Summary
זהו פרוטוקול לבודד אורך פעיל kinesin מלא
Abstract
חלבונים רכב להעביר מטענים לאורך microtubules, ולהעביר להם תת הסלולר מיקומים ספציפיים. בגלל התחבורה שינה הוא הציע ביסוד מגוון רחב של מחלות ניווניות, הבנה המבוססת microtubule התחבורה המוטורית ורגולציה שלה סביר להניח בסופו של דבר להוביל גישות טיפוליות משופרים. Kinesin-1 הוא חלבון המנוע אוקריוטים הנעה בכיוון האנטרוגרד (בתוספת סוף) יחד microtubules (MTS), מופעל על ידי הידרוליזה של ATP. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט טיהור לבודד אורך פעיל kinesin מלא מעוברים תסיסנית, על מנת לאפשר שילוב של גנטיקה תסיסנית עם מחקרים biophysical מולקולה בודדת. החל עם כ 50 כוסות הנחת, עם כ 1000 נקבות בכל כוס, ביצענו אוספים לילה. זה סיפק כ 10 מ"ל של עוברים ארז. העוברים היו אקונומיקה dechorionated (מניב כ 9 גרם של עוברי), לאחר מכן, ומעורים. AFהפרעה ter, homogenate הובהר באמצעות ספין במהירות נמוכה ולאחריה צנטריפוגה במהירות גבוהה. Supernatant הבהיר טופל GTP ו טקסול כדי לפלמר MTS. Kinesin היה משותק על polymerized MTS על ידי הוספת אנלוגי ATP, 5'-adenylyl imidodiphosphate בטמפרטורת החדר. לאחר kinesin מחייב, microtubules היו משקעים באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה דרך כרית סוכרוז. גלולה microtubule היה מחדש על תנאי, וזה תהליך חזר על עצמו. לבסוף, ה-ATP נוסף כדי לשחרר את kinesin מ MTS. צנטריפוגה במהירות גבוהה ולאחר מכן סובב את MTS, עוזב את kinesin ב supernatant. זה kinesin היה נתון סינון צנטריפוגלי באמצעות קיצוץ 100 KD את המסנן לטיהור נוסף, aliquoted, הצמד קפואים בחנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -80 ° C. SDS אלקטרופורזה בג'ל המערבי סופג בוצעה באמצעות מדגם מטוהרים. פעילות מוטורית של דגימות מטוהרים לפני ואחרי שלב הסינון הסופי צנטריפוגליהוערך תוך שימוש ב assay במבחנה מולקולה בודדת microtubule. את השברים kinesin לפני ואחרי סינון צנטריפוגלי הראה processivity כפי שדווח קודם לכן בספרות. ניסויים נוספים נערכים על מנת להעריך את האינטראקציה בין kinesin וחלבונים תחבורה אחרים בנושא.
Protocol
זנים של זבובים ניתן לרכוש מוגבר במעבדה. בהתאם לכמות של צלוחיות תסיסנית תרבות שהתקבלו, אחד צריך לעתים קרובות "להעיף" את צלוחיות תרבות, פעם בקבוקונים הגיע לקיבולת המרבית. הגברה נמשך עד כ 50 בקבוקונים תסיסנית תרבות מלאים. אחד ואז עושה "לעוף כוסות" עם 100 מ"ל המשולשת כוסות (טוס קבלת כוס נדון בסעיף הבא). לאחר 24 שעות, השתמש עוברים מן כוסות אלו זרעים חדשים צלוחיות תסיסנית תרבות עם אוכל לטוס מודבקת בתחתית. בטמפרטורת החדר, הזמן צמיחה עוברים תסיסנית מעוברים לילה זבובים בוגרים מלא כ 8.5 ימים. עוברים זרע בוקעים לאחר 12-15 שעות לשלב הזחלים 1. הזחלים לגדול במשך כ 4 ימים השרה פעמיים לשלב הזחלים 2 ו 3, ב 24 ו 48 שעות לאחר הבקיעה. הזחלים ואז לתמצת לתוך pupariums ולהגיש מטמורפוזה 4 יום עד העולה מתוך tיורש במקרים גלמי 1. לאפשר גידול נוסף של כ 2-3 ימים של צלוחיות תרבות תסיסנית כדי להגדיל את כמות הזבובים בכל אחת. כאשר 400 בקבוקונים מלאים, לא תהיה כמות מספקת של זבובים במשך חמישים כוסות ההטלה (כ -1,000 נשים זבובים לכוס). זבובים צריכים זמן להסתגל לסביבה החדשה. בדרך כלל זה לוקח בערך יומיים שהם יהיו מוכנים למסירה, לאחר העברתם את הספלים. החלפת צלחות אגר יומי ישמור את כוסות לטוס נקי, המאפשרים זבובים לחיות זמן רב יותר. (הבנה נוספת של טיפול תסיסנית ו הגברה, עיין תסיסנית DB רוברטס ": גישה מעשית 2).
מקור טוב להשיג כמויות גדולות של עוברים תסיסנית הם כלובים האוכלוסייה 3, אשר זמינים באופן מסחרי. הרכבה ותחזוקה של כלובי האוכלוסייה ניתן לראות על פרק 5 ו 7 בספר תסיסנית melanogaster: Pשימושים ractical בתא ו 4 לביולוגיה מולקולרית. עם זאת, כלובים האוכלוסייה יקר וקשה לשמור. מאז כלובים האוכלוסייה יכול להכיל כמות בשפע של זבובים, שימוש של פחמן דו חמצני יש צורך להעברת והאכלה זבובים. כפי שצוין קודם לכן, פחמן דו חמצני מקטין את בריאותם של הזבובים, מה שגרם להם לא לשים גם כן. בקנה מידה קטן, 100 מ"ל כוסות המשולשת ניתן להשתמש. עם חמישים כוסות 100 מ"ל, 9 גרם של עוברי dechorionated ניתן להשיג. על מנת להסיר את הזבובים המתים, רסק שמרים בשימוש וזיהומים אחרים יצרנו לוכד כפולה מסננת שכבות עם רשת בגדלים שונים. אחת המלכודות מסננת חומרים לא רצויים כמו זבובים מתים תוך מתן אפשרות עוברים לעבור (350 מיקרון גודל הנקבוביות). החלק השני מכיל רשת (120 מיקרון גודל הנקבוביות), שאמור לתפוס עוברים תסיסנית וזיהומים אחרים יעברו דרך הרשת.
1. טוס הכנה גביע אוסף Embryo
- להעיףהזבובים מוגבר של צלוחיות מרובים לתוך בקבוקון פלסטיק ריק, עד כמות הזבובים הגיעו אף שעל גובה של הבקבוקון. לאחר מכן, להעביר אותם זבובים לתוך 100 מ"ל ביצה אוסף כוס (כוס tricon עם ניילון רשת חלונות). שמור הקשה על כוס על משטח קשה כדי למנוע בריחה של זבובים, כאשר העברת זבובים. מכסים עם צלחת כוס רסק אגר המכיל שמרים ולאפשר 24-48 שעות של זמן התייצבות.
- איסוף צלחות אגר בין לילה חמישים כוסות לטוס ולשטוף את תוכן הצלחות אל לוכד מסננת בעזרת מברשת צבע נקייה ומים זורמים. הבשר עוברים בתוך מסננת בכמות גדולה של מים עד שכל הדבק את השמרים הוא נשטף.
- Dechorionate את העוברים ניקה על ידי שיקוע שלהם אקונומיקה 50% עבור 3 דקות.
- לשטוף עם מים מזוקקים עד בהרחבה עוברים רופפים ריח אקונומיקה. לאחר מכן לייבש את רשת עם העוברים על ידי הצבתו על פי מתח AC מגבת לקפל מרובים. להעביר את העוברים אל בקבוקון נקי לרשום את המשקל. </ Li>
2. העובר homogenization והבהרה
- מניחים עוברים dechorionated ב Dounce homogenizer עם נפח 1.5 x מאגר קר כקרח החילוץ.
- האם 5 משיכות עם העלי רופף. Aliquot homogenate לתוך צינורות צנטריפוגות נקיים. סרכזת ב g 15,000 דקות 40. ב 4 ° C.
- בזהירות לאסוף את הנוזל supernatant ברורה ללא שכבת השומנים העליון לבן או גלולה נמוכה יותר.
- העברת supernatant לנקות צינורות צנטריפוגות ו סרכזת ב g 50,000 למשך 30 דקות. ב 4 ° C
- וכתוצאה מכך במהירות גבוהה supernatant אסף כפי שהוסבר לעיל ניתן להשתמש מיד או יכול להיות הצמד קפוא ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
3. Microtubule פלמור ו kinesin עקידת
- להפשיר supernatant קפוא במהירות גבוהה לטמפרטורת החדר. כדי לפלמר microtubules, הוסיפו GTP (0.3 מ"מ) ו - טקסול (20 מיקרומטר) להתסיס בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בשאכר מסתובב.
- כדי לאגד kinesin, להוסיף 2.5 מ"מ nonhydrolyzable ATP אנלוגי 5'-adenylyl imidodiphosphate (AMPPNP), ואחריה תסיסה 10 דקות בטמפרטורת החדר שאכר מסתובב.
4. ההפרש שקיעה של microtubules ו kinesin
- משקעים באמצעות כרית סוכרוז שווה נפח (סוכרוז 20% ו -10 טקסול מיקרומטר במאגר החילוץ) על ידי צנטריפוגה ב 23,000 גרם (sw41ti הרוטור, TLS-55) למשך 30 דקות. ב 4 ° C.
- לשטוף גלולה ידי resuspension ב 10% של נפח homogenate המקורי במאגר מיצוי המכיל 10 מיקרומטר טקסול ו - 75 mM NaCl.
- חזור על שקיעה עם עוד כרית סוכרוז שווה בנפח כמו בשלב 4.1.
- מחדש להשעות גלולה מן הכביסה מלח במאגר החילוץ 5% עם 20 מיקרומטר טקסול, 75 מ"מ NaCl, 10 mM MgSO 4, ו 10 mM ATP.
- משקעים ב 120.000 גרם (sw41ti הרוטור: 31,000 סל"ד, TLS-55: 42,000 סל"ד) במשך 20 דקות ב 4 ° C. איסוף supernatant (kinesin חלק קטן).
- בצעו סינון צנטריפוגלי ב g 14,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. שחזור מדגם מרוכז לחזור סינון עם מסנן חדש לעיל במשך 30 דקות לאסוף את המדגם מרוכז.
- בצע assay החלבון כדי לקבוע את הריכוז. בקצרה, בריכוזים שונים של חלבון ידוע (שור סרום אלבומין, BSA) היה מעורב עם נפח ידוע של ריאגנט ברדפורד ומדד צפיפות אופטית באורך גל 595nm. אז צפיפות אופטית לעומת תקן עקומת הריכוז הוקמה על מנת לחשב את ריכוז לא ידוע של מטוהרים חלק kinesin באמצעות צפיפות אופטית של מדגם זה נמדד בתנאים דומים לזה של דגימות BSA סטנדרטיים. ג'ל אלקטרופורזה, כמו גם המערבי סופג בוצעה גם באמצעות כמות ידועה של kinesin מטוהרים.
- Kinesin aliquot חלק לתוך בנפחים קטנים של הריכוז הרצוי הקפאה בחנקן נוזלי הצמד לאחסן ב -80 ° C.
ss = "jove_title"> 5. נציג תוצאות
באורך מלא kinesin תפקודית טוהרו מעוברים תסיסנית. איור 1 מתאר את הג'ל צבעונית כסף מראה את שברים שונים במהלך טיהור. ליין 1 דוגמה של supernatant מהירות גבוהה לאחר בירור (שלב 2.5), מסלול 2 הוא דוגמה של גלולה לאחר בירור, ליין 3 דוגמה של supernatant אחרי שקיעה 1 עם כרית סוכרוז (שלב 4.1), ליין 4 דוגמה של גלולה אחרי שקיעה הראשונה, מסלול 5 הוא מדגם של supernatant אחרי שקיעה 2 (שלב 4.3), ליין 6 הוא דוגמה של גלולה אחרי שקיעה 2, ליין 7 דוגמה של גלולה של שקיעה הסופי (שלב 4.5), ליין 8 הוא מדגם kinesin מטוהרים, ליין 9 הוא מדגם kinesin מסונן מסלול 10 הוא הסמן. הלהקה מרוכז במסלול 8 ו - 9 בסביבות 115 KD הוא kinesin כבד שרשרת 1, אשר עולה בקנה אחד עם Figurה 1, ליין 8 של העיתון סקסטון שפורסם בשנת 1988 5. תרשים 2 מייצג את כתם המערבי ג של חלק מטוהרים kinesin לאתר באמצעות נוגדנים kinesin שרשרת כבדה. נוגדנים AKINO1, לא באופן משמעותי צולבות להגיב עם בני משפחה אחרים kinesin 6. שים לב, אם כי פרוטוקול התוצאה היא מקור טוב של kinesin תפקודית, בעוד חלק קטן מועשר על kinesin-1, ישנם מזהמים סביר, כולל פוטנציאל kinesins אחרים וחלבונים מוטוריים אחרים. הוצאנו מגוון של מזהמים קטנים יותר של סינון. ככל הסרת מנועים אחרים אשר לא יכול להיעשות על ידי גודל לבד, טיהור דומה למה שנעשה על ידי אחרים ללמוד kinesin 7, ואנו מאמינים כי הרוב המכריע של המנוע הפעיל kinesin-1, אבל טיהור משוכלל יותר שיאפשר סילוק מזהמים רכב פוטנציאליים, כמו שנעשה על ידי קול ואח' 8 ו סקסטון et al. 9 Processivity של kinesin הוערך על ידי ב assay חוץ גופית microtubule מולקולה אחת מחייבת, כפי שמתואר בספרו של Scholey תחת הכותרת "Assay תנועתיות עבור מוטורי חלבונים" 10 ביתר פירוט. בקצרה, חרוזי פוליסטירן עם מנוע פעיל אחד הובאו במגע עם microtubule, בנוכחות להרוות (1 מ"מ) ה-ATP. המנוע מחובר microtubule, והחל מתרחק ממרכז המלכודת לייזר. על עקירה מוגדרים מראש של חרוז ממרכז המלכודת (100 ננומטר) כוח קרן לייזר הפך באופן אוטומטי, מה שמאפשר המנוע ללכת יחד MT תחת עומס. הסרט מראה בקוטר 500 ננומטר חרוז עם kinesin אחד הולך בדרך MT. אורכו של המסך וידאו מתאים ל -20 מיקרומטר. איור 3 מייצג את התפלגות מדודה של לרוץ אורכי יחיד באורך מלא מולקולות תסיסנית kinesin, מטוהרים לפי הפרוטוקול המובא כאן. Exponentiאל לנכון ההפצה מספקת runlength הממוצע של kinesin אחת 1.55 ± 0.1 מיקרומטר ו 1.28 ± 0.12 מיקרומטר למדגם מסונן בלי פילטר בהתאמה.
איור 1 ג'ל כסף מוכתם של שברים מטוהרים: מדגמים של חלק זה נוהלו ג'ל 10%. 10 מיקרוגרם של חלבון נטען בנתיב זה. ליין 1 דוגמה של supernatant מהירות גבוהה לאחר בירור (שלב 2.5), מסלול 2 הוא דוגמה של גלולה לאחר בירור, ליין 3 דוגמה של supernatant אחרי שקיעה 1 עם כרית סוכרוז (שלב 4.1), ליין 4 דוגמה של גלולה אחרי שקיעה הראשונה, מסלול 5 הוא מדגם של supernatant אחרי שקיעה 2 (שלב 4.3), ליין 6 הוא דוגמה של גלולה אחרי שקיעה 2, ליין 7 דוגמה של גלולה של שקיעה הסופי (שלב 4.5), ליין 8 הוא kinesin מטוהריםלדוגמה, ליין 9 הוא kinesin מסוננים באמצעות 100 KD חתוכים Amicon אולטרה 0.5 מ"ל מסנן צנטריפוגלי (Millipore, ארה"ב). החיצים הכחולים מציינים את החלבונים אשר היו כמויות ירד חץ אדום עולה ריכוז kinesin בשל צעד סינון צנטריפוגלי שימוש בפרוטוקול זה.
. איור 2 חלק מטוהרים KHC מחק נוגדנים נגד אנטי kinesin: מדגם מטוהרים kinesin היה נתון אלקטרופורזה בג'ל מחק (בקרום nitrocellulose) נגד הנוגדן העיקרי AKINO1-(1:1,000 ב TBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר ואחריו הדגירה ב חמור נגד ארנב נוגדנים (1:10,000 ב TBST) במשך שעה בטמפרטורת החדר. ערכת (chemiluminescent) ECL שימש לזהות את האות kinesin המוצג לעיל.
איור 3. תסיסנית אחד באורך מלא: (א) ו - (ב) Runlength ומהירות מדגם kinesin מסוננים. (ג) ו - (ד) Runlength ומהירות מדגם kinesin בלי פילטר.
איור 4. וידאו של תנועתיות kinesin. לחץ כאן כדי להציג וידאו .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המוח שור הוא חומר המוצא הנפוצה ביותר 11 לטהר באורך מלא kinesin, אם כי המוח Murine נעשה שימוש גם 12. החיסרון הגדול של שימוש במוח שור כמקור kinesin הוא הזמינות של חומר המוצא טרי: מטבחיים בדרך כלל נגיש, והמוח חייבים להיות טריים מאוד כדי להשיג kinesin פעיל. יתר על כן, רק במוחם של פרות צעירות יעילים. לבסוף, מניפולציה גנטית של פרות הוא כרגע לא אפשרות מעשית, חלבון, כך שרק "wild-type" אפשר ללמוד.
עכברים נגישים יותר, אבל קצירת המוח Murine הוא רב קצת קשה והזמן כמו טיהור יכול לדרוש יותר מ -50 מוחות. יתר על כן, שמירה על המושבה העכבר יכול להיות יקר למדי.
בניגוד למקורות שור או Murine, תסיסנית יש מספר יתרונות. ראשית, הזבובים יכולים בקלות להיות מבוגר במעבדה עם הון מינימלי החוצהנח, ועל כן הם נגישים בקלות. שכב תסיסנית עוברים פורה, אשר שנקטפו בקלות כפי שמתואר כאן. כי הגנום תסיסנית ניתן להשפיע, ואכן זבובים מוטנטים רבים מתקבלים בקלות, שני חלבונים wild-type ו מוטנטי יכול להיות מטוהרים, ובשל שילוב של מניפולציות גנטיות אורך דור קצר, מוטנטים נוספים יכולים להיות מבודדים. עם זאת, יש לציין, כי אובדן מוחלט של הפונקציה kinesin הוא קטלני, וחלבון עוברי מסופק בעיקר אימהי, לא ניתן לטהר מוטציות kinesin טהור, כי הם פגועים באופן דרמטי. עם זאת, ניתן לטהר את החלבון מעוברים הטרוזיגוטיים (קרובי משפחה, mut / +), ולאפיין פונקציה של האוכלוסייה מעורבת ולאחר מכן פוטנציאל לקשר שינויים אלה בתפקוד ל פנוטיפים של החיה.
שינוי או פגיעה התחבורה נראה בבסיס מחלות ניווניות רבות, אך קישור מכניסטיתבין המחלה ושינוי תפקוד מולקולה בודדת (או בשל מוטציות או הסביבה איתות שונה) אינו ברור. טיהור חלבונים assay שפותחה כאן צריך להיות כלי חשוב בהשגת הבנה זו, כי מולקולה בודדת מבחני יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה של מנועים. על ידי שילוב של מחקרים כאלה עם באפיון vivo של פנוטיפים, וסייע ידי דוגמנות, זה מאפשר קביעה ישירה של הקשר בין מאפיינים ספציפיים משינוי מולקולרית בודדים ומחלות התפתחות / התקדמות (כמו למשל, לראות את הקשר בין תפקוד שונה dynein מולקולה בודדת ו הובלה עצבית לקויה, ב 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
תודה מיוחדת קריס נגאי וג'ייסון דל ריו עבור תמיכתם ועזרתם בפרויקט זה. עבודה זו נתמכה על ידי RO1 מענק GM070676 כדי SPG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H.
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
