Summary
Dette er en protokol til at isolere aktive fuld længde kinesin fra
Abstract
Motor proteiner bevæger ladninger langs mikrotubuli, og transportere dem til specifikke sub-cellulære steder. Fordi ændrede transport foreslås at ligge til grund for en række neurodegenerative sygdomme, forståelse mikrotubuli baseret motor transporten og dens regulering vil sandsynligvis i sidste ende føre til bedre behandlingsmetoder. Kinesin-1 er en eukaryot motor protein, som bevæger sig i en anterograd (plus-ende) langs mikrotubuli (MT), drevet af ATP hydrolyse. Her rapporterer vi en detaljeret oprensning protokol til isolering af aktive fuld længde kinesin fra Drosophila-embryoner, således at kombinationen af Drosophila genetik med enkelt-molekyle biofysiske undersøgelser. Startende med cirka 50 æglæggende kopper, med cirka 1000 kvinder pr kop, vi gennemførte natten samlinger. Dette gav cirka 10 ml pakkede æg. Embryonerne blev blegemiddel dechorionated (gav ca 9 g embryoner) og derefter homogeniseret. After forstyrrelser, blev homogenatet klarlagt ved hjælp af en centrifugering med lav hastighed efterfulgt af en højhastighedscentrifugering. Den klarede supernatant blev behandlet med GTP og taxol at polymerisere MTS. Kinesin blev immobiliseret på polymeriseret MT'er ved tilsætning af ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate ved stuetemperatur. Efter kinesin binding blev mikrotubuli sedimenteret ved høj hastighed centrifugering gennem en saccharosepude. Det mikrotubulus Pelleten blev derefter resuspenderet, og denne proces blev gentaget. Endelig blev ATP tilsat for at frigøre kinesin fra MTS. Højhastighedscentrifugering derefter spundet ned MTS, forlader kinesin i supernatanten. Dette kinesin blev underkastet en centrifugal filtrering under anvendelse af en 100 kD cutoff filter for yderligere oprensning, alikvoteret, lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. SDS-gelelektroforese og Western blotting blev udført under anvendelse af oprenset prøve. Den motoriske aktivitet oprensede prøver før og efter det sidste centrifugalfiltreringsenheden trinblev evalueret under anvendelse af en in vitro enkelt molekyle mikrotubulus-assay. De kinesin fraktioner før og efter centrifugal filtrering viste processivitet som tidligere rapporteret i litteraturen. Yderligere eksperimenter er i gang med at vurdere samspillet mellem kinesin og andre transportrelaterede proteiner.
Protocol
Stammer af fluer kan købes og forstærkes i laboratoriet. Afhængig af mængden af Drosophila kultur hætteglas modtaget, har brug for én til ofte 'vende' de kultur hætteglassene, når hætteglassene har nået maksimal kapacitet. Den forstærkning fortsætter indtil ca 50 Drosophila kultur hætteglas er fyldt. Et så gør 'flyve kopper "med 100 ml tricorn bægre (Flyv kop making diskuteres i næste afsnit). Efter 24 timer, skal du bruge embryoner fra disse kopper til frø nye Drosophila kultur hætteglas med anbringes fly mad på bunden. Ved stuetemperatur, er væksten tid til Drosophila embryoner fra natten embryoner til fulde voksne fluer omkring 8,5 dage. Seedede embryoner klækker efter 12-15 timer i det første larver etape. Larverne gro i cirka fire dage molting gange i den anden og tredje larver fase, efter 24 og 48 timer efter udklækning. Larverne derefter indkapsle ind pupariums og forelægger en 4 dages metamorfose indtil vej fra tarving puppe tilfælde 1. Give mulighed for mere vækst for omkring to til tre dage i Drosophila kultur hætteglas at øge mængden af fluer i hver. Når 400 hætteglas fyldes, vil der være en tilstrækkelig mængde af fluer til halvtreds æglæggende kopper (omkring 1.000 hun-fluer pr kop). Fluer har brug for tid til at tilpasse sig deres nye omgivelser. Det tager sædvanligvis omkring to dage for dem at være klar til samling, efter at være overført til bægre. Udskiftning agarskåle dagligt vil holde fluen kopper ren, som gør det muligt fluer til at leve længere. (For yderligere forståelse af Drosophila pleje og forstærkning, henvises til DB Roberts 'Drosophila: A Practical Approach 2).
En god kilde til opnåelse af store mængder af Drosophila-embryoner er befolkning bure 3, som er kommercielt tilgængelige. Montering og vedligeholdelse af befolkningen bure kan ses på kapitel 5 og 7 i bogen Drosophila melanogaster: Practical anvendelser i Cell and Molecular Biology 4. Men befolkningen bure er dyre og svære at vedligeholde. Da befolkningen bure kan holde en rigelig mængde af fluer, brugen af kuldioxid er nødvendig for at overføre og fodring fluer. Som nævnt før, kuldioxid falder sundhed fluerne, får dem ikke at lægge så godt. På en lille skala, kan 100 ml tricorn bægerglas anvendes. Med halvtreds 100 ml bægerglas, kan 9 gram dechorionated embryoner nås. For at fjerne de døde fluer, uudnyttet gær pasta og andre urenheder, vi har skabt et dobbelt lag sigte catcher med forskellige maskestørrelser. En si fælder uønskede materialer, såsom døde fluer samtidig med at embryoner passere (350 mikron porestørrelse). Den anden del indeholder en mesh (120 um porestørrelse), som er beregnet til at fange Drosophila-embryoner og andre urenheder vil passere gennem masken.
1. Flyv Cup Forberedelse og embryonindsamlingsteam
- Flipde amplificerede fluer fra flere hætteglas i en tom plasthætteglas, indtil mængden af fluer har nået en inch af hætteglasset højde. Derefter overføre disse fluer i en 100 ml indsamling af æg kop (Tricon bægerglas med nylon mesh vinduer). Hold trykke koppen på en hård overflade for at forhindre udslip af fluer ved overførsel af fluer. Dæk kop med agarplade indeholder gær pasta og giver 24-48 timers stabilisering tid.
- Indsamle natten agarplader fra halvtreds fly kopper og vask indholdet af pladerne til sigten griberen hjælp af en ren malerpensel og rindende vand. Flesh embryonerne i sigte med masser af vand, indtil al gæren pasta er skyllet væk.
- Dechorionate de rensede embryoner ved at neddyppe dem i 50% blegevand i 3 min.
- Skyl med destilleret vand grundigt, indtil embryoner løse blegemiddel lugt. Så tør nettet med embryoner ved at placere den på ac fold håndklæde flere gange. Overfør embryoner til et rent hætteglas og optage vægten. </ Li>
2. Embryo Homogenisering og afklaring
- Anbring dechorionated embryoner i Dounce homogenisator med 1,5 x volumen iskold ekstraktionsbuffer.
- Gør 5 slag med den løse pistil. Portion homogenatet i rene centrifugerør. Centrifugeres ved 15.000 g i 40 min. ved 4 ° C.
- Omhyggeligt opsamle den klare supernatant væske uden at den øvre hvide lipidlag eller lavere pellet.
- Overfør supernatant at rengøre centrifugerør og centrifugeres ved 50.000 g i 30 min. ved 4 ° C
- Resulterende høj hastighed supernatant opsamlet som beskrevet ovenfor kan anvendes straks eller kan være lynfrosset og opbevaret ved -80 ° C i flere måneder.
3. Mikrotubulus polymerisation og kinesin Binding
- Optø frosne højhastigheds supernatant til stuetemperatur. At polymerisere mikrotubuli tilsættes GTP (0,3 mM) og taxol (20 uM) og omrør forsigtigt ved stuetemperatur i 20 minutter ien roterende rysteapparat.
- At binde kinesin tilsættes 2,5 mM ikke-hydrolyserbar ATP analog 5'-adenylyl imidodiphosphate (AMPPNP), efterfulgt af en 10 min omrøring ved stuetemperatur i en roterende omryster.
4. Differentiel Sedimentering af mikrotubuli og kinesin
- Sediment gennem et tilsvarende volumen saccharosepude (20% sucrose og 10 uM taxol i ekstraktionsbuffer) ved centrifugering ved 23 tusind g (sw41ti rotor, TLS-55) i 30 min. ved 4 ° C.
- Vask bundfaldet ved resuspension i 10% af det oprindelige homogenat volumen i ekstraktionsbuffer indeholdende 10 uM taxol og 75 mM NaCI.
- Gentag sedimentation med en anden lige så stort volumen saccharosepude som i trin 4.1.
- Resuspenderes pelleten fra salt vask i 5% ekstraktionsbuffer med 20 uM taxol, 75 mM NaCI, 10 mM MgSO4 og 10 mM ATP.
- Sediment ved 120.000 g (sw41ti rotor: 31.000 opm, TLS-55: 42 tusind omdrejninger i minuttet) i 20 minutter ved 4 ° C. Saml supernatant (kinesinfraktion).
- Udføre en centrifugal filtrering ved 14.000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Genvinde koncentrerede prøve og gentag filtrering med et nyt filter som ovenfor i 30 minutter og opsamle den koncentrerede prøve.
- Udføre en protein-assay for at bestemme koncentrationen. Kort fortalt varierende koncentrationer af et kendt protein, blev (bovint serumalbumin BSA) blandet med et kendt volumen af Bradford reagens og måles den optiske densitet ved bølgelængde 595nm. Derefter en optisk tæthed versus koncentration standardkurve blev etableret for at beregne den ukendte koncentration af oprensede kinesin fraktion ved hjælp af den optiske densitet af denne prøve målt under tilsvarende betingelser som for standard BSA prøver. Gelelektroforese og Western blotting blev også udført under anvendelse af en kendt mængde af det oprensede kinesin.
- Portion kinesin fraktion i små mængder ønsket koncentration, og snap fryse i flydende nitrogen til opbevares ved -80 ° C.
Fuldlængde-funktionel kinesin blev oprenset fra Drosophila-embryoner. Figur 1 afbilder den sølvfarvede gel, der viser de forskellige fraktioner under oprensning. Bane 1 er et udsnit af den høje hastighed supernatanten efter klaring (trin 2.5), bane 2 er et udsnit af pelleten efter klaring, bane 3 er en prøve af supernatanten efter den første bundfældning med saccharosepude (trin 4.1), bane 4 er en prøve af pelleten efter den første bundfældning, bane 5 er en prøve af supernatanten efter den anden sedimentation (trin 4.3), bane 6 er et udsnit af pelleten efter den anden sedimentation, bane 7 er et udsnit af pelleten i Den endelige sedimentation (trin 4.5), bane 8 er den oprensede kinesin prøven, bane 9 er den filtrerede kinesin prøven, og bane 10 er markøren. Den koncentrerede bånd i bane 8 og 9 omkring 115 kD er kinesin tung-kæde-1, hvilket er konsistent med Figure 1, bane 8 Saxton blev offentliggjort i 1988 5. Figur 2 repræsenterer C western-blot af oprenset kinesin fraktionen påvises ved anvendelse af kinesin tunge kæde antistof. Antistof AKINO1-A ikke krydsreagerer signifikant med andre kinesin familiemedlemmer 6. Bemærk, at selv om denne protokol resulterer i en god kilde til funktionel kinesin, mens fraktionen beriget for kinesin-1, der sandsynligvis kontaminanter, herunder potentielt andre kinesins og andre motoriske proteiner. Vi fjernede en række mindre kontaminanter ved filtrering. For så vidt som at fjerne andre motorer, som ikke kan gøres ved størrelse alene er oprensningen svarer til, hvad der blev gjort af andre til at studere kinesin 7, og vi tror, at størstedelen af det aktive motoren kinesin-1, men mere sofistikerede oprensning ville tillade fjernelse af potentielle motoriske kontaminanter, såsom blev udført ved Cole et al 8 og Saxton et al. 9 Den processivitet af kinesin blev vurderet ved in vitro enkelt molekyle mikrotubulus bindingsassay som beskrevet mere detaljeret i bogen af Scholey titlen "Motilitet Assay for motor proteiner" 10. Kort fortalt blev polystyrenperler med en enkelt aktiv motor bringes i kontakt med mikrotubulus, i nærvær af mættende (1 mm) ATP. Motoren er fastgjort til mikrotubulus, og begyndte at gå væk fra midten af laseren fælden. Ved en foruddefineret forskydning af vulsten fra fælden centrum (100 nm) laserstrålen effekt blev automatisk slukkes, således at motoren til at gå langs MT uden belastning. Filmen viser en 500 nm diameter perle med enkelt kinesin vandre langs MT. Længden af videoskærmen svarer til 20 um. Figur 3 repræsenterer den målte fordeling run-længderne for enkelt fuld længde Drosophila kinesin molekyler oprenset i henhold til protokollen præsenteret her. Den exponential passer til fordelingen giver den gennemsnitlige runlength af en enkelt kinesin 1,55 ± 0,1 m og 1,28 ± 0,12 um for det filtreret og ufiltreret prøve hhv.
Figur 1 sølvfarvede gel af de oprensede fraktioner. Prøver fra hver fraktion blev kørt på en 10% gel. 10 ug protein blev påsat i hver bane. Bane 1 er et udsnit af den høje hastighed supernatanten efter klaring (trin 2.5), bane 2 er et udsnit af pelleten efter klaring, bane 3 er en prøve af supernatanten efter den første bundfældning med saccharosepude (trin 4.1), bane 4 er en prøve af pelleten efter den første bundfældning, bane 5 er en prøve af supernatanten efter den anden sedimentation (trin 4.3), bane 6 er et udsnit af pelleten efter den anden sedimentation, bane 7 er et udsnit af pelleten i Den endelige sedimentation (trin 4.5), bane 8 er det rensede kinesinprøve, bane 9 er det filtrerede kinesin anvendelse af et 100 kD afskæring Amicon ultra 0,5 ml centrifugal filter (Millipore, USA). De blå pile angiver de proteiner, hvis beløb blev nedsat, og den røde pil viser koncentrationen af kinesin på grund af centrifugalfiltreringsenheden skridt anvendes i denne protokol.
. Figur 2 Oprenset KHC fraktion blottet mod anti-kinesin antistof: Oprenset kinesin prøve blev underkastet gelelektroforese og blottet (i nitrocellulose-membran) mod det primære antistof AKINO1-A (1:1000 i TBST) i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af inkubering i Donkey-anti-kanin-antistof (1:10.000 i TBST) i en time ved stuetemperatur. En ECL (kemiluminescerende) kit blev anvendt til at detektere kinesin signalet vist ovenfor.
Figur 3. Drosophila fuldlængde kinesin: (A) og (B) Runlength og hastigheden af filtreret kinesin prøve. (C) og (D) Runlength og hastigheden af ufiltreret kinesin prøve.
Figur 4. Video af kinesin motilitet. Klik her for at se video .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bovin hjerne er det mest anvendte udgangsmateriale 11 til oprensning i fuld længde kinesin, selvom murine hjerne er blevet anvendt som brønden 12. En stor ulempe ved anvendelse af bovin hjerne som kinesin kilde er tilgængeligheden af frisk udgangsmateriale: slagterier er typisk utilgængelige, og hjernen være yderst frisk for at opnå aktive kinesin. Yderligere kun hjernerne hos unge køer er effektive. Endelig, genetisk manipulation af køer er i øjeblikket ikke er en farbar vej, kan så kun "vildtype" protein blive undersøgt.
Mus er mere tilgængelige, men høste murine hjerne er lidt vanskeligt og tidskrævende som rensning kan kræve mere end 50 hjerner. Endvidere kan opretholde en musekolonien være ganske dyre.
I modsætning til bovin eller murint kilder har Drosophila en række fordele. For det første kan fluerne let dyrkes i laboratoriet med minimal møntlå og er således let tilgængelige. Drosophila lå produktive embryoer, der let kan høstes som beskrevet her. Fordi Drosophila genomet kan manipuleres, og endog mange mutant fluer opnås let, kan både vildtype-og mutant-proteiner kan oprenses, og på grund af kombinationen af genetiske manipulationer og en kort generation spændvidde kan flere mutanter isoleres. Imidlertid bør det bemærkes, at på grund fuldstændigt tab af kinesin funktion er dødelig, og protein i embryonerne tilvejebringes fortrinsvis maternelt, er det ikke muligt at oprense rene kinesin mutanter, der er dramatisk nedsat. Ikke desto mindre er det muligt at oprense proteinet fra heterozygote embryoner (kin-Mut / +), og karakterisere funktion af den blandede population, og derefter eventuelt omfatter sådanne ændringer i funktion til fænotyper i dyret.
Ændring eller forringelse af transport synes at ligge til grund for mange neurodegenerative sygdomme, men den mekanistiske linkmellem sygdom og ændring af enkelt-molekyle funktion (enten som følge af mutationer eller en ændret signalering miljø) er uklar. Proteinrensningskonstruktionen assay udviklet her bør være et vigtigt redskab til at følge denne forståelse, fordi enkelt molekyle assays kan anvendes til at bestemme motorerne "funktionen. Ved at kombinere sådanne undersøgelser med in vivo karakterisering af fænotyper, og hjulpet af modellering, tillader denne direkte bestemmelse af forholdet mellem ændrer specifikke enkelt molekylære egenskaber og udvikling af sygdom / progression (som et eksempel, se mellem ændrede enkelt molekyle dynein funktion og nedsat neuronal transport i 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Særlig tak til Kris Ngai og Jason Del Rio for deres støtte og hjælp i dette projekt. Dette arbejde blev støttet af RO1 tilskud GM070676 til SPG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher Scientific | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Petri Dishes | BD Biosciences | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts, Inc. | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher Scientific | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma-Aldrich | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma-Aldrich | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma-Aldrich | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5’-adenylyl imidodiphosphate | Sigma-Aldrich | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | EMD Millipore | UFC510008 |
References
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A. Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).
- Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. 44, (1994).
- Saxton, W. M. Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase. Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).
- Shubeita, G. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1098 (2008).
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules. Cell. 77, 773 (1994).
- Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos. J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).
- Saxton, W. M. Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins. Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).
- Scholey, J. Motility Assay for Motor Proteins. Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).
- Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).
- Aizawa, H.
- Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity. Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).
