Summary
Här beskriver vi en metod att direkt visualisera microregional vävnadshypoxi i mus cortex
Abstract
Hjärnans förmåga att fungera vid höga nivåer av metaboliska efterfrågan styrs av kontinuerlig syretillförsel genom blodflödet och vävnad syre diffusion. Här presenterar vi en visualiserad experimentell och metodologiska protokollet direkt visualisera microregional vävnadshypoxi och sluta perivaskulära syre gradienter i musen cortex. Den är baserad på den icke-linjära förhållandet mellan nikotinamidadenindinukleotid (NADH) endogen fluorescensintensitet och syrepartialtryck i vävnaden, där observerades vävnad NADH fluorescens abrupt ökar till nivåer vävnadssyrespänningama under 10 mmHg 1. Vi använder tvåfotonexcitering till 740 nm, vilket möjliggör samtidig excitation av inneboende NADH vävnader fluorescens och blodplasma kontrast med Texas-Red dextran. Fördelarna med denna metod jämfört med befintliga metoder inkluderar följande: det tar fördel av en inneboende vävnad signal och kan utföras med användning av standard två-foton-in vivo-imåldrande utrustning, den tillåter kontinuerlig övervakning i hela synfältet med ett djup upplösning på ~ 50 nm. Vi visar att hjärnvävnad områden längst från cerebrala blodkärl motsvarar känsliga avrinningsområden som är den första att bli funktionellt hypoxisk efter en nedgång i vaskulär syretillförsel. Denna metod gör att man kan bilden microregional kortikal syresättning och är därför användbart för att undersöka rollen av otillräcklig eller begränsade vävnad syretillförsel i neurovaskulära sjukdomar och stroke.
Protocol
1. Förbereda djuret för avbildning
Obs: Vi använder vuxna C57BL möss. Olika transgena stammar kan användas beroende på frågeställningen. Mikrovaskulära operationer och pulsoximetri underlättas i möss med vit päls (t.ex. FVB stam).
- Förbered operationsområdet på bänken. Alla kirurgiska instrument måste autoklaveras eller desinficeras med 70% etanol.
- Sätt en rektal sond, och att kontinuerligt mäta djurets kroppstemperatur under hela förfarandet
- Bedöva musen med början 5% isofluran. I 15-30 s, när djuret inte rör sig, placera den på en värmedyna (37 ° C), och tillämpa en ansiktsmask för kontinuerlig tillförsel av luft som innehåller 1,3-1,5% isofluran). Se till att djuret inte svarar på en smärta stimulus (t.ex. svansen nypa).
- Använd artificiella tår gel för att täcka musens ögon, för att förhindra exponering för torr luft.
- Med en elektrisk rakapparat, ta bort hår from huvudet och från båda låren. Applicera hår remover (t.ex. Nair) till låret i 2 minuter och sedan torka den försiktigt att ta bort kvarvarande hår. Detta låret kommer att användas för oximetry.
- Desinficera hårbotten med användning av en 10% povidon-jodlösning och 70% etanol.
2. Förbereda öppna skallen kraniala fönster
- Starta 5 mm kaudalt om skallen, gör ett snitt i hårbotten med sax, och avancera en centimeter. Flytta hud mot sidorna för att exponera skallen.
- För att ta bort membranen på toppen av skallen gäller 10% järnkloridlösning till toppen av skallen. Torka bort överflödig lösning, och skrapa membranen bort med 45 ° vinkel # 5 pincett. Det är viktigt att förbereda platsen noggrant, för att säkerställa att huvudplattan säkert kan fästas till skallen (steg # 4 till 6).
- Användning av ett dissektionsmikroskop, identifiera det område av intresse. Observera att kraniala suturerna bör undvikas eftersom skallen cett break oförutsägbart längs dessa linjer.
- Applicera ett tunt lager med snabb lim (t.ex. Locktite 454) runt kanterna på fönstret i huvudet plattan (figur 1). Placera huvudet plattan på ett sådant sätt att området av intresse exponeras i fönstret. Applicera ett lätt tryck på huvudet plattan. Använda en liten mängd av dentalcement att polymerisera limmet snabbt. Håll i 10 sekunder medan limmet polymeriserande.
- Använda en liten mängd av snabb lim till kanterna av fönstret för att täta huvudplattan och skallen. Skruva huvudet plattan djuret hållare under dissektion omfattning.
- Använda Microtorque II borren inställd på 6000 rpm och en IRF 005 borr, ta bort allt extra lim från skallen och från huvudet plattan. Eventuell kvarvarande lim på huvudet plåten bör tas bort, eftersom det annars störa infästning av glaset locket.
- Inställd borren vid 1000 rpm, och börja borrning skallen genom en cirkel i huvudet plattan fönstret diametern ~ 5 mmeter. Använd ljus svepande rörelser som om du ritar med en mycket mjuk blyertspenna. Sluta borra var 20-30 sekunder för att avlägsna benet damm med tryckluft.
Obs: Formen av öppningen i huvudet plattan ger ytterligare tillgång till borren (för vänster-och högerhänta kirurg), vilket gör det enklare att skapa en cirkulär kranial fönster. Dessutom är de två udda formade hål åstadkomma den erforderliga utrymmet för att infoga en Clark-elektrod eller glas-elektrod i hjärnvävnaden under kraniala fönster för ytterligare polarografiska eller elektrofysiologiska mätningar. - Såsom borrning fortskrider, är en håla bildas runt skallbenet i mitten. Var noga med att inte sticka igenom tunnas skallen, men att göra detta gräva med jämn tjocklek. Var extra försiktig runt stora blodkärl, de bör inte äventyras och om möjligt, inte ens rört.
- Använda ett "ben" av pincett # 3 för att lyfta ("skaka av") benet i mitten av fönstret. Applicera en droppe artificIAL cerebrospinalvätska (aCSF) på fönstret.
- Torka aCSF försiktigt med en hörn av mjuk vävnad papper (t.ex. Kimwipe). Vanligtvis dura skadas i en eller flera platser runt kanten på fönstret. Börjar på en av dessa platser försiktigt lyfta och ta sedan bort dura från hjärnan ytan, med 45 ° vinkel pincett # 5. När du väljer den plats där för att börja ta bort dura, undvika de områden som gränsar till stora blodkärl. Om blödningen inträffar tillämpa en droppe aCSF och vänta i 2-3 minuter för mindre blödningen att sluta.
- Förbered 0,07% lågsmältande agaros upplöst i aCSF) Ta den smälta agarosen till kroppstemperatur. Avtorka överskott av aCSF från hjärnans yta. Häll agaros i fönstret, och täck med en glasskiva. Tryck på glaset försiktigt för att skapa kontakt mellan glaset och huvudplattan, och vänta 10-20 sek tills agarosen är fast ämne.
- Ta bort överflödigt agaros från glaset locket med pincetter och mjukdelar papper.
- Sätt en litenMängden av snabb lim runt glaset att limma glaset till huvudplattan. Använda en liten mängd av dentalcement att stelna limmet (figur 1).
3. Intravenös injektion och blodets syresättning övervakning
Observera: Vi rutinmässigt används den femorala venen för intravenös applicering av Texas-rött stället svansvenen. Detta beror på att lårbensvenen injektioner tillhandahålla säkra och reproducerbara bolusinjektioner av färgämnet.
- Vända djuret delvis över för att exponera insidan av det vänstra låret. Använd tejp för att fästa djuret i detta läge.
- Tillämpas antiseptisk skrubb och sedan 100% etanol till huden.
- Gör ett snitt längs mediala låret från knäet till blygdbenssammanfogningen. Separata mjukdelar genom trubbig dissektion med pincett # 5.
- Fylla 1 ml spruta med 130 | il av Texas Red (2,5 mg / ml). Sätt på en ny nål (gauge 30), och böj den försiktigt vid 30 °, hålla avfasningen uppåt. Fyll nålen with Texas Red-lösning.
- Under ett dissektionsmikroskop sätter nålen i lårbensvenen och injicera 100 pl Texas Red. Ta bort nålen och lätt tryck på venen med gasväv för att stoppa blödning.
- Stäng huden med 4-0 sutur.
- För kontinuerlig övervakning av blod SpO 2 (för att säkerställa tillräcklig blodets syresättning) placera pulsoximeter-givare på höger lår (som håret tidigare avlägsnats).
4. Tvåfotons avbildning
Observera: Vi använder en Olympus Fluoview1000 multiphoton avbildningssystem (upprätt) med en Spectra-Physics Maitai HP DeepSee femtosekund Ti: Sa laser som en exciteringskälla. För avbildning, använder vi x 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), eller x 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) vatten-immersion mål. Vi tar bilder med 12-bitars färgdjup och en upplösning på 512 × 512 pixlar med en pixel uppehållstid på 2 is. NADH och Texas-Red-dextran samtidigt exciteras vid 740 nm och fluorescence separeras från excitationsljus med användning av en dikroisk spegel / nära-IR-blockeringsfilter kombination (FF665-Di01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA) uppdelad i två kanaler med användning av en dikroisk spegel (505DCXRU, kulörthet , Rockingham, VT, USA) och bandpassfiltreras (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Lasereffekten mätt efter målet var 10-20 mW för avbildning i lager I och 20-50 mW för avbildning i lager II.
- Överföra den kirurgiskt beredda musen till mikroskopets objektbord. Ta en första bild av hjärn fönstret webbplats med hjälp av ljusa fältet belysning vid 4x förstoring för att använda som en referens karta för registrering med högre förstoring tvåfotons angiografier.
- Zooma in på området av intresse att använda × 10 förstoring. Välja ett område av intresse i kortikala skikt I eller II (upp till 150 pm under pial yta). Om större förstoring önskas, använd × 25 mål
- Ny rapport tidsserien (FIGUre 2). Vi rekommenderar att du använder i genomsnitt 3-5 ramar för att öka kvaliteten på bilden.
- Inducerar hypoxemi genom att tillsätta 50% N2 i luften att djuret andas. Detta kommer att föra O2-nivån till 10%. Verifiera hypoxemi genom övervakning oximeter-data.
- Fortsätt att registrera den tid serie genom hypoxemi (till exempel för 30 sekunder), och efter normal O2-nivån har återställts.
- Samla in data för beräkning av det syre distributionen genom att upptäcka, mäta och kvantifiera området hypoxi och syresatt vävnad rullar runt blodkärlen.
5. Databehandling
- Bestäm Krogh vävnaden R. cylinderradie Detta kan göras manuellt (Figur 3) genom att mäta avståndet mellan centrum av blodkärl och gränsen där höga NADH fluorescens detekteras.
- Alternativt kan du använda beräkningsmässiga utredaren oberoende semi-automatisk bestämning av vävnaden cylindern radien R och centrala BLOod fartyg r som har beskrivits tidigare 1 i kompletterande form och sammanfattas i diskussionen i detta protokoll.
- Bestäm arean för hypoxi med öppet tillträde program bildanalys, t ex ImageJ. För att göra detta använder NADH signal, definierar en tröskel som beskriver de höga NADH intensitet område, och sedan mäta området med förhöjda NADH vävnad fluorescens.
6. Representativa resultat
Figur 2 visar en video av NADH / angiografi bilder under transient hypoxemi (för PDF-versionen av denna figur, har valt stillbilder använts). Den inandad syrekoncentration sänktes från 21% till 10% under en period av 3 minuter. Denna nivå av experimentellt inducerad hypoxemi är tillräcklig för att orsaka svår hypoxi i hjärnbarken. Hypoxi ledde till en ökning av NADH fluorescens, först i de områden som var längst bort från det arteriella blodförsörjning. Notera den kraftiga NADH vävnadengränser, som utgör observerbara vävnad gränser syre diffusion från den kortikala mikrocirkulationen. Bilden i Figur 3 visar geometrin hos gränser syrediffusion omgivande cerebrala kärl. Det är möjligt att härleda Krogh cylinderdiametrar från dessa gränser, såsom beskrivits tidigare 1.
Figur 1. (A) Mus med kraniell fönster förberedd för avbildning. (B) Dimensioner för huvudet plattan.
Figur 2. Endogen NADH grön fluorescens visualiseras med två-photon avbildning genom kraniell fönster, cirka 50 m under pial ytan. Blodkärl visualiseras med Texas Red dextran. Syrgas i inandningsluften sänktes till 10% för 3 min, och sedan återställas för 21%. Skala bar: 50 pm.
<img alt = "Bild 3" src = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" />
Figur 3. Geometri för NADH fluorescens gränser. Gul konturen visar gränsen funktionell hypoxi, blå cirklarna visar projiceras syresatt (Krogh) cylindrar. Blå linjerna visar cylindern radier, siffrorna visar radier i mikrometer.
Discussion
Hög spatial upplösning information om syrediffusion är viktigt att förstå hur blodflödet i hjärnan regleras för att tillhandahålla syre till hjärnceller, och för att möta det metaboliska behovet. Traditionella polarografiska syre mätningar med hjälp av Clark-stil glas elektroder är mycket invasiva och har låg rumslig upplösning 2-3 och signifikant (andra området) svarstid. Hittills den enda icke-invasiv metod för att mäta pO 2 i hjärnans vävnad är fosforescens kylning, där graden av förfall den exciterade sonden är proportionell mot syrekoncentrationen 4. Denna metod ger noggranna syrehalter, men kräver en egen färg och en tekniskt sofistikerad fosforescens livslängd bildsystem. Här visar vi en enkel, enklare tillvägagångssätt som kan utföras på en standard två-foton-avbildningssystem med två flurescence kanaler. Vår strategi drar nytta av en inneboende vävnad signal 5 ennd kräver endast kontrasterande visualisering av den kortikala mikrocirkulationen. På grund av den icke-linjära, väsentligen binära ökning av NADH fluorescens vid funktionellt att begränsa syrehalter 1 ökade inneboende NADH fluorescens observeras endast i områden med betydande metaboliskt begränsa hypoxi. En viktig implikation är att vävnad gränser syre diffusion från kortikala mikrokärl direkt observera cylindriskt formade intensitet förändringar av endogen NADH fluorescens. Vi hänvisar till dessa strukturer som Krogh cylindrar, eftersom begreppet cylindriskt formade strukturer som definierar syresatta volymen av vävnaden som omger ett blodkärl introducerades av August Krogh och har nyligen experimentellt observerats med hjälp av två-photon NADH avbildning 1. Krogh cylindrar bilder kan samlas i 3D genom att ta ett z-bunt med bildrutor. De är särskilt framträdande i närheten av penetrerande arterioler och de är kongruent with kapillär utarmade periarteriolära vävnad cylindrar 1,4.
Att ge en objektiv bestämning av Krogh vävnaden cylindern radie R (se avsnitt 5,2) mätte vi deras radiella pixelintensitetsvärden inom en väldefinierad segmentet mellan centrum av cylindern och den yttre gränsen med hjälp av Matlab-funktionen "improfile". Den yttre gränsen av det segment bör väljas för att sträcka sig med en säkerhetsmarginal bortom synlig gräns. För att förbättra signal-brus-nivå vi averageed över alla radiella linjer behövs för att täcka den synliga cylindern segmentet vid 1 ° steg. Den resulterande genomsnittliga radiell intensitet profil inom segmentet uppvisade en kraftig ökning som motsvarade den synliga vävnaden gränsen R. Det vi passar en sigmoidal funktion (t.ex. Boltzmann funktion) för att den genomsnittliga radiell intensitet profil och använde sin brytpunkt (även känd som x 0) som en definition av R. Motsvarande två-photon microangiography (Texas-rött) avslöjade tvärsnitt av en ensam central blodkärl i centrum av cylindern. Diametern hos den centrala blodkärlet kan direkt tillämpas för att bestämma r.
Två-foton NADH avbildning ger samma rumsliga upplösning som samtidigt högupplösta avbildning av den kortikala microangiography. Ett viktigt särdrag för den kvantitativa tillämpning av denna metod är att p 50 av NADH fluorescensökning har uppmätts till att vara av 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 och att den NADH fluorescensintensiteten som en funktion av microregional vävnad pOa 2 kan matematiskt beskrivas med en sigmoidal funktion. . Vi visar att denna teknik tillåter en att identifiera områden i hjärnan som är mest utsatta för hypoxi (genom att minska syrehalten i luften till 10%). Vi visar också att syre diffusion följer en enkel geometrisk perivaskulära mönster.
En kritical steg för denna metod är kvaliteten hos den kraniala fönstret beredningen. Operationen bör ge minimal skada för att inte störa blodflödet till det utsatta området. Ett problem är att i ett kirurgiskt äventyras beredning kan cortex under fönstret är hypoxisk att börja med, vilket utesluter några meningsfulla experiment. En väl förberedd kraniell fönster bör ha intakta större och mindre blodkärl med levande blodflödet i alla typer av fartyg och ingen signifikant blödning längs kanterna. Under normoxiska förhållanden (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) i hjärnparenkymet bör uppvisa en enhetlig, homogen NADH fluorescens utan iögonfallande, ljusa vävnad fläckar med förhöjd NADH fluorescens.
En grundläggande fysisk begränsning av vår strategi är begränsat djup penetration. Den blå-gröna NADH fluorescens i hjärnan snabbt dämpas av hemoglobin absorption och vävnaden spridning vid dessa våglängder. Även med hög numerisk apertur (t.ex. 1,05) vattennedsänkning mål två-photon NADH avbildning är för närvarande begränsad till kortikal lager I och II. Denna begränsning är vetenskapligt relevant eftersom energiomsättningen i eller i närheten av vit substans kommer sannolikt skiljer sig från grå. Skulle dock undersökningen av djupa kortikala strukturer såsom lager IV-VI eller subkortikala strukturer såsom vita substans skrifter eller striatum kräver användning av specialiserade mikrolinser som beskrivs i musen cortex in vivo 6.
NADH-baserad mätning av gränser syrediffusion kan vara särskilt användbar när den kombineras med andra mätningar såsom analys av funktionell hyperemi, och detektion av kapillära omloppshastigheter 7. Till exempel kan denna teknik vara anpassad för att visualisera hypoxi i stroke och Alzheimers sjukdom (AD) modeller. Den enkla geometrin av syre diffusion gör att man kan förutse syret gradienten i mikrovaskulära sängar under sådana omständigheter där kapillärtäthet är deökade 8 (t.ex. AD 9) och att undersöka om hjärnvävnad regioner med nedsatt kapillär densitet är en ökad risk för hypoxi skador på grund av microstrokes. Förmågan att bilden microregionally också tillåter en att undersöka geometri och storlek för vävnad microstrokes och bestämma volymen av vävnad i vilken hypoxi uppträder, liksom förhållandet mellan vävnadshypoxi och efterföljande neuronal död eller kapillär remodellering 10.
Slutligen, eftersom ökningar i endogent NADH fluorescens är en direkt följd av akut mitokondriell dysfunktion skapar denna metod möjlighet att använda NADH avbildning som en specifik reporter för neural energiomsättning 11 och en proxy för mitokondriell dysfunktion.
Sammanfattningsvis är två-foton avbildning av endogen NADH fluorescens ett enkelt, kravlös verktyg som kan användas för att förstå syretillförsel och konsumtion i hjärnan både under normalaoch patologiska tillstånd.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) för huvudet plåten design. Arbetet har stötts av NIH utmärkelser till SD (R01DA026325 och P30AI078498 och stiftelsens bidrag till KK (DANA stiftelsen Hjärna och Immunoimaging program, American Heart Association 0635595T och ALS Association [# 1112)]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | |||
| Cement | Stoelting Co. | 51456 | |
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
| Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
- Kasischke, K. A. Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).
- Ndubuizu, O., LaManna, J. C.
- Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).
- Sakadzic, S. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).
- Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy. J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).
- Brown, W. R., Thore, C. R. Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).
- de la Torre, J. C. Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease. Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).
- Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).
- Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. The oxygen dependence of cellular energy metabolism. Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).
