Summary
Dies ist ein Protokoll, um aktiv in voller Länge zu isolieren Kinesin aus
Abstract
Motorproteine bewegen Ladungen entlang von Mikrotubuli, und transportieren sie zu spezifischen subzellulären Orten. Aufgrund veränderter Transport wird vorgeschlagen, eine Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegen, verstehen Mikrotubuli beruht Kraftverkehrs und dessen Regulierung dürfte letztlich zu einer verbesserten therapeutischen Ansätzen führen. Kinesin-1 ist ein Motor eukaryotischen Protein, das in eine anterograde (Plus-Ende) entlang Mikrotubuli (MT), durch ATP-Hydrolyse bereitgestellt bewegt. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zur aktiven Reinigung voller Länge Kinesin von Drosophila-Embryonen zu isolieren, so dass die Kombination von Drosophila-Genetik mit Einzel-Molekül-biophysikalische Untersuchungen. Beginnend mit ca. 50 Tassen legen, mit etwa 1000 Frauen pro Tasse, haben wir über Nacht Sammlungen. Dies lieferte ungefähr 10 ml gepacktes Embryonen. Die Embryonen waren Bleichmittel dechorionated (was ungefähr 9 Gramm Embryonen), und dann homogenisiert. After Störungen, wurde das Homogenat geklärt mit einer langsam laufenden Spin durch eine Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation. Der geklärte Überstand wurde mit GTP und Taxol behandelt, um MTs zu polymerisieren. Kinesin wurde auf polymerisierten MTs mit indem die ATP-Analogon, 5'-Adenylat Imidodiphosphat bei Zimmertemperatur immobilisiert. Nach Kinesin bindend, wurden Mikrotubuli über Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation durch ein Saccharose-Kissen sedimentiert. Die Mikrotubuli Pellet wurde dann erneut suspendiert, und dieses Verfahren wurde wiederholt. Schließlich wurde hinzugefügt, um die ATP-Kinesin aus dem MTs freizugeben. Hochgeschwindigkeitszentrifugation dann abzentrifugiert der MTS, dem Verlassen des Kinesin im Überstand. Diese Kinesin einer zentrifugalen Filtration mit einem 100 KD-Sperrfilter für die weitere Reinigung unterzogen wurde, aliquotiert, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80 ° C SDS-Gelelektrophorese und Western Blotting wurde unter Verwendung des gereinigten Probe. Die motorische Aktivität der gereinigten Proben vor und nach dem letzten Schritt Zentrifugalfiltrationwurde unter Verwendung eines in vitro-Assay einzelnes Molekül Mikrotubuli. Die Kinesin Fraktionen vor und nach der Zentrifugalfiltration zeigten Prozessivität wie zuvor in der Literatur berichtet. Weitere Versuche sind im Gange, um die Interaktion zwischen Kinesin und anderen Verkehrsmitteln verwandten Proteinen zu evaluieren.
Protocol
Stämme von Fliegen können gekauft werden und verstärkt im Labor. Je nach der Menge von Drosophila Kultur Fläschchen erhalten, braucht man zu häufig "umkippen" die Kultur Fläschchen, Ampullen, sobald die maximale Kapazität erreicht hat. Die Verstärkung wird fortgesetzt, bis etwa 50 Drosophila Kultur Fläschchen gefüllt sind. Man macht dann "fliegen cups 'mit 100 ml Becher Dreispitz (Fly Cup Herstellung wird im nächsten Abschnitt). Nach 24 Stunden verwenden Embryonen aus diesen Bechern zu Saatgut neue Drosophila Kultur Fläschchen mit aufgeklebten Fliege Nahrung am Boden. Bei Raumtemperatur sind die Wachstumszeit für Drosophila-Embryonen aus Embryonen über Nacht zu ausgewachsenen Fliegen etwa 8,5 Tage. Seeded Embryonen schlüpfen nach 12-15 Stunden in die erste Larvenstadium. Die Larven für etwa 4 Tage Häutung zweimal in der zweiten und dritten Larvenstadium, 24 und 48 Stunden nach dem Schlüpfen wachsen. Die Larven dann in pupariums kapseln und als Beitrag für einen 4 Tage bis zur Metamorphose, die aus tErben Puppenstadium Fällen ein. Lassen Sie für mehr Wachstum für etwa zwei bis drei Tage in den Drosophila Kultur Fläschchen, um die Menge von Fliegen in jeder zu erhöhen. Wenn 400 Ampullen gefüllt sind, wird es eine ausreichende Menge von Fliegen für 50 Tassen Eiablage (etwa 1.000 weibliche Fliegen pro Tasse). Fliegen brauchen Zeit, um an ihre neue Umgebung anpassen. Normalerweise dauert es etwa zwei Tage für sie zur Abholung bereit, nachdem sie an den Cups übertragen. Ersetzen Agarplatten täglich halten die Fliege Tassen sauber, die es erlauben, Fliegen, länger zu leben. (Zum weiteren Verständnis von Drosophila Pflege und Verstärkung, siehe DB Roberts 'Drosophila: A Practical Approach 2).
Eine gute Quelle für große Mengen von Drosophila-Embryonen erhalten sind Bevölkerung Käfigen 3, die kommerziell erhältlich sind. Die Montage und Wartung der Bevölkerung Käfige können auf Kapitel 5 und 7 in dem Buch Drosophila Melanogaster gesehen werden: PRAKTISCHE Verwendungen in Zell-und Molekularbiologie 4. Allerdings sind Bevölkerung Käfige sind teuer und schwer zu pflegen. Da Bevölkerung Käfigen eine reichliche Menge von Fliegen halten kann, ist die Verwendung von Kohlendioxid, die für Überführungs und Zuführvorrichtung Fliegen. Wie bereits erwähnt, nimmt Kohlendioxid, die Gesundheit der Fliegen, wodurch sie nicht so gut lag. Im kleinen Maßstab kann 100 ml Dreispitz Becher verwendet werden. Mit 50 100 ml Becher, kann 9 Gramm dechorionated Embryonen erreicht werden. Damit entfernen Sie die toten Fliegen, ungebraucht Hefepaste und andere Verunreinigungen wir eine doppellagige Sieb Catcher mit verschiedenen Maschenweiten geschaffen haben. Ein Sieb fängt unerwünschte Stoffe wie tote Fliegen und ermöglicht Embryonen passieren (350 Mikron Porengröße). Der zweite Teil enthält ein Mesh (120 Mikron Porengröße), was bedeutete, zu Drosophila-Embryonen und andere Verunreinigungen fangen wird durch die Maschen passieren wird.
1. Fly Cup Vorbereitung und Embryo-Entnahme
- Flipdie verstärkten fliegt von mehreren Fläschchen in ein leeres Fläschchen aus Kunststoff, bis der Betrag von Fliegen haben ein Zoll von dem Fläschchen in der Höhe erreicht. Dann übertragen Sie diese Fliegen in einem 100 ml Becher Eiersammlung (Tricon-Becher mit Nylon-Mesh-Fenster). Klopfen Sie den Becher auf eine harte Oberfläche, an der Flucht zu verhindern, wenn die Übertragung Fliegen Fliegen. Becher mit Deckel Agarplatte Hefepaste und erlauben 24-48 Stunden Zeit für eine Stabilisierung.
- Sammeln Sie über Nacht Agarplatten von 50 fly Tassen und waschen Sie den Inhalt der Platten auf dem Sieb catcher mit einem sauberen Pinsel und fließendes Wasser. Flesh die Embryonen im Sieb mit Wasser abspülen, bis das gesamte Hefe Paste wird weggespült.
- Dechorionate die gereinigten Embryonen, die durch Eintauchen in 50% Bleichmittel für 3 min.
- Spülen Sie mit destilliertem Wasser ausgiebig bis Embryonen locker das Bleichmittel Geruch. Dann trocknen die Masche mit Embryonen, indem sie auf AC fach Handtuch mehrfach. Übertragen Sie die Embryonen auf eine saubere Flasche und das Gewicht aufgezeichnet. </ Li>
2. Embryo Homogenisierung und Klärung
- Platzieren Sie dechorionated Embryonen in Dounce Homogenisator mit 1,5 x Volumen eiskaltem Extraktionspuffer.
- Haben fünf Schläge mit dem losen Pistill. Aliquotieren das Homogenat in sauberes Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 15.000 g für 40 min. bei 4 ° C
- Sorgfältig sammeln klare Flüssigkeit ohne den oberen weißen Lipidschicht oder der unteren Pellet.
- Überstand in Zentrifugenröhrchen reinigen und zentrifugieren bei 50.000 g für 30 min. bei 4 ° C
- Resultierender High-Speed-Überstand gesammelt, wie oben erläutert kann sofort verwendet werden oder kann schockgefroren und bei -80 ° C für Monate.
3. Mikrotubulus-Polymerisation und Kinesin Binding
- Auftauen gefrorenen Breitband-Überstand auf Raumtemperatur. An Mikrotubuli polymerisieren, fügen GTP (0,3 mM) und Taxol (20 uM) und vorsichtig schütteln, bei Raumtemperatur für 20 min ineinem rotierenden Schüttler.
- Um Kinesin binden, fügen 2,5 mM nicht hydrolysierbaren ATP-Analogon 5'-Adenylat Imidodiphosphat (AMPPNP), durch eine 10 min Rühren bei Raumtemperatur in einem rotierenden Schüttler folgt.
4. Differenzielle Sedimentation von Mikrotubuli und Kinesin
- Sediment durch ein gleiches Volumen Saccharose-Kissen (20% Saccharose und 10 uM Taxol in Extraktionspuffer) durch Zentrifugation bei 23.000 g (sw41ti Rotor TLS-55) für 30 min. bei 4 ° C
- Waschen Pellet durch Resuspension in 10% der ursprünglichen Homogenats Volumen in Extraktionspuffer, enthaltend 10 uM Taxol und 75 mM NaCl.
- Wiederholen Sie die Sedimentation mit einem anderen gleichen Volumen Saccharose-Kissen wie in Schritt 4.1.
- Resuspendieren Pellet aus Salt Wash in 5% Extraktionspuffer mit 20 uM Taxol, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4 und 10 mM ATP.
- Sediment bei 120.000 g (sw41ti Rotor: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) für 20 Minuten bei 4 ° C Sammle Überstand (KinesinFraktion).
- Führen Sie eine zentrifugale Filtration bei 14.000 g für 15 min bei 4 ° C Wiederherstellen konzentrierten Probe und wiederholen Filtration durch einen neuen Filter, wie oben für 30 Minuten und der konzentrierten Probe zu sammeln.
- Führen Sie eine Protein-Assay, um die Konzentration zu bestimmen. Kurz gesagt, verschiedener Konzentrationen eines bekannten Protein; wurde (Rinderserumalbumin BSA) mit einem bekannten Volumen von Bradford-Reagenz gemischt und maß die optische Dichte bei 595 nm Wellenlänge. Dann eine optische Dichte gegen die Konzentration Standardkurve wurde gegründet, um die unbekannte Konzentration von gereinigtem Kinesin-Fraktion mit der optischen Dichte dieser Probe unter ähnlichen Bedingungen wie die der Standard-BSA-Proben gemessen berechnen. Gel-Elektrophorese sowie Western-Blot wurde auch unter Verwendung einer bekannten Menge des gereinigten Kinesin.
- Aliquot Kinesin-Fraktion in kleinen Mengen der gewünschten Konzentration und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff bei -80 ° C lagern
In voller Länge wurde aus funktionellen Kinesin Drosophila-Embryonen gereinigt. 1 zeigt die mit Silber gefärbten Gel, welche die verschiedenen Fraktionen während der Reinigung. Spur 1 ist ein Beispiel für die Hochgeschwindigkeits-Überstand nach Klärung (Schritt 2.5), Spur 2 eine Probe des Pellets nach Klärung, ist Bahn 3 eine Probe des Überstandes nach der ersten Sedimentation mit Saccharose-Kissen (Schritt 4.1), Spur 4 wird eine Probe von dem Pellet nach der ersten Sedimentation, Bahn 5 ist eine Probe des Überstandes nach der zweiten Sedimentation (Schritt 4.3), Spur 6 eine Probe des Pellets nach dem zweiten Sedimentation, Spur 7 ist eine Probe des Pellets von Die Nachklärbecken (Schritt 4.5), Spur 8 ist das gereinigte Kinesin Beispiel ist die Spur 9 filtriert Kinesin Probe und Spur 10 ist der Marker. Die konzentrierte Bande in Spur 8 und 9 auf rund 115 kD ist Kinesin Heavy Chain 1, die im Einklang mit Figur iste 1, Spur 8 des Saxton Papier 1988 5 veröffentlicht. 2 stellt die Western-Blot-c des gereinigten Kinesin-Fraktion unter Verwendung der schweren Kette Kinesin-Antikörper ist. Der Antikörper AKINO1-A nicht signifikant mit anderen Familienmitgliedern Kinesin 6 kreuzreagieren. Beachten Sie, dass, obwohl dieses Protokoll zu einer guten Quelle funktioneller Kinesin, während die Fraktion für Kinesin-1 angereichert ist, gibt es wahrscheinlich Verunreinigungen, einschließlich möglicherweise andere Kinesine und anderen motorischen Proteine. Wir entfernten eine Vielzahl von kleineren Verunreinigungen durch Filtration. Soweit das Entfernen anderer Motoren, die nicht die Größe allein gemacht werden kann, ist die Reinigung ähnlich dem, was von anderen getan werden, um Kinesin 7 studierst, und wir glauben, dass die Mehrheit der aktiven Motor Kinesin-1 ist, anspruchsvollere Reinigung ermöglichen würde Beseitigung potenzieller Motor Verunreinigungen, wie wurde von Cole et al 8 und Saxton et al. 9 Die Prozessivität der Kinesin wurde durch in vitro einzelnes Molekül Mikrotubuli Bindungstest, wie detaillierter in dem Buch von Scholey dem Titel "Motilität Assay für Motorproteine" 10 beschrieben ausgewertet. Kurz gesagt, wurden Polystyrol-Kügelchen mit einem einzigen aktiven Motors in Kontakt mit der Mikrotubuli gebracht wird, in Gegenwart von sättigenden (1 mm) ATP. Der Motor zum Mikrotubuli befestigt ist, und ging weg von der Mitte des Laserfalle. Auf einen vordefinierten Verschiebung des Wulstes von dem Trap-Zentrum (100 nm) die Laserstrahlleistung wurde automatisch ausgeschaltet, und der Motor entlang der MT im Leerlauf laufen. Der Film zeigt einen 500 nm Durchmesser Perle mit Einzel-Kinesin entlang MT. Die Länge des Video-Bildschirms entspricht 20 um. Abbildung 3 stellt die gemessene Verteilung der Lauflängen für Single in voller Länge Drosophila Kinesin-Moleküle, gereinigt nach dem Protokoll hier vorgestellten. Die exponential auf die Verteilung passen liefert die durchschnittliche Lauflänge der einzelnen Kinesin 1,55 ± 0,1 um und 1,28 ± 0,12 um für das gefilterte und ungefilterte Probe sind.
1 Silber angefärbten Gels der gereinigten Fraktionen. Proben von jeder Fraktion wurden in einem 10%-Gel durchgeführt. 10 ug Protein wurde in jede Spur geladen. Spur 1 ist ein Beispiel für die Hochgeschwindigkeits-Überstand nach Klärung (Schritt 2.5), Spur 2 eine Probe des Pellets nach Klärung, ist Bahn 3 eine Probe des Überstandes nach der ersten Sedimentation mit Saccharose-Kissen (Schritt 4.1), Spur 4 wird eine Probe von dem Pellet nach der ersten Sedimentation, Bahn 5 ist eine Probe des Überstandes nach der zweiten Sedimentation (Schritt 4.3), Spur 6 eine Probe des Pellets nach dem zweiten Sedimentation, Spur 7 ist eine Probe des Pellets von Die Nachklärbecken (Schritt 4.5), Spur 8 ist das gereinigte KinesinBeispiel ist die Spur 9 filtriert Kinesin unter Verwendung eines 100 kD Cut-off Amicon Ultra 0,5 ml Filterzentrifuge (Millipore, USA). Die blauen Pfeile zeigen die Proteine, deren Beträge wurden verringert und der rote Pfeil zeigt die Konzentration des Kinesin aufgrund der Zentrifugalfiltration Schritt in diesem Protokoll verwendet.
. 2 Gereinigtes KHC Fraktion geblottet gegen Anti-Kinesin-Antikörper: Gereinigtes Kinesin Probe wurde einer Gelelektrophorese unterzogen und geblottet (in Nitrocellulosemembran) gegen primäre Antikörper AKINO1-A (1:1000 in TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur gefolgt von Inkubation in Esel-anti-Kaninchen-Antikörper (1:10.000 in TBST) für eine Stunde bei Raumtemperatur. Ein ECL (Chemilumineszenz) Kit wurde verwendet, um das Signal Kinesin oben gezeigt zu erkennen.
Abbildung 3. Drosophila Kinesin in voller Länge: (A) und (B) Lauflänge und die Geschwindigkeit des gefilterten Kinesin-Probe. (C) und (D) Lauflänge und die Geschwindigkeit des ungefilterten Kinesin Probe.
Abbildung 4. Video von Kinesin Motilität. Hier klicken, um Video anzusehen .
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Discussion
Rinderhirn ist das am häufigsten verwendete Ausgangsmaterial 11 bis voller Länge Kinesin zu reinigen, wenn murine Gehirn und 12 verwendet wurden. Ein großer Nachteil der Verwendung von Rinder-Hirn als Kinesin-Quelle ist die Verfügbarkeit von frischem Ausgangsmaterial: Schlachthöfe sind in der Regel nicht zugänglich, und das Gehirn muss sehr frisch, um aktiv Kinesin zu erhalten. Weiterhin sind nur die Gehirne der jungen Kühe wirksam. Schließlich ist Genmanipulation von Kühen zur Zeit keine gangbare Option, so dass nur "Wildtyp"-Protein untersucht werden.
Mäuse sind besser zugänglich, aber die Ernte murinen Gehirn ist etwas schwieriger und zeitaufwändiger als Reinigung kann mehr als 50 Köpfe erfordern. Des Weiteren kann die Aufrechterhaltung einer Maus Kolonie ziemlich teuer sein.
Im Gegensatz zu Rinder-oder Murine Quellen verfügt Drosophila eine Reihe von Vorteilen. Erstens können die Fliegen leicht im Labor mit minimalem Kapital heraus gewachsen seinlag, und sind somit leicht zugänglich. Drosophila legen produktivsten Embryonen, die sich leicht geerntet werden, wie hier beschrieben. Da die Drosophila-Genom kann manipuliert werden, und zwar viele Mutante Fliegen einfach erhalten werden, können beide Wildtyp und mutierten Proteinen gereinigt werden, und aufgrund der Kombination von genetischen Manipulationen und einer kurzen Spanne Generation, mehrere Mutanten isoliert werden können. Es sollte jedoch darauf hingewiesen, dass, da eine vollständige Verlust der Kinesin-Funktion letal ist, und Protein in den Embryonen überwiegend maternalen, ist es nicht möglich, reine Kinesin-Mutanten, die dramatisch beeinträchtigt werden zu reinigen. Dennoch ist es möglich, Protein aus heterozygoten Embryonen (kin-mut / +) zu reinigen und zu charakterisieren Funktion der gemischten Population, und dann möglicherweise beziehen sich solche Veränderungen in der Funktion Phänotypen in dem Tier.
Veränderung oder Beeinträchtigung des Verkehrs erscheint vielen neurodegenerativen Krankheiten zugrunde liegen, aber die mechanistische Linkzwischen Krankheit und den Umbau von Einzel-Molekül-Funktion (entweder durch Mutationen oder eine veränderte Umwelt-Signalisierung), ist unklar. Die Reinigung von Proteinen entwickelt Assay sollte hier ein wichtiges Instrument bei der Verfolgung dieses Verständnis sein, weil Einzel-Molekül-Tests können verwendet werden, dass diese Motoren-Funktion zu bestimmen. Durch die Kombination solcher Studien mit In-vivo-Charakterisierung von Phänotypen, und unterstützt durch Modellierung, ermöglicht diese direkte Bestimmung der Beziehung zwischen der Veränderung bestimmten einzelnen molekularen Eigenschaften und Krankheit Entwicklung / Progression (als Beispiel siehe den Zusammenhang zwischen veränderten Einzel-Molekül-Funktion und Dynein beeinträchtigten neuronalen Transport, in 13).
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Besonderen Dank an Kris Ngai und Jason Del Rio für ihre Unterstützung und Hilfe in diesem Projekt. Diese Arbeit wurde von RO1 Zuschuss zu GM070676 SPG unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
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