Summary
在这里，我们描述了一个方法，直接可视化在小鼠皮层microregional组织缺氧
Abstract
大脑的正常代谢需求的高层次的能力，取决于血流量和组织氧扩散通过连续供氧。在这里，我们提出了一个可视化的实验和方法的协议，直接可视化microregional组织缺氧，并推断在小鼠大脑皮层血管周围的氧气梯度。它是基于非烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的内源性荧光强度和氧在组织中，在那里观 察组织NADH的荧光突然增加组织的氧含量低于10毫米汞柱1分压之间的线性关系。在740 nm处NADH的内在组织与得克萨斯州红葡聚糖的荧光和对比血浆的同时激发允许我们使用双光子激发。这种方法比现有方法的优点包括以下内容：需要一种内在的组织信号的优势，可以在体内 IM使用标准的双光子设备老化，它允许在整场〜50微米的深度分辨率的连续监测。我们表明，脑组织，脑血管最远对应脆弱集水区，这是第一次成为功能缺氧后血管供氧下降。这种方法允许一个图像microregional皮质氧合，因此，用于检查神经血管疾病和中风的氧气供应不足或限制组织的作用。
Protocol
1。准备成像动物
注：我们用成人的C57BL小鼠。可以使用不同的转基因株系，根据所研究的问题。微血管手术和脉搏血氧饱和度，促进小鼠白色毛皮（例如的FVB株）。
- 准备手术部位在替补席上。所有的手术器械需要进行高压灭菌，或用70％乙醇消毒。
- 插入直肠探头，整个过程持续测量动物的体温
- 使用最初5％的异氟醚麻醉鼠标。在15-30秒，当动物不动，将加热垫（37℃），适用于连续的空气含有1.3-1.5％的异氟醚）交付了口罩。确保该动物没有响应疼痛刺激（如尾捏）。
- 使用人工泪液凝胶覆盖老鼠的眼睛，以防止暴露在干燥的空气。
- 使用电动剃须刀，除毛fROM的头从两侧大腿。适用于头发卸妆（例如奈尔）2分钟的大腿，然后仔细擦拭以去除剩余的头发。这大腿，将用于血氧饱和度。
- 使用10％碘伏溶液和70％乙醇消毒头皮。
2。准备开放性颅骨颅窗
- 从5毫米，尾端的头骨，使切口在头皮用剪刀，前进一厘米。双方将皮肤暴露颅骨。
- 头骨的顶部，以消除膜适用10％的铁的头骨顶部的氯化物溶液。擦去多余的解决方案，并与45°角＃5镊子刮膜外。重要的是仔细准备网站，以确保头盘可以牢固地连接到头骨（步骤＃4至6）。
- 使用解剖显微镜，找出感兴趣的领域。请注意，应避免颅缝，因为头骨ç打破难以预测沿着这些路线。
- 应用窗口（图1）头板的边缘周围的快速胶水薄薄的一层（如Locktite 454）。在这样一个感兴趣的领域，在窗口公开的方式头板的位置。适用于光压头板。适用于少量的牙科水泥迅速聚合胶水。保持10秒，而胶聚合。
- 快速胶水的少量应用到窗口封头板和头骨边缘。拧头板下的清扫范围内的动物持有人。
- 使用微扭矩II在6000转和IRF的005钻头钻，从头骨和头板中删除所有多余的胶水。任何剩余的胶头板应去掉，因为它会以其他方式干扰玻璃盖的附件。
- 演习将在1000 rpm，并开始头骨，头板“窗口内的一个圆圈，直径3〜5米钻米。使用轻抺，如果你是一个很软的铅笔画。停钻，每20-30秒，去除骨的灰尘，使用压缩空气。
注：在头板开幕的形状，使钻头（左手和右手的外科医生），这使得它更容易地创建一个圆形的颅骨窗口额外的访问。此外，两个奇形孔极谱或电额外测量颅窗口下的Clark电极或玻璃电极插入脑组织提供必要的空间。 - 钻井过程中，洞穴是在中心周围形成完整的头骨。小心捅通过减薄头骨，但厚度均匀，使这个洞穴。要额外的小心周围的船只，他们不应该受到影响，如果可能的话，没有碰到大血。
- 使用镊子＃3“腿”，解除骨（“轻弹关闭”）在中心的窗口。套用下降artificIAL脑脊液（ACSF）窗口。
- 轻轻用软纸巾的角落（如Kimwipe）擦拭学联。一般硬脑膜被损坏，在一个或多个窗口的边缘周围的地方。在这些网站开始，轻轻抬起，然后取出脑表面硬脑膜，用45°角镊子＃5。当选择网站开始清除硬脑膜，避免大血管的毗邻地区。如果发生出血，应用学联下降，等待2-3分钟轻微出血停止。
- 准备0.07％低熔点在学联溶解的琼脂糖）使体温融化的琼脂糖。从大脑的表面擦去学联过剩。琼脂糖倒在窗口，并盖上载玻片。轻轻按下玻璃，使玻璃和头板之间的接触，并等待10-20秒，直到琼脂糖是坚实的。
- 使用镊子和软纸巾从玻璃盖，取出多余的琼脂糖。
- 把一个小金额快速周围的玻璃胶头板玻璃胶。适用于少量的牙科水泥固化胶（图1）。
3。静脉注射和血氧监测
注：我们经常使用的得克萨斯红静脉应用，而不是尾静脉，股静脉。这是因为，股静脉注射提供安全和可再生丸注射染料。
- 转动部分过度暴露的左大腿内侧的动物。使用磁带，以确保动物在这个位置上。
- 应用防腐剂擦洗，然后100％乙醇肌肤。
- 做一个切口，沿大腿内侧从膝盖到耻骨。 ＃5使用镊子钝性分离的独立的软组织。
- 填写1ml注射器130μL得克萨斯红（2.5毫克/毫升）。将新针（表30），并仔细弯曲30°，保持斜角。填补针无线网络日得克萨斯红的解决方案。
- 解剖显微镜下，股静脉插入针头，并注入100μL德州红。取出针，并用纱布轻轻按下静脉止血。
- 使用4-0缝合关闭皮肤。
- 对于连续监测血SPO 2（以确保足够的血氧），血氧饱和度探头放在右大腿上（头发从以前删除）。
4。双光子成像
注：我们使用一个奥林巴斯Fluoview1000多光子成像系统（直立）1光谱物理茅台酒的惠普DeepSee飞秒钛：萨激光作为激发源。成像，我们用×10无0.45（蔡司C - 复消色差透镜），或×25无1.05（奥林巴斯XLPlan N）的水浸泡目标。我们需要在12位深度的图像分辨率为512×512像素一个像素停留时间为2μs。 NADH和得克萨斯州红-葡聚糖同时在740 nm的兴奋，和氟的escence使用分色镜/近红外阻塞过滤器组合（FF665-DI01从激发光分离; FF01-680/SP，Semrock，罗切斯特，纽约，美国）分为两个渠道使用分色镜（505DCXRU，色度罗金厄姆，VT，美国），带通滤波（NADH的Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36的）。后的客观测量激光功率为10-20毫瓦成像在Ⅰ层和第二层成像20-50兆瓦。
- 显微镜阶段转移的手术准备的鼠标。采取的颅窗网站的4倍放大倍率在使用亮场照明用高倍率的双光子造影作为登记的参考图的初始图片。
- 放大面积×10倍率的利益。选择感兴趣的领域，在皮质层I或II（可达150微米以下的软膜表面）。如果需要更高的放大倍率，使用×25目标
- 开始记录的时间序列（Figu重2）。我们推荐使用平均3-5帧，以提高图像质量。
- 加入50％的氮气，动物呼吸的空气，引起低氧血症。这将带来10％的氧气水平。通过监测血氧饱和度数据的验证低氧血症。
- 继续记录的时间序列，并通过低氧血症（例如，30秒）后恢复正常氧气水平。
- 收集区缺氧和周围血管的含氧组织气瓶检测，测量和量化计算的氧分布的数据。
5。数据处理
- 确定克罗组织缸半径为R，这是可以做到手动测量中心血管和高NADH的荧光检测的边界之间的距离（图3）。
- 另外，使用的独立调查组织汽缸半径R计算半自动化的决心和中央BLOOD船只ŕ已先前所述补充形式，并在本议定书的讨论部分总结。
- 确定使用开放获取的图像分析软件，如ImageJ的缺氧区。要做到这一点，使用NADH的信号，定义描绘NADH的高烈度区的阈值，然后升高NADH组织荧光测量面积。
6。代表结果
图2显示了NADH /血管造影图像的视频，在短暂的低氧血症（此图的PDF版本，已选定静像）。吸入氧浓度从21％降低到10％，3分钟内。这个实验引起的低氧血症程度是足以引起严重缺氧，在大脑皮层。缺氧导致NADH的荧光增加，最初在动脉供血最远的地区。注意尖锐的NADH的组织边界，这代表观察组织的界限，从皮质微循环的氧气扩散。在图3中的图像显示脑血管周围的氧气扩散边界的几何形状。这是可能的推断克罗缸直径从这些界限，先前描述1。
图1（A）与成像准备颅窗口鼠标。 （二）头板的尺寸。
图2。内源性辅酶绿色荧光可视化双光子成像，通过颅窗脑膜表面，大约50微米以下。血管是与得克萨斯州红葡聚糖的可视化。吸入空气中的氧气减少到10％，为3分钟，然后恢复为21％。比例尺为50μm。
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图3。NADH的荧光边界几何。黄河大纲显示功能缺氧的边界;蓝色圆圈显示预计含氧（克罗）气瓶。蓝线显示汽缸半径;数字显示半径在微米。
Discussion
有关氧气扩散的高空间分辨率信息，重要的是了解如何在大脑的血流量调节脑细胞提供氧气，以满足代谢的需求。传统克拉克式玻璃电极的极谱氧测量高度侵袭性和空间分辨率低2-3和范围显着（第二）的响应时间。到目前为止，唯一的非侵入性方法测量脑组织中的PO 2燐光猝灭，激发探头的衰减率是成正比的氧气浓度4。这种方法提供了精确的氧气浓度，但需要一个专用的染料和技术上先进的磷光寿命成像系统。在这里，我们展示了一个简单的，简单的方法，可以在一个标准的双光子成像系统进行有两个flurescence通道。我们的方法需要一种内在的组织信号5的优势第二只需要对比的皮质微循环的可视化。由于非线性，基本上二进制增加NADH的荧光，在功能限制氧气浓度1，增加内在NADH的荧光观察，仅在显着，新陈代谢限制缺氧地区。一个重要的含义是，从皮质微血管的氧气扩散的组织界限，直接由圆柱形的内源性NADH的荧光强度的变化观察。我们是指这些结构作为克罗缸，因为定义周围血管组织的含氧体积的圆柱状结构的概念是由八月克罗最近已经利用双光子成像1 NADH的实验观察。克罗气瓶的图像可以被收集在3D一帧图像的Z-Stack。他们穿透动脉附近尤其突出，他们符合机智Ĥ毛细血管耗尽periarteriolar组织气瓶1,4。
提供克罗组织缸半径为R的客观测定（见5.2节），我们之间的气缸中心和外部边界使用MATLAB函数“improfile”定义段内测量其径向像素强度值。段外边界应选择延长与超越有形的边界的安全保证金。为了提高信号的噪音水平，我们averageed需要支付1°气缸可见段所有径向线。段内产生的平均径向强度分布呈现急剧增加，这相当于有形的组织边界 r。我们适合sigmoidal函数（如波兹曼函数）的平均径向强度分布，并用其拐点（又称X 0）为R 的定义。对应的两个-P华庭时尚商务microangiography（得克萨斯红）揭示了一个孤独的气缸中心的中央血管的横截面。中央血管的直径，可直接应用于确定ŕ。
并发高分辨率成像的皮质microangiography的双光子NADH的成像提供相同的空间分辨率。这种方法的定量化应用的一个重要特点是，磷的NADH荧光增加50已测得的3.4±0.6毫米汞柱和PO 2 microregional组织功能的NADH荧光强度可以用数学描述sigmoidal函数。 。我们表明，这种技术允许一个确定大脑缺氧（空气中的氧气含量降低10％）是最脆弱的地区。我们还表明，氧气扩散如下一个简单的几何血管周围模式。
一击ICAL此方法的步骤是颅窗口准备的质量。手术应产生最小的损伤，为了不惊动血流暴露面积。一个值得关注的是，在手术妥协的准备，窗下的皮层可能是缺氧开始，排除任何有意义的实验。一个精心准备的颅窗，应该有完整的主要和次要的血管，在所有船种生动的血流量和沿边缘没有明显的出血。常氧条件下（氧分压80-100毫米汞柱，SP氧气97-99％），脑实质表现不突出，明亮的组织补丁NADH的荧光升高均匀，均匀NADH的荧光。
我们的方法的一个基本的物理约束是有限的穿透深度。在脑的蓝绿色NADH的荧光是由血红蛋白在这些波长的吸收和散射组织迅速衰减。即使是用高数值孔径（如1.05）的水浸泡目标双光子NADH的成像目前仅限于皮质层I和II。这种限制是科学，因为能源或邻近白质的代谢有关，可能会不同于灰质。然而，如层IV-VI或皮层下结构，如白质束或纹状体深皮层结构的调查，将需要使用专门的微透镜在小鼠皮层体内6。
NADH基于氧气的扩散边界的测量与分析功能充血，毛细血管通量率检测7，如其他测量相结合时，特别有用。例如，这种技术可适应缺氧，在中风和阿尔茨海默氏病（AD）模型可视化。氧气扩散的简单的几何形状允许一个预测的情况下，毛细血管密度是氧气在微血管床梯度8折痕（例如，公元9），并检查是否与脑组织毛细血管密度降低地区微振由于缺氧损伤的风险增加。图像的能力microregionally还允许一个研究组织微振的几何形状和大小，确定缺氧发生在该组织的体积，以及之间的关系，组织缺氧和随后的神经元死亡或毛细管重塑10。
最后，由于增加内源性NADH的荧光急性线粒体功能障碍的直接后果，这种方法创造了机会，利用NADH的成像作为一个特定的神经能量代谢和线粒体功能障碍的代理记者。
总之，内源性NADH的荧光双光子成像是一种简单，要求不高的工具，可以用来了解在正常的大脑中的氧气输送和消费在病理状态。
Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
我们感谢头板设计博士，Nedergaard Maiken（罗切斯特大学医学中心）。这项工作已经由NIH奖项支持SD（R01DA026325和P30AI078498和基金会的资助KK（德纳基础脑和Immunoimaging计划，美国心脏协会0635595T和ALS协会[＃1112）]）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | |||
| Cement | Stoelting Co. | 51456 | |
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
| Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
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