC experiment beskrivs i huvudtexten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver tre kompletterande experimentella metoder för att mäta polyQ-toxicitet i modellen organismen jästen baserat på minskad tillväxt av jästceller som uttrycker giftiga polyQ expansion proteiner. Arbetet i jäst har erbjudit djupa insikter om de grundläggande cellulära och molekylära mekanismer av protein felveckning och dess påföljande toxicitet, inklusive felveckning och toxicitet polyQ expansion proteiner 9,11,12. Experiment bygger på de protokoll som presenteras här har redan bidragit till att identifiera och karakterisera genetiska förstärkare eller dämpare av polyQ toxicitet, små modifierare molekyler av polyQ toxicitet och cellulära mekanismer som ligger till grund polyQ toxicitet 5-8,13,14.
De presenterade protokoll kan lätt anpassas för att undersöka andra modifierare av polyQ toxicitet såsom olika tillväxtbetingelser eller genetiska mutationer som antingen minskar eller förvärra polyQ toxicitet. Vidare presenteras experimentella protokolletkan lätt justeras för att testa toxiciteten hos andra toxiska felveckade proteiner i jäst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet i Duennwald laboratoriet stöds med bidrag från den amerikanska Federation for Aging Research (FJÄRRAN), den ärftliga sjukdomen Foundation (HDF) och William Wood Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frogger (6x8 pins) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100-well Honeycomb plates | Growth Curves USA | 9602550 |
References
- Soto, C., Estrada, L. D. Protein misfolding and neurodegeneration. Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).
- Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).
- Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. Glutamine repeats and neurodegeneration. Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).
- Meriin, A. B. Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains. FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).
- Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).
- Duennwald, M. L., Lindquist, S. Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity. Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).
- Meriin, A. B. Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells. J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).
- Gitler, A. D. Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease. Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Giorgini, F., Muchowski, P. J. Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast. Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).
- Ehrnhoefer, D. E. Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models. Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).
