Summary
Это протокол, чтобы изолировать активных полный кинезин длиной от
Abstract
Мотор белков транспортировки грузов вдоль микротрубочек, и транспортировать их к конкретным субклеточном местах. Из-за измененного транспорта предлагается лежат в основе различных нейродегенеративных заболеваний, понимание основано микротрубочек автомобильного транспорта и его регулирования, вероятно, в конечном итоге приведет к улучшению терапевтических подходов. Кинезин-1 эукариотических белков двигатель, который движется в антероградная (плюс-концу) направлении вдоль микротрубочек (МТ), питание от гидролиза АТФ. Здесь мы приводим подробный протокол очистки, чтобы изолировать активных полный кинезин длиной от эмбрионов дрозофилы, что позволило сочетание генетики дрозофилы с одной молекулой биофизических исследований. Начиная с примерно 50 прокладки чашки, с примерно 1000 женщин в чашке, мы провели ночь коллекций. Это дало примерно 10 мл упакованы эмбрионов. Эмбрионы были отбеливатель dechorionated (дающим около 9 граммов эмбрионы), а затем гомогенизации. Мтер нарушения, гомогенат уточнил помощью низкой скорости вращения следует высокоскоростного центрифугирования. Уточнить супернатант обрабатывают GTP и таксола к полимеризации МТС. Кинезин был обездвижен на полимеризованный МЦ добавлением АТФ аналоговый, 5'-аденилил imidodiphosphate при комнатной температуре. После кинезин обязательным, микротрубочки были осаждали с помощью высокоскоростного центрифугирования через сахарозы подушке. Микротрубочек осадок затем снова приостановлен, и этот процесс повторяется. Наконец, СПС была добавлена, чтобы освободить кинезин от МТС. Высокая скорость центрифугирования затем остановлен МТС, оставляя кинезин в супернатант. Это кинезин была подвергнута центробежной фильтрации с использованием 100 KD отсечения фильтр для дополнительной очистки, аликвоты, оснастки замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 ° C. SDS гель-электрофореза и западных промокательной проводили с использованием очищенного образца. Двигательной активности очищенных образцов до и после окончательного центробежные шаг фильтрацииоценивалась в пробирке один анализ микротрубочек молекулы. Кинезин фракции до и после фильтрации центробежная показал процессивность как сообщалось ранее в литературе. Дальнейшие эксперименты ведутся для оценки взаимодействия между кинезин и других, связанных с транспортом белков.
Protocol
Штаммы мухи могут быть приобретены и усиливается в лаборатории. В зависимости от объема флакона Drosophila культуры получил один нужно часто "перевернуть" культура флаконов, ампул раз достигла максимальной мощности. Усиление продолжается примерно до 50 флаконов Drosophila культуры заполнены. Одно то делает "летать стаканы" с 100 мл треуголка стаканов (Fly чашку решений рассматривается в следующем разделе). После 24 часов, использовать эмбрионы из этих чашек с семенами новых флаконах Drosophila культуры прикреплены лету пищу на дне. При комнатной температуре, времени роста для эмбрионов Drosophila овернайт эмбрионов взрослого мухи около 8,5 дней. Сеяные эмбрионы вылупляются через 12-15 часов в первые личинки. Личинки растут в течение 4 дней линьки два раза во второй и третьей стадии личинки, на 24 и 48 часов после вылупления. Личинки то инкапсулировать в pupariums и представить в 4-й день до метаморфоза выходящих из тНаследник куколки случаях 1. Разрешить для большего роста в течение двух-трех дней в ампулах Drosophila культуры, чтобы увеличить количество мух в каждой. Когда 400 ампул заполнены, будет достаточное количество мух в течение пятидесяти откладки яиц чашки (около 1000 женских мухи на чашку). Мухи нужно время, чтобы приспособиться к новой обстановке. Обычно это занимает около двух дней, чтобы они были готовы к сбору, после передачи кубков. Замена агаром ежедневно будет держать лету стакана чистой, которые позволяют мух, живут дольше. (Для более полного понимания Drosophila помощи и усиления, пожалуйста, обратитесь к Drosophila DB Робертс: практический подход 2).
Хорошим источником для получения большого количества эмбрионов дрозофилы являются население клетки 3, которые имеются в продаже. Монтаж и обслуживание населения клетках можно увидеть на главы 5 и 7 в книге DROSOPHILA MELANOGASTER: Practical Применение в клеточной и молекулярной биологии 4. Тем не менее, население клетки являются дорогостоящими и трудно поддерживать. Так как население клетки могут содержать избыточным количеством мух, использование углекислого газа необходимо для передачи и кормление мух. Как было сказано выше, двуокись углерода уменьшает здоровье мух, заставляя их не лежал, а также. В небольших масштабах, 100 мл треуголка стаканы могут быть использованы. С пятьюдесятью 100 мл стакана, 9 граммов dechorionated эмбрионов может быть достигнута. Для удаления мертвых мух, неиспользованные дрожжи пасты и других примесей, мы создали двухслойной зрелище сито с различными размерами сетки. Один сито ловушки нежелательных материалов, таких как мертвые мухи, позволяя эмбрионов, чтобы пройти через (350 микрон размером пор). Вторая часть содержит сеткой (120 мкм, размер пор), которая предназначена для поймать Drosophila эмбрионов и других примесей, будет проходить через сетку.
1. Лети Подготовка Кубок и эмбрионов
- Флипусиленный мух из нескольких флаконов в пустой флакон пластик, пока количество мух достигли одного дюйма высотой флакон в. Затем перенесите эти мухи в 100 мл сбора яиц чашки (Tricon стакан с нейлоновой сеткой окна). Держите нажав чашкой на твердой поверхности, чтобы предотвратить побег мухи при передаче мух. Крышка чашки с агаром пластины, содержащие дрожжи пасты и позволяет 24-48 часов стабилизации времени.
- Соберите всю ночь пластин агара из пятидесяти чашек муха и промойте содержимое пластины сито зрелище, используя чистую кисть и проточной водой. Плоть эмбрионов в сито с большим количеством воды, пока все дрожжи паста смывается.
- Dechorionate очищенный эмбрионов путем погружения их в 50% отбеливателя в течение 3 мин.
- Промойте дистиллированной водой до широко эмбрионов свободно отбеливатель запах. Затем высушите сетку с эмбрионами, разместив его на переменный ток раз полотенце несколько раз. Трансфер эмбрионов на чистую пробирку и запишите вес. </ LI>
2. Гомогенизация эмбрионов и разъяснения
- Поместите dechorionated эмбрионов в Dounce гомогенизатор с 1,5 х объем ледяной буфером для экстракции.
- У 5 ударов со свободным пестиком. Алиготе гомогената в чистые пробирки. Центрифуга на 15 000 г в течение 40 мин. при 4 ° C.
- Осторожно собрать ясно надосадочную жидкость без верхней белой липидный слой и нижний шарик.
- Передача супернатанта центрифуги для очистки труб и центрифуги в 50 000 г в течение 30 мин. при 4 ° C
- В результате высокой скорости супернатант собраны как описано выше, можно использовать сразу или может быть оснастки замораживали и хранили при -80 ° C в течение нескольких месяцев.
3. Полимеризации микротрубочек и кинезин связывания
- Таяние замороженный высокоскоростной супернатант до комнатной температуры. Для полимеризации микротрубочек, добавить GTP (0,3 мм) и таксол (20 мкм) и перемешивать осторожно при комнатной температуре в течение 20 минут ввращающейся шейкер.
- Для привязки кинезин, добавить 2,5 мМ АТФ негидролизуемого аналоговых 5'-аденилил imidodiphosphate (AMPPNP), затем 10 мин агитации при комнатной температуре во вращающейся шейкер.
4. Дифференциальная седиментации микротрубочек и кинезин
- Осадка через равные подушке сахарозы объем (20% сахарозы и 10 мкМ таксола добычи буфера) путем центрифугирования при 23000 г (sw41ti ротора, TLS-55) в течение 30 мин. при 4 ° C.
- Мыть пули в суспензии в 10% от оригинального гомогената объем добычи буфера, содержащего 10 мкМ таксола и 75 мМ NaCl.
- Повторите с другой осаждения равных подушке сахарозы объеме, как в пункте 4.1.
- Повторно приостанавливать гранул от соли мыть в 5% добычи буфера с 20 мкМ таксол, 75 мМ NaCl, 10 мМ MgSO 4 и 10 мМ АТР.
- Отложения на 120 000 г (sw41ti ротора: 31,000 оборотов в минуту, TLS-55: 42,000 оборотов в минуту) в течение 20 мин при 4 ° C. Соберите супернатант (кинезинфракция).
- Выполните центробежные фильтрации при 14000 г в течение 15 мин при 4 ° C. Восстановление концентрированной выборки и фильтрации повторить с новым фильтром, как указано выше в течение 30 минут и собирают концентрированного образца.
- Выполнить анализ белка, чтобы определить концентрацию. Короче говоря, различные концентрации известных белков (бычий сывороточный альбумин, BSA) смешивают с известным объемом реагента Брэдфорд и измеряли оптическую плотность при длине волны 595nm. Тогда оптическая плотность по сравнению с кривой концентрация стандарт был установлен для расчета неизвестной концентрации очищенной кинезин фракция помощью оптической плотности этого образца измеряется в тех же условиях, что и стандартные образцы BSA. Гель-электрофорез, а также западных промокательной также осуществляется с помощью известного количества очищенных кинезин.
- Алиготе кинезин доли в небольших объемах необходимой концентрации и оснастки замораживание жидким азотом для хранения при температуре -80 ° C.
Полный функционал длины кинезин очищали от эмбрионов дрозофилы. На рисунке 1 изображен серебряный гель окрашенных с указанием различных фракций во время очистки. Полоса 1 является образцом высокой скорости супернатант после осветления (шаг 2.5), переулок 2 образца осадок после разъяснений, переулок 3 образца супернатант после первого осаждения с сахарозой подушке (шаг 4.1), полоса 4 является образцом осадок после первого осаждения, переулок 5, образец супернатанта после второго осаждения (шаг 4.3), переулок 6 образцов гранул после второго осаждения, переулок 7 образец шарик окончательное осаждение (шаг 4.5), переулок 8 очищенных кинезин образца, переулок 9 фильтруется кинезин образца, а полоса 10 маркера. Концентрированный группы в полосе 8 и 9 на около 115 кДа является кинезин тяжелых цепей 1, что согласуется с Figurе-1, переулок 8 бумаги Сакстон опубликован в 1988 году 5. Рисунок 2 представляет собой пятно в западной фракции очищенного кинезин, обнаруженных с применением кинезин тяжелой цепи антитела. Антитела AKINO1-существенно не перекрестно реагируют с другими членами семьи кинезин 6. Отметим, что хотя этот протокол результатов в хороший источник функциональных кинезин, в то время как фракция обогащена для кинезин-1, то, скорее всего загрязняющих веществ, в том числе, возможно, других кинезины и других моторных белков. Мы сняли ряд более мелких загрязнений путем фильтрации. Что касается удаления других двигателей, которая не может быть сделано по размеру только очистка похожа на то, что было сделано другими для изучения кинезин 7, и мы считаем, что большинство активных двигатель кинезин-1, но более сложные очистки позволит Устранение потенциальных загрязнений двигателя, как это было сделано по Коул и др. 8 и Сакстон и др. 9. Процессивность кинезина была оценена в пробирке одну молекулу микротрубочек связывания, как это описано более подробно в книге Scholey озаглавленный "Подвижность Анализ механических Белки" 10. Короче говоря, полистирола с одним активным двигателем были введены в связи с микротрубочек, при наличии насыщения (1 мм) АТФ. Двигателя прикреплены к микротрубочек, и пошел прочь от центра лазерной ловушкой. В предопределенных перемещения шарика из ловушки центр (100 нм) мощность лазерного луча автоматически отключается, позволяя двигателю ходить по МТ без нагрузки. В фильме показано 500 нм в диаметре шарик с одной кинезин шел тонн. Длина экран соответствует 20 мкм. Рисунок 3 представляет измеренное распределение во длины для одного полнометражного Drosophila молекул кинезин, очищенный в соответствии с протоколом, представленные здесь. ExponentiАль соответствии с распределением обеспечивает средний runlength одного кинезин 1,55 ± 0,1 мкм и 1,28 ± 0,12 мкм фильтром и нефильтрованное образца соответственно.
Рисунок 1 серебряный окрашенный гель очищенных фракций. Образцы из каждой фракции были проведены в 10% гель. 10 мкг белка был загружен в каждом переулке. Полоса 1 является образцом высокой скорости супернатант после осветления (шаг 2.5), переулок 2 образца осадок после разъяснений, переулок 3 образца супернатант после первого осаждения с сахарозой подушке (шаг 4.1), полоса 4 является образцом осадок после первого осаждения, переулок 5, образец супернатанта после второго осаждения (шаг 4.3), переулок 6 образцов гранул после второго осаждения, переулок 7 образец шарик окончательное осаждение (шаг 4.5), переулок 8 очищенных кинезинобразца, переулок 9 фильтруется кинезин с использованием 100 кДа отсечки Amicon ультра 0,5 мл центробежный фильтр (Millipore, США). Синие стрелки указывают на количество белков, были снижены и красная стрелка указывает концентрация кинезин за счет центробежной шаг фильтрации, используемые в настоящем протоколе.
На рис. 2 очищенная фракция KHC уничтожены против анти-кинезин антител: Очищенный кинезин образец подвергался гель-электрофореза и уничтожены (в нитроцеллюлозные мембраны) от первичного антитела AKINO1-A (1:1000 в TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией Осел в анти-антитело (1:10000 в TBST) в течение часа при комнатной температуре. ECL (хемилюминесцентных) комплект был использован для обнаружения сигнала кинезин показано выше.
Рисунок 3. Drosophila полный кинезин длина: (A) и (Б) Runlength и скорости фильтрованной кинезин образца. (C) и (D) Runlength и скорость нефильтрованное образец кинезин.
Рисунок 4. Видео подвижности кинезин. Щелкните здесь для просмотра видео .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Говядина мозга является наиболее широко используется исходный материал очищают от 11 до полнометражных кинезин, хотя мышиного мозга была использована, а 12. Большой недостаток использования бычьего мозга в качестве источника кинезин является наличие свежего исходного материала: бойни, как правило, недоступны, и мозг должен быть очень свежим, чтобы получить активный кинезин. Кроме того, только мозги молодых коров являются эффективными. Наконец, генетические манипуляции коров в настоящее время не является жизнеспособным вариантом, так что только "дикого типа" белка могут быть изучены.
Мыши являются более доступными, но уборка мышиный мозг довольно трудно и отнимает много времени, как очистка может потребоваться более 50 мозги. Кроме того, поддержание мыши колонии может быть довольно дорогим.
В отличие от говядины или мышей источников, дрозофилы имеет ряд преимуществ. Во-первых, мухи могут быть легко выращенных в лабораторных условиях с минимальными капитала излежал, и, таким образом, легко доступны. Drosophila лежал плодовитый эмбрионов, которые легко собран как описано здесь. Поскольку геном дрозофилы можно манипулировать, как и многие мутантные мухи легко получить, как дикого типа и мутантных белков могут быть очищены, и в связи с комбинацией генетических манипуляций и короткий промежуток поколения, больше мутантов могут быть изолированы. Тем не менее, следует отметить, что из-за полной потери функции кинезин смертельна, и белка в эмбрионов осуществляется преимущественно материнских, это не возможно, чтобы очистить чистой мутантов кинезин, которые резко ухудшается. Тем не менее, можно очистить белок с гетерозиготной эмбрионов (род-Мут / +), и охарактеризовать функции смешанным населением, а затем, возможно, связаны такие изменения в функции фенотипов в животное.
Изменение или ухудшение транспортной видимому, лежат в основе многих нейродегенеративных заболеваний, однако, механистический связьмежду болезнью и изменение одной молекулы функцию (либо вследствие мутаций или измененной среде сигнализации) не ясна. Анализ очистки белков разработаны здесь, должны стать важным инструментом в достижении этого понимания, потому что одной молекулы тесты могут быть использованы для определения моторов функции. Благодаря сочетанию таких исследованиях в естественных характеристик фенотипов, и с помощью моделирования, что позволяет непосредственно определить взаимосвязь между изменением конкретных молекулярных свойств одного и развития болезни / прогрессии (как, например, увидеть связь между изменением одной молекулы функции динеина и нарушение нейронных транспорта, 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Отдельное спасибо Крис Нгай и Джейсон Del Rio за их поддержку и помощь в этом проекте. Эта работа была поддержана грантом RO1 GM070676 на СПГ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H.
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
