Summary
Здесь мы опишем метод непосредственно визуализировать микрорегиональном тканевой гипоксии у мышей коры
Abstract
Способность мозга функционировать на высоком уровне метаболических спрос зависит от того, непрерывную подачу кислорода через кровоток и диффузии кислорода в тканях. Здесь мы представляем визуализировать экспериментальной и методической протокол непосредственно визуализировать микрорегиональном гипоксии тканей и вывести периваскулярных градиента кислорода в коре мыши. Он основан на нелинейных отношений между никотинамидадениндинуклеотида (NADH) эндогенные интенсивности флуоресценции и парциальное давление кислорода в ткани, где наблюдается ткани NADH флуоресценции резко возрастает в ткани кислорода ниже 10 мм рт.ст. 1. Мы используем двухфотонного возбуждения при 740 нм, что позволяет одновременное возбуждение собственных тканей NADH флуоресценции и плазме крови контрастирует с Техасе Красной декстран. Преимущества этого метода по сравнению с существующими подходами, включают следующее: он использует внутренний сигнал ткани и может быть выполнена с использованием стандартных двухфотонного в естественных условиях имстарением оборудования, она позволяет непрерывный мониторинг во всем поле зрения с глубиной разрешением ~ 50 мкм. Мы показали, что ткани мозга областях удаленных от кровеносных сосудов мозга соответствуют уязвимых водосборных бассейнов, которые первыми становятся функционально гипоксического после снижения сосудистого снабжения кислородом. Этот метод позволяет изображение микрорегиональном коры кислородом и, следовательно, полезны для изучения роли неадекватной или ограниченного питания тканей кислородом, в нервно-сосудистых заболеваний и инсульта.
Protocol
1. Подготовка животных для работы с изображениями
Примечание: Мы используем взрослый C57BL мышей. Различные трансгенных линий могут быть использованы в зависимости от исследования вопроса. Микрососудистой хирургии и пульсоксиметрии облегчается у мышей с белым мехом (например, FVB деформации).
- Подготовьте место операции на скамейке. Все хирургические инструменты должны быть в автоклаве или дезинфекция с 70% этанола.
- Вставьте ректального датчика, и постоянно измерять температуру тела животного на протяжении всей процедуры
- Анестезию мыши, используя первоначально 5% ИФ. В 15-30 х годов, когда животное не двигается, положите его на грелку (37 ° C), и примените маску для непрерывной доставки воздуха, содержащего 1,3-1,5% ИФ). Убедитесь в том, что животное не реагирует на болевой раздражитель (например, хвост щепотку).
- Использование искусственной слезы гель для покрытия глаза мыши, с целью предотвращения воздействия сухого воздуха.
- Использование электрической бритвой, удалить волосы FПЗУ головы и обеих бедер. Применяют для удаления волос (например, Nair) на бедре в течение 2 минут, а затем протрите ее тщательно, чтобы удалить оставшиеся волосы. Это бедра будут использованы для оксиметрии.
- Лечить головы с использованием 10% повидон-йод раствор и 70% этанола.
2. Подготовка открытого черепа черепных окно
- Начиная 5 мм каудально по отношению к черепу, надрезать кожу головы с помощью ножниц, и двигаться вперед ни на сантиметр. Перемещение кожи по бокам, чтобы выставить череп.
- Для удаления оболочки в верхней части черепа применяется 10% раствор хлорида железа в верхней части черепа. Протрите излишки раствора и очистить от оболочки с углом 45 ° # 5 пинцетом. Важно, чтобы подготовить площадку тщательно, с тем чтобы обеспечить, что глава пластина может быть надежно прикреплены к черепу (шаг № 4 до 6).
- Используя микроскоп вскрытия, определить сферу интересов. Обратите внимание, что черепных швов следует избегать, поскольку череп сперерыв непредсказуемо в этом направлении.
- Нанесите тонкий слой быстрого клея (например, Locktite 454) по краям окна головой пластины (рис. 1). Установите пластину в голову таким образом, что область интересов выставляется в окно. Слегка надавите на голову тарелку. Нанесите небольшое количество зубной цемент для полимеризации клея быстро. Задержитесь на 10 секунд, в то время полимеризации клея.
- Нанесите небольшое количество клея, быстрое по краям окна, чтобы запечатать пластины головы и черепа. Винт головы пластину животного владельцу при вскрытии области.
- С помощью сверла Microtorque II установлен в 6000 оборотов в минуту и IRF 005 сверло, удалить все лишние клей из черепа и от головы пластинку. Оставшийся клей на голове пластина должна быть удалена, так как в противном случае вмешиваться в крепление стеклянной крышкой.
- Установите сверло на 1000 оборотов в минуту, и начать бурение черепа, сделав круг в окне пластины головы, диаметр ~ 5 мм. Используйте легкие размашистыми движениями, как будто вы рисуете с очень мягким карандашом. Стоп бурения каждые 20-30 секунд, чтобы удалить пыль кости с помощью сжатого воздуха.
Примечание: Форма отверстия в голове пластина позволяет дополнительно доступ к сверло (для левой и правой рукой хирург), которая облегчает создание круговой черепной окна. Кроме того, два необычной формы отверстий, обеспечивают необходимое пространство для вставки Кларк электрода или стекло-электрод в ткани головного мозга под черепной окно дополнительных полярографических или электрофизиологических измерений. - Как бурения прогрессирует, норы формируется вокруг неповрежденной череп в центре. Будьте осторожны, чтобы не протыкать разбавленной череп, но сделать это нора одинаковой толщины. Будьте осторожны вокруг крупных кровеносных сосудов, они не должны быть скомпрометированы, и, если возможно, даже не коснулся.
- Используйте одну "ногу" пинцета # 3 поднимать ("смахнуть") кости в центре окна. Нанесите каплю artificIAL спинномозговой жидкости (aCSF) на окне.
- Протрите aCSF мягко использованием углу мягкой бумагой (например, Kimwipe). Обычно длительность поврежден в одном или нескольких местах по всему краю окна. Начиная с одного из этих сайтов, слегка приподнимите и снимите оболочку с поверхности мозга, используя под углом 45 ° пинцет № 5. При выборе сайта, с которого начинается удаление оболочки, избегать районов, прилегающих к крупных кровеносных сосудов. Если кровотечение происходит, применять капли aCSF и ждать в течение 2-3 мин при незначительных кровотечений остановить.
- Подготовить 0,07% легкоплавких агарозном растворяется в aCSF) Принесите расплавленный агарозном до температуры тела. Вытрите превышение aCSF от поверхности мозга. Вылейте агарозы в окно, и накрыть стекло. Нажмите на стекло аккуратно, чтобы контакт между стеклом и глава пластины, и ждать 10-20 секунд, пока агароза является твердым телом.
- Удалите излишки агарозы из стеклянной крышкой с помощью пинцета и мягкой бумажной салфеткой.
- Нанесите небольшоеКоличество быстрого клея вокруг стекла приклеить стекло на голову тарелку. Нанесите небольшое количество зубной цемент закрепить клеем (рис. 1).
3. Внутривенное введение и мониторинг оксигенации крови
Примечание: Мы обычно используются в бедренную вену для внутривенного применения Техас красный, а не в хвостовую вену. Это потому, что бедренная вена инъекции обеспечения безопасной и воспроизводимой болюсного введения красителя.
- Поверните животных частично чрезмерно, чтобы выставить внутри левого бедра. Используйте ленту, чтобы обеспечить животным в этом положении.
- Применяют как антисептическое скраб, а затем 100% этилового спирта на кожу.
- Сделайте надрез вдоль медиального бедро от колена до лобкового симфиза. Отдельные мягкие ткани от тупой диссекции пинцетом № 5.
- Заполнить 1 мл шприц с 130 мкл Texas Red (2,5 мг / мл). Присоединить новую иглу (избыточное давление 30), и согните ее внимательно на 30 °, сохраняя наклон вверх. Заполните иглы шм Texas Red решение.
- При вскрытии микроскоп, вставить иглу в бедренную вену и вводят 100 мкл Texas Red. Удалите иглу и слегка нажмите вены марлей, чтобы остановить кровотечение.
- Закройте кожу с помощью 4-0 шва.
- Для постоянного мониторинга крови SpO 2 (для обеспечения адекватной оксигенации крови) разместить оксиметр зонд на правое бедро (от которого волосы были предварительно удалены).
4. Двухфотонного изображения
Примечание: Мы используем Olympus Fluoview1000 многофотонной системы визуализации (вертикально) с Spectra-Physics Maitai HP DeepSee фемтосекундного Ti: Sa лазера источник возбуждения. Для обработки изображений, мы используем × 10 NA 0.45 (Zeiss C-Apochromat) или × 25 NA 1.05 (Olympus XLPlan N) воды погружения целей. Мы принимаем изображения на 12-битовую глубину с разрешением 512 × 512 пикселей с пиксель время задержки 2 мкс. NADH и Техас-красно-декстран которые одновременно возбуждение при 740 нм, и фторфлуоресценции отделяется от возбуждающего света помощью дихроичных зеркала / ближнем ИК-фильтр блокировки комбинации (FF665-DI01, FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, США) разделены на два канала помощью дихроичных зеркала (505DCXRU, Chroma , Rockingham, Вермонт, США) и полосовой фильтр (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Мощность лазера измерялась после того, как цель была 10-20 МВт для работы с изображениями в слое Я и 20-50 МВт для работы с изображениями в слое II.
- Передача хирургическим подготовленные мыши столик микроскопа. Возьмем начальное картина черепа сайт окна с помощью яркого освещения поля 4x увеличение для использования в качестве ссылки для регистрации карты с более высоким увеличением двухфотонного ангиографии.
- Увеличить на площади интерес использование × 10 увеличением. Выберите область интересов в корковых слоях я или II (до 150 мкм ниже пиальных поверхности). Если большем увеличении желательно, использовать × 25 целей
- Начало записи временных рядов (Фигуповторно 2). Мы рекомендуем использовать в среднем 3-5 кадров для повышения качества изображения.
- Вызвать гипоксемии путем добавления 50% N2 в воздухе, что животное дышит. Это приведет к O2 уровне до 10%. Убедитесь, гипоксемии, контролируя оксиметр данных.
- Продолжайте записывать временные ряды по гипоксемии (например, в течение 30 секунд), и после нормального уровня О2 восстанавливается.
- Сбор данных для расчета распределения кислорода путем выявления, измерения и количественного области гипоксии и кислородом тканей цилиндров вокруг кровеносных сосудов.
5. Обработка данных
- Определите Крог ткань цилиндр радиуса R. Это можно сделать вручную (рис. 3), измеряя расстояние между центром кровеносных сосудов и граница, на которой флуоресценции NADH обнаружено.
- Кроме того, использование вычислительной следователь независимо полуавтоматического определения тканевого цилиндра радиусом R и центрального Блоод судно т, что было описано ранее 1 дополнительный форме и представлены в разделе обсуждения этого протокола.
- Определите область гипоксия с использованием открытого доступа образ программного обеспечения для анализа, например, ImageJ. Для этого используйте NADH сигнал, определить порог, который очерчивает высокой интенсивности NADH области, а затем измерить площадь с повышенной флуоресценции NADH ткани.
6. Представитель Результаты
Рисунок 2 показывает видео NADH / ангиографии изображения во время переходного гипоксемии (в формате PDF версия этой рис, отобранных фотографий были использованы). Вдыхаемой концентрации кислорода был снижен с 21% до 10% в течение 3 мин. Этот уровень экспериментально индуцированной гипоксемии достаточно, чтобы вызвать тяжелой гипоксии в коре головного мозга. Гипоксия ведет к увеличению флуоресценции NADH, первоначально в областях, которые были далеки от артериального кровоснабжения. Обратите внимание на резкое ткани NADHГраницы, которые представляют собой наблюдаемые границы ткани диффузии кислорода из коры микроциркуляцию. Изображение на рисунке 3 показана геометрия диффузии кислорода границы окружающих сосудов головного мозга. Это можно вывести Крог цилиндр диаметром от этих границ, как описано выше 1.
Рисунок 1. (A) мышь с черепной окно подготовлены для работы с изображениями. (B) Размеры головы пластинку.
Рисунок 2. Эндогенные NADH зеленая флуоресценция визуализированы с двухфотонного изображения через черепной окно, около 50 мкм ниже пиальных поверхности. Кровеносные сосуды визуализируются с Texas Red декстран. Кислорода во вдыхаемом воздухе снижается до 10% в течение 3 мин, а затем восстановлен на 21%. Шкала бар: 50 мкм.
<IMG ALT = "3" SRC = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" />
Рисунок 3. Геометрия NADH флуоресценции границ. Желтый схеме показаны границы функциональной гипоксии, синие круги показывают прогнозам кислородом (Крог) цилиндров. Синие линии показывают цилиндр радиусом, цифры показывают, радиусов микрометров.
Discussion
Высокое пространственное разрешение информация о диффузии кислорода важно для понимания того, как поток крови в мозг регулируется обеспечить кислородом клеток мозга, и для удовлетворения метаболических спроса. Традиционные полярографического измерения кислорода с помощью Кларк стиль стеклянные электроды обладают высокой инвазивной и имеют низкое пространственное разрешение 2-3 и значительным (второй круг), время отклика. До сих пор единственным неинвазивным методом измерения рО 2 в тканях головного мозга является тушение фосфоресценции, где скорость распада возбужденного зонда пропорциональна концентрации кислорода 4. Этот метод обеспечивает точные концентрации кислорода, но требует собственного красителей и технически сложных фосфоресценции системы визуализации жизни. Здесь мы показываем, простой, простой подход, который может быть проведено на стандартном двухфотонного визуализации системы с двумя flurescence каналов. Наш подход использует внутренний сигнал ткани 5м требуется только контрастной визуализации коры микроциркуляцию. Из-за нелинейной, по сути двоичный увеличение NADH флуоресценции на функционально предельной концентрации кислорода 1, увеличился внутренний NADH флуоресценции наблюдается только в районах со значительным, метаболически ограничивающий гипоксии. Важным следствием является то, что ткань границы диффузии кислорода из коры микрососудов непосредственно наблюдаемые цилиндрической формы интенсивность изменения эндогенной флуоресценции NADH. Мы называем эти структуры в виде цилиндров Крог, потому что понятие цилиндрические структуры, которые определяют объем кислородом ткани, окружающие кровеносные сосуды был введен Август Крог и недавно была экспериментально наблюдаемые с помощью двухфотонного NADH изображений 1. Крог цилиндров изображения могут быть собраны в 3D с Z-Stack кадров изображения. Это особенно заметно в окрестностях проникающих артериол и они конгруэнтны остроумиеч капилляр обедненного periarteriolar тканевых цилиндров 1,4.
Для обеспечения объективного определения ткани Крог цилиндр радиусом R (см. раздел 5.2), мы измерили их радиальных значений интенсивности пикселей в пределах четко определенных сегментов между центром цилиндра и внешней границы с помощью функции Matlab "improfile". Внешняя граница сегмента должна быть выбрана расширить с запасом за пределы видимой границы. Для улучшения отношения сигнал-шум уровне мы averageed над всеми радиальными линиями, необходимых для покрытия видимый сегмент цилиндра с шагом 1 °. В результате средний радиальный профиль интенсивности в сегменте выставляются резкое увеличение которого соответствовала видимой границы R ткани. Мы соответствуем сигмоидального функции (например, функции Больцмана) для усредненного радиального профиля интенсивности и использовать ее точка перегиба (также известный как х 0), определение R. Соответствующие два рhoton microangiography (Техас-красный) показал сечения одиночных центральных сосудов в центре цилиндра. Диаметр центрального кровеносного сосуда могут быть непосредственно применены для определения р.
Двухфотонного NADH изображения обеспечивает те же пространственным разрешением одновременных изображений с высоким разрешением корковой microangiography. Важной особенностью для количественного применения этого метода является то, что с 50 NADH флуоресценции увеличение было измерено, 3,4 ± 0,6 мм рт 1, а интенсивность флуоресценции NADH в зависимости от ткани микрорегиональном рО 2 может быть математически описана сигмоидального функции. . Мы показываем, что этот метод позволяет выявить области мозга, которые являются наиболее уязвимыми к гипоксии (за счет уменьшения содержания кислорода в воздухе до 10%). Мы также показали, что диффузия кислорода следующим простым геометрическим рисунком периваскулярных.
Один критческих шагом для этого метода является качество подготовки черепной окна. Операция должна производить минимальные повреждения, чтобы не нарушать кровоток в пораженном участке. Беспокоит то, что в хирургически под угрозу подготовку, коры под окном может быть гипоксической Начнем с того, исключающих любые значимые эксперименты. Хорошо подготовленные черепной окно должно иметь нетронутой крупных и мелких сосудов с яркими кровотока во всех типов судов и никаких существенных кровотечений по краям. Под гипоксическим условиям (PaO2 80-100 мм рт.ст., Sp O2 97-99%) паренхимы мозга должны обладать равномерным, однородным флуоресценции NADH без заметных, ярких пятен ткани с повышенной флуоресценции NADH.
Фундаментальные физические ограничения нашего подхода ограничена глубиной проникновения. Сине-зеленый NADH флуоресценции в мозг быстро ослабляется поглощения гемоглобина и тканей рассеяния на этих длинах волн. Даже при высокой числовой апертурой (например, 1.05) водыпогружение целей двухфотонного NADH изображений в настоящее время ограничивается корковых слоев я и II. Это ограничение научно значение, поскольку энергетический обмен или в непосредственной близости от белого вещества, вероятно, отличается от серого вещества. Тем не менее, исследование глубоких корковых структур, таких как слои IV-VI и подкорковых структур, таких как трактов белого вещества или стриатума потребует использования специальных микролинз, как описано в мышь коры в естественных условиях 6.
NADH на основе измерения границы диффузии кислорода может быть особенно полезна в сочетании с другими измерениями, такие как анализ функциональной гиперемии и обнаружения капиллярной ставки потока 7. Например, этот метод может быть адаптирован для визуализации гипоксии инсульта и болезни Альцгеймера (AD) модели. Простая геометрия диффузии кислорода позволяет прогнозировать кислорода градиент микрососудистых кровати в условиях, когда плотность капилляров де-увеличился 8 (например, в 9 г. н.э.), а также изучить вопрос о мозговой ткани регионов с пониженной плотности капилляров находятся в группе повышенного риска гипоксии повреждения в результате microstrokes. Возможность изображение microregionally также позволяет изучить геометрию и размер тканей microstrokes и определения объема тканей, в которых происходит гипоксия, а также отношения между тканевой гипоксии и последующей гибели нейронов или капиллярной реконструкции 10.
Наконец, так как увеличение эндогенной флуоресценции NADH являются прямым следствием острого митохондриальная дисфункция, этот метод создает возможность использовать NADH изображений в качестве конкретного корреспондента нейронных энергетического метаболизма 11 и прокси-сервер для митохондриальная дисфункция.
В заключение двухфотонного изображения эндогенной флуоресценции NADH является простой, нетребовательный инструмент, который может быть использован, чтобы понять доставки и потребления кислорода в мозге, как при нормальных,и патологических состояний.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Maiken Nedergaard (Университет Рочестера медицинский центр) для проектирования пластины голову. Работа была поддержана награды NIH для SD (R01DA026325 и P30AI078498 и грантов фонда выделяется KK (DANA основу мозга и Immunoimaging программы Американской ассоциации сердца 0635595T и ассоциации БАС [# 1112)]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | |||
| Cement | Stoelting Co. | 51456 | |
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
| Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
- Kasischke, K. A. Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).
- Ndubuizu, O., LaManna, J. C.
- Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).
- Sakadzic, S. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).
- Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy. J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).
- Brown, W. R., Thore, C. R. Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).
- de la Torre, J. C. Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease. Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).
- Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).
- Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. The oxygen dependence of cellular energy metabolism. Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).
