Summary
Мы разработали новые лабораторных инструментов и протоколов для прижизненного приобретения изображений тимуса. Наша методика должна помочь в выявлении «ниш» в тимус, где T развития клетка происходит.
Abstract
Двухфотонное микроскопия (TPM) обеспечивает получение изображений в глубоководных районах внутри тканей и органов. В сочетании с разработкой новых инструментов стереотаксической и хирургических процедур, TPM становится мощным методом для выявления "ниши" внутренних органов, а также документ сотовой "поведение" в живых животных. Хотя прижизненного изображения содержит информацию, которая наилучшим образом напоминает реальный сотовый поведение внутри органа, это и более трудоемкий и технически сложных с точки зрения необходимого оборудования / процедур, чем альтернативные бывший приобретения естественных изображений. Таким образом, мы описываем хирургическую процедуру и роман "стереотаксической" орган держатель, который позволяет нам следить за движениями Foxp3 + клеток внутри тимуса.
Foxp3 это главный регулятор для создания регуляторных Т-клеток (Tregs). Более того, эти клетки могут быть классифицированы в зависимости от их происхождения: то есть. тимуса дифференцированных Tregs называют "природной Tregs" (nTregs), а оpposed для периферического преобразован Tregs (pTregs). Несмотря на значительный объем научных исследований, как сообщается в литературе по фенотипу и физиологии этих Т-клеток, очень мало известно об их в естественных условиях взаимодействия с другими клетками. Этот недостаток может быть связано с отсутствием методов, которые позволили бы таких наблюдений. Протокол, описанный в этом документе содержится средство от этой ситуации.
Наш протокол предусматривает использование голым мышам, которые испытывают недостаток эндогенного тимуса, так как они пунктуальны мутации в последовательности ДНК, что компромиссы дифференциации некоторых эпителиальных клеток, в том числе тимуса эпителиальных клеток. Обнаженная мышей гамма-облучения и восстановленного с костного мозга (КМ) от Foxp3-KI GFP / GFP мышей. После восстановления Б. М. (6 недель), каждое животное получало эмбрионального тимуса трансплантации почки внутри капсулы. После принятия тимуса (6 недель), животных под наркозом; почки содержащиепересаженные тимуса была разоблачена, зафиксированных в наш орган держателем, и держали в физиологических условиях для прижизненного изображения по TPM. Мы использовали этот подход для изучения влияния препаратов в поколение регуляторных Т-клеток.
Protocol
1. Животное подготовки
Важные замечания: Б. М. суспензии клеток и трансплантации тимуса проводили в асептических условиях. Б. М. суспензий были подготовлены в капюшонах нашей комнаты культуры клеток, в то время пересадки тимуса проводили в хирургической комнате, расположенной в пределах наших животных объекта. Для того, чтобы сохранить и гарантировать эти асептических условиях, нам не разрешали записывать наше видео в этих местах. Однако, все хирургические материалы автоклавного и хирургических скамья была предварительно очищенные с Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc) и 70% этанола. Все процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC), и они были по согласованию с Федерацией европейских ассоциаций лабораторных животных науки (FELASA) директив. Номера официального утверждения идентификатор AO10/2010. Все эксперименты были изображения терминал процедур и животных были подвергнуты эвтаназии сразу же после окончания изображенияприобретения.
Подробная процедура выглядит следующим образом:
- Радиация (с γ-излучатель) 8 неделя голым мышам с 900 рад уничтожить эндогенных гемопоэтических прекурсоров внутри костного мозга (КМ). После облучения, возвращение животных в своих клетках, пока вы готовите доноров БМ клеток для внутривенного введения и далее Б. М. разведения. Эта передача BM была выполнена через 1 ч после облучения.
- Отдельные Б. М. животных-доноров. Большеберцовые кости и бедра задних конечностей одного животного, как правило, достаточно, чтобы восстановить до 3-х животных получателя. После эвтаназии с СО 2, удалить задние конечности, а затем удалить кожу и мышцы от костей.
- Вырезать закрытом конце каждой кости и промойте его с PBS (или RPMI) или сокрушить их всех в ступке, с помощью пестика, с 2 мл PBS (или RPMI), чтобы удалить BM.
- Disrupt BM структуры в одной клеточной суспензии повторениями энергичного стремления USIнг пипетку P1000. Кроме того, вы можете также передать BM всей 21G иглу шприца в несколько раз. Центрифуга (400 г, 5 мин, RT), вновь приостановить клеток в PBS, и вводят внутривенно в ваши обнаженные облученных реципиентов. В наших экспериментах мы использовали BM от Foxp3-KI GFP / GFP мышей, где все регуляторные Т-клетки (Tregs) будет выражать GFP 1.
- Прием доноров Б. М. происходит в первые дни после перевода, так как не-БМ-восстановленного животные не могут прожить более 14 дней. Однако следует ждать от 4 до 6 недель, чтобы полностью восстановление всех БМ отсеков. Бактрим (Roche) был добавлен в воду (2 мг / мл) в течение первой недели после облучения для снижения риска бактериальных инфекций.
- Эмбриональные трансплантация тимуса уже было описано 2. Короче говоря, начать гнездящихся пар изогенных мышей и проверить его на подключение (свидетельство полового акта) каждый день. Отдельные женщины подключены и СО 2-усыпить их на 15-й день pregnancy (наблюдение вилка 1-й день беременности). Удалить эмбрионов и thymuses. Место эмбриональных thymuses в холодном PBS до передачи.
- Для выполнения thymuses трансплантации, обезболить БМ-получателя голым мышам с кетамин (120 мкг / г веса мыши) / ксилазина (16 мкг / г веса мыши) и держать их на вершине грелку при 37 ° С, пока они не без сознания.
- Хирургическим подвергать почки для выполнения трансплантации thymuses. Первая скраба кожу ChloraPrep (CareFusion Inc) и 70% этанола. Затем, чтобы 1 см порез на коже спины, боковой части тела животного, 2 мм ниже последних грудных ребер.
- Вырезать в брюшную полость и вынуть почки этой полости. Сделайте небольшой поверхностный порез в почечную капсулу с лезвие скальпеля. Использование щипцов с очень тонким кончиком сделать мешочек под почечную капсулу получателя мыши и добавить до 4-х долей тимуса в эту сумку.
- Положите почки б ACK на свое место, шовный брюшную полость с одной или двумя стежками, а затем закройте мыши кожи, используя тот же метод шва. Кроме того, швы можно сделать с помощью хирургического клея.
- Inject анальгетик (буторфанол в дозе 5 мг / кг) подкожно сразу после завершения операции, чтобы избежать боли животное и держать животных в грелку, пока они не начинают, чтобы оправиться от наркоза. Мыши клетке индивидуально в течение первых 3 дней после трансплантации, чтобы предотвратить клетке товарищей от снятия швов. Удалить стежками через 1 неделю.
- Обнаженная мышей не имеют Т-клеток. Таким образом, вы можете оценить тимуса принятия трансплантата путем мониторинга процент CD4 + или CD8 + Т-клеток в крови. Один раз в неделю, 2 недели после пересадки тимуса, кровоточить животных и пятна крови с анти-CD4 и анти-CD8 моноклональные антитела (МАТ). Когда CD4: CD8 составляет примерно 2:1, пересаженные тимус является полностью функциональной (рис. 1).
Подготовить все материалы, которые вы должны заранее и положить их в сторону.
- Анестезию животных с кетамин / ксилазина (тех же дозах описаны в п. 1.5) и разместить их на вершине грелку при 37 ° C. Inject 100 мкл родамина Б изотиоцианата-Декстран (20 мг / мл в PBS) внутривенно, чтобы для будущих визуализации кровотока.
- Выставляют почки содержащих пересаженных тимуса в соответствии с протоколом ранее описанных в пункте 1.6.
- Чтобы предотвратить почку от возвращения в исходное положение, закройте боковые стороны разреза кожи со швами.
- Место кусок PBS пропитанной хлопка в верхней части органа держать его влажным.
- Поместите грелку на вершине стадии животное держатель (рис. 2A).
- Положите животное на вершине грелку в животном держатель, орган (Рисунок 2B).
- Pinch органе в обе стороны с зажимом мфасад из тонкой алюминиевой фольги (рис. 2С).
- Закройте держатель животного и место топ зонд нагреватель как можно ближе к ткани (рис. 2D). Этот обогреватель зонд постоянно измеряет температуру органа и отправляет эту информацию на нагреватель для регулировки электрического тока, удерживая его при температуре 37 ° C.
- Удалить PBS пропитанной хлопка и добавить легкоплавких агарозы (2% в PBS) при 30 ° С на верхней части вашего препарата.
- Обложка целом препарат с верхний нагреватель (рис. 2Е). В отверстие на этот обогреватель есть покровного стекла изоляции агарозном от объективного (рис. 2F). Монитор мыши анестезией и вводят половину дозы повышение каждые 40 мин. После захвата изображений, усыпить животное с CO 2.
Примечание: фотографии клип алюминиевой фольги и верхний нагреватель, представлены на рисунке 3.
3. Двухфотонное изображений приобретения
Мы использовали вертикальное "Prairie Ultima XY" двухфотонного микроскопа. Наша система оснащена Ti: Sapphire лазер, четыре верхних ФЭУ для одновременного до 4 приобретений канала и 20-кратным погружения в воду цели.
- Включите Ti: Sapphire лазера и всей системы микроскопа.
- Добавить дихроичных зеркал и наборы фильтров в соответствии с длиной волны лучшего. В нашем случае мы использовали Олимп-BX2 Chroma держатель содержащих 565 нм дихроичных зеркал, одно 525/50 нм фильтра (для Foxp3-GFP сигнал), и один 595/50 нм фильтра (для Декстран-родамина-B сигнала внутри кровеносных сосудов ). Диапазон длины волны лазерного излучения использовался между 880 до 900 нм.
- Добавить животного владельцу микроскоп, подключения и включите все нагреватели, добавить воду на верхнее отверстие нагреватель, осторожно опустите цель в воду, и сосредоточиться на судно или какой-GFP-Tregs.
- С микроскопом х, у, г внешнего контроля, быстро исследование ткани, чтобы найти области интересов.
- Отрегулируйте прибыль от ФЭУ для оптимизации цветоделения и свести к минимуму количество лазерных, необходимых для достижения достаточной сигнала над фоном. Попробуйте использовать минимальное количество лазерных чтобы избежать фото-урон от ткани.
- Как только область интересов находится, начинаются покадровой съемки. В нашем случае, типичных 5D (х, у, г, т, и цвет) приобретение протокол состоит из последовательного приобретения изображения 50 мкм углубленного объема ткани, разделенное на 4,0 мкм Z-шагов, х и у, длиной 140 мкм каждая. Каждый том занимает около 30 секунд, чтобы быть приобретены. Таким образом, 60 приобретений будет выполнять около 30 мин получения изображений.
- Передача данных на институциональном сервер и использовать ImageJ, Imaris или Volocity программное обеспечение для выполнения многомерной визуализации и клетка слежения.
4. Представитель Результаты
g1.jpg "/>
Рисунок 1. . Эмбриональные тимуса принятие и функции После восстановления Б. М., эмбриональные thymuses были пересажены Б. М. восстановленного животных; через две недели после трансплантации тимуса, этих мышей брали кровь один раз в неделю контролировать процент Т подтипов ячейки путем окрашивания с анти-CD4 или анти-CD8 МАТ. Мы рассмотрели тимуса была успешно принята у животных с CD4: CD8 вокруг 1.5-2.0:1 (А). Чтобы убедиться в ее функциональности, мы пожертвовали некоторыми тимус-пересаженных животных и сравнили процент различных субпопуляций тимоцитов мышей с WT (B). Проценты дважды отрицательный (DN; CD4 - CD8 - тимоцитов) групп населения (путем окрашивания с анти-CD25 и анти-CD44 МКА), дважды положительными (DP; CD4 + CD8 + тимоцитов) и одним положительным (SP) CD4 + или CD8 + тимоцитов были похожи между этими животными.
ig2.jpg "/>
Рисунок 2. Сборка животных держателя. После глубоко под наркозом, животное помещается в верхней части грелку, ранее установленный на вершине этапе владельцу животного (). Почки содержащих пересаженных тимуса вверх (В). Зажим алюминиевой фольги деликатно щепотки целом почек (C), чтобы держать его на месте. Рис. 1С вставить подробно показывает зажимом. Верхняя часть животных держатель ставится на место (D). PBS-пропитанной хлопковой удаляется из верхней части органа, заменены теплой легкоплавких агарозы, и верхний нагреватель добавляется (E). Наконец, все собрание переносится на микроскоп, здесь представлены объективные (F).
Рисунок 3. Информация о держателе частей. Эти фотографии показывают, зажим алюминиевой фольги (), являющихся владельцами почек (B). Отметим также, регион, где трансплантированные тимус находится. Это примерно указывает регионесократить тимуса капсулу и сделать карман положить эмбрионального тимуса. Верхнего покровного стекла нагреватель (С) была зафиксирована с силиконовым клеем, чтобы его нижняя часть (D).
Фильм 1. Прижизненное изображений Foxp3-GFP + тимоцитов в тимусе, где физиологические уровни кислорода и температуры (37 ° С) сохраняется в течение всего процесса. Обратите внимание на кровоток и движение Tregs. Эти скорости могут быть измерены и по сравнению с литературными данными. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.
Фильм 2. Прижизненное изображений Tregs внутри тимуса, где изображения были получены при температуре 30 ° C. Обратите внимание на отсутствие движения и округлой формы клеток, несмотря на поддержание кровотока. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.
Discussion
В этой статье мы показали, процедуры для двухфотонного изображений тимоцитах внутри живого животного. Мы также описаны некоторые параметры, которые следует тщательно контролировать, например, продолжение притока крови и поддержание органов температуры во время визуализации процедур. Тем не менее, несмотря на тщательную усилия для поддержания стабильного органа, артефакты движения, такие как "орган дрейфует" может произойти. Задняя коррекции изображения может осуществляться разработка алгоритмов, специально предназначенные для этой цели. Дальнейший анализ изображения также могут быть источником развития новых протоколов, которые стремится свести к минимуму ошибки.
Тимус является органом, где все Т-клетки производят и, следовательно, это орган, в котором иммунологов, заинтересованных в понимании поколения γδ, CD4, CD8, или Т-клетки будут сосредоточить свое внимание. Большинство исследований, касающихся Т-клеток, основанные на различиях в номера и / или стабильности этих злоктя, после различных в пробирке / в естественных условиях манипуляций. Однако только после визуализации в естественных условиях мы могли наблюдать взаимодействие между клетками иммунной системы, участвующих в поддержании гомеостаза 3-7. Таким образом, в естественных условиях наблюдения тимоцитов, вероятно, один из самых важных недостающую информацию, чтобы лучше понять Т клеточной биологии. Прижизненное TPM обеспечивает детальную картину движения Т клеток и взаимодействия, и мы здесь продемонстрировать, как он может быть использован для подробного исследования тимоцитов. Однако каждый метод имеет свои ограничения. Хотя прижизненного приобретения изображений является наиболее точной системой для отражения поведения клетки внутри тела, это также верно, что эксплантированных получения изображения органов является менее трудоемким и была использована для сбора важной информации об иммунной системе 8,9. Более того, нельзя отрицать, прижизненной методов визуализации требуют хирургического вмешательства, чтобы подвергать ткани и кровеносные сосуды в анестезии животных,которая сама по себе может привести к изменению в физиологии целого органа 10. Тем не менее, Есть неинвазивным методам, которые отменяют артефактов, вызванных хирургическая процедура, 11 и новые методы в настоящее время разрабатываются, что лучше подготовиться заранее, животных, которые будут использоваться 12. Таким образом, новых хирургических процедур и сборов позволит свести к минимуму или обойти ограничения фактического приобретения прижизненного изображения и становиться все более и более доступными для научного сообщества.
Мы показали, что метод, который мы описали возможно, и сообщает обо всех в естественных условиях системных манипуляций, например введения лекарства, которые мы использовали. Таким образом, мы предлагаем использовать этот метод вместе с экс методы естественных условиях уже доступны для того, чтобы дополнять и укреплять дальнейшие исследования, касающиеся тимоцитах развития.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Оливьери для критического обзора этой рукописи, доктор Нуно Морено для логистического помочь построить наш держатель животного и грелки и д-р Виджай К. Kuchroo за добрые пожертвования Foxp3-KI GFP / GFP мышей. Эта работа проводится при поддержке "Fundação пункт Ciencia электронной Tecnologia" (ПКТ, Португалия), грант № PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml | |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | ||
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | ||
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | ||
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | ||
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | ||
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | ||
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | ||
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | ||
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | ||
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
References
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
