Summary
가교 PEG의 히드로겔에서 세포의 사진 캡슐에 대한 방법을 설명합니다. 캡슐 murine insulinoma 이내 Hypoxic 신호 (MIN6) 집계는 형광 마커 시스템을 사용하여 추적할 수 있습니다. 이 시스템은 세포 표현형 변화 hypoxic 신호의 히드로겔 발판과 상관 내에서 세포의 직렬 시험을 수 있습니다.
Abstract
당뇨병 제 1 형, 인슐린 생산의 손실과 잠재적으로 치명적인 고혈당증의 췌장 β - 세포 결과의 면역 파괴. 외인성 인슐린 주사에 대한 대안 치료 옵션으로, 기능성 췌장 조직의 이식은 1,2을 탐험했습니다. 이러한 접근 방식은 normoglycemia보다 자연, 장기 복원의 약속을 제공합니다. 숙주의 면역 시스템에서 기증자의 조직을 보호 거절과 캡슐이 목표를 달성하는 데 사용하는 방법입니다 방지하기 위해 필요합니다.
이러한 알지네이트요 3 아가로 오스 4와 같은 생물 학적 파생 자료, 캡슐 건설을위한 전통적인 선택을하고 있지만 염증이나 양분과 산소 운반을 방해 할 수 fibrotic 전면에 자라난 5 유발 수 있습니다. 또는, 합성 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 기반 hydrogels는 고순도에서 쉽게 작용 가능한 아닌 굴욕 아르제어 기공 크기를 가지고 있고, 매우 6,7,8, biocompatible 수 있습니다. 추가 혜택으로, PEG의 hydrogels가 아닌 생리적 온도 6,7의 신청서를 요구하지 않는 간단한 사진 crosslinking 반응에 빠르게 형성 수 있습니다. 이러한 절차는 여기에 설명되어 있습니다. crosslinking 반응, photoinitiator의 자외선 열화, 1 - [4 - (2 - Hydroxyethoxy) - 페닐]은 2 - 히드록시 -2 - 메틸 -1 - 프로판 -1 - 한 (Irgacure 2959)가, 자유 래디 칼의 생성 공격하는 사슬에서 dimethacrylated PEG (PEGDM) 유도 crosslinking의 비닐 탄소 - 탄소 이중 채권이 끝납니다. Crosslinking 10 분 이내에 얻을 수 있습니다. 이러한 방식으로 구축 PEG의 hydrogels은 호의 셀 7,9을 지원하는 그림, 그리고 낮은 photoinitiator 농도와 UV 조사에 짧은 노출은 캡슐 조직 10 가능성과 기능에 해로운 없습니다되었습니다. 방법과 우리의 PEG는 아래에 설명된 우리가 메타 크릴 레이트 동안 PEGDM는 방향 수 있습니다ectly 같은 시그마와 같은 업체에서 구입했습니다.
캡슐의 내재된 결과는 혈관 네트워크에서 세포의 격리입니다. 영양분의 공급, 특히 산소 따라서 감소 및 확산에 의해 제한됩니다. 이 감소 산소 가용성은 특히 인슐린 분비 그의 기능은 산소가 11-13에 크게 의존 β - 세포에 영향을 수 있습니다. 캡슐 구성과 기하학은 또한 산소 확산 속도와 길이에 영향을 것입니다. 따라서, 우리는 또한 PEG의 캡슐 안에 hypoxic 세포를 식별하는 기술을 설명합니다. 재조합 아데노 바이러스와 세포의 감염 세포 hypoxia - inducible 인자 (HIF) 경로 14을 활성화하는 경우 생산이 될 수있는 형광 신호 수 있습니다. HIFs은 hypoxia에 대한 transcriptional 응답의 주요 규제이므로, 그들은 hypoxic 신호 15 검출을위한 이상적인 대상 마커를 나타냅니다. 이러한 접근 방식은 hypoxi 쉽고 빠르게 감지를 허용C 세포. 간단히, 아데노 바이러스는 hypoxia - 반응 요소 (HRE) trimer의 통제하에 빨간 형광 단백질 (Clontech에서 DS 레드 DR)의 순서가 있습니다. 낮은 산소 조건에 의해 HIF - 1의 안정화는 형광 단백질 (그림 1)의 전사를 운전합니다. 이 바이러스의 건설에 대한 자세한 내용은 이전에 15 공개되었습니다. 바이러스는 -80에서 10 % 글리세롤에 저장됩니다 ° C 3.4 X 10 10 pfu / ML의 농도 1.5 ML의 원심 분리기 튜브의 많은 150 μL aliquots로.
우리가 실험실에서 이전 연구는 집계가 20 % 산소 문화의 사주를 통해 자신의 생존을 유지 등 MIN6 세포가 캡슐 것으로 나타났습니다. MIN6 2 교양 합산 또는 1 %의 산소가 ethidium의 브로마이드와 얼룩뿐만 아니라 20 %의 산소의 세포에 상대적인 형태학의 변화에 의한 괴사성 세포의 두 신호를 (여전히 85-90 % 정도 가능한)했다. 20 % 표시 집계의 부드러운 구형 모양이 로스되었습니다T와 합산보다 세포의 분열증 집단처럼 나타났다. 낮은 산소 스트레스 생존의 발음 드롭을 일으키지 않습니다 있지만, 그것은 분명 MIN6 집합과 포도당 자극 인슐린 분비 15 일까지 측정과 같은 기능을 영향을 미치는 것입니다. 20 % 캡슐 세포와 1 %의 산소 서양 얼룩 분석도 DsRed DR 단백질의 표현과 상호 낮은 산소 조건에서 배양해 세포에 대한 HIF - 1α의 상당한 증가를 보였다.
Protocol
1. PEGDM 합성 및 광활성이있는 제품 PEGDM의 macromer 솔루션 준비
- 하드 플라스틱 뚜껑이있는 40mL 유리관에 PEG의 2g을 (선형, 10000 다) 무게.
- methacrylic 무수물 약 308μL 추가하고 느슨하게 병을 캡.
- 표준 국내 전자 레인지에서 2 분 정도 높이 전자렌지는 유리병. 입고 더위 강한 장갑, 추가로 5 분 높이 후 철저하게 소용돌이 유리병, 전자 레인지.
- 간단히 유리병 장갑으로 취급 할만큼 침착 수 있습니다. 그것을 모자를 벗다하고 병을 소용돌이 치는 동안 서서히 메틸렌 클로라이드를 추가합니다. 솔루션은 필요에 따라 샘플을 vortexing, 명확하고 균일한 나타나도록 충분히 추가합니다. 이 ML - 사용 메틸렌 클로라이드의 총 부피는 1.5 있어야합니다.
- 추운 200 ML에 침전물의 PEGDM는 솔루션 dropwise을 추가하여 디에틸 에테르을 만들어 냈다.
- 진공 여과에 의해 PEGDM를 수집하고 건조 수 있습니다.
- 적절한 금액 PEGDM를 해산탈이온수 (일반적으로 100 -150 ML)의.
- 1000 다의 분자량 차단과 투석 튜브에 5 일 동안 탈이온수에 대한 솔루션을 Dialyze. 하루에 한 번씩 물을 교체합니다.
- -80 ° C 야간에 적절한 용기 동결에 솔루션 나누어지는. 정화 흰색 PEGDM 가루를 얻을 수 4 일 동안 솔루션을 Lyophilize. ° C 사용하지 않을 때 4 분말을 저장합니다.
- 광활성이있는의 PEGDM 솔루션을 준비하려면 먼저 탈이온수에 Irgacure 2959을 용해하여 0.5 중량 %의 photoinitiator 주식 솔루션을 준비합니다. 소용돌이 솔루션과 어둠 속에 그것을 저장합니다.
- 10 wt % 인 PEGDM와 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 0.025 wt % Irgacure 2959 솔루션을 준비합니다. 소용돌이는 철저하게 PEGDM의 해산을 보장합니다. 우리는 일반적으로 한 번에이 솔루션의 1mL를 준비합니다.
- 1.8 ML의 microcentrifuge 튜브에 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터링하여 솔루션을 소독. 알루미늄 호일에 튜브를 두르고4에서 저장 ° C
2. 문화, 감염, 그리고 MIN6 세포의 집합
- MIN6 세포는 37 humidified 환경에서 10 % FBS, 7mM 포도당, 100 단위 / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 및 0.5 μg / ML amphotercin B ° C와 5퍼센트 CO 2와 보충 RPMI 1640 배지에서 양식입니다.
- 치료 문화 플라스크 표면에서 세포를 릴리스 37과 세포 린스, 매체를 대기음 ° C 칼슘 / 마그네슘 - 무료 HBSS, HBSS를 대기음 후 37 ° C 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션이 ML을 추가하고 세포를 허용 3 분 품어.
- 단단히 무료 세포를 노크 술병의 측면을 항아리 다음, 37 8 ML을 추가 ° C 미디어와 적극적으로 세포 현탁액을 피펫 아래로 거품을 소개하지 돌보는.
- 멸균 15 ML의 원심 튜브에 세포를 피펫과 hemocytometer 또는 절차를 집계 다른 세포를 사용하여 셀 카운트를 수행합니다.
- 제조와 세포를 감염시킬 준비에바이러스는 먼저 감염되는 세포의 총 수를 확인하고 감염 원하는 다중성 (방어) (셀 당 50-100 전염성 입자)를 달성하는 데 필요한 바이러스 서스펜션의 볼륨을 계산합니다.
- 신중 1.8 ML의 microcentrifuge 튜브 HBSS의 사전 aliquoted 볼륨으로 바이러스 서스펜션의 적절한 금액을 pipeting하여 HBSS에있는 바이러스를 희석. 통합 세포의 잘 HBSS 당 50 μL가 적합합니다.
- pipet 6 잘 서스펜션 문화 판의 우물에 잘마다 400,000 세포를 달성하는 데 필요한 볼륨을 다음, 자신의 튜브에 그들을 pipeting 아래로 세포를 해산.
- 원하는 입니다만을 달성하기 위해 각 잘하는 희석 바이러스의 적절한 볼륨을 추가합니다.
- 최대 1.7 ML에 전체 볼륨을 얻을 수 있도록 각 잘하는 매체를 추가합니다.
- 인큐베이터 안에서 궤도 흔드는에 접시를 놓습니다. 매체 부드럽게 우물 (~ 100 RPM) 주위 세척 있도록 낮은 설정에 뿌리를 설정합니다. aggrega에 전지를 허용24~36시간에 대한 테. 75-175 μm의의 대략 직경 집계가 형성되어야합니다.
3. PEGDM에서 세포의 캡슐
- 전지는 분산 (2.4 단계) 또는 다음과 같은 집합 (단계 2.10)로 캡슐 수 있습니다. 히드로겔 전구체 PEGDM 솔루션은 액체이기 때문에 전지는 사전 crosslinking와 히드로겔 형성에 정착하는 경향이 있습니다. 정착이 같은 큰 집계와 마찬가지로, 신속하게 발생할 것으로 예상되고있다면, 그것은 세포가 젤의 중심 비행기 정착되도록 두 단계에있는 히드로겔를 생산하기 위해 도움이 될 수 있습니다. 분산 세포에 적합 한 단계 히드로겔 합성 절차 표시됩니다 (그림 2)와 두 단계의 절차는 (3.2-3.9)뿐만 아니라 그림 (그림 3)과 아래에 자세한됩니다.
- 히드로겔가 1 ML 플라스틱 주사기의 해제 테이퍼 팁을 절단하고 랙에 종료를 열 배치하여 형성됩니다있는 용기를 만듭니다.
- 광활성이있는 제품 PEGDM의 Pipet 20 μL 있도록플런저에 주사기의 열린 끝을에 lution 볼륨이 전체 플런저 표면을 커버해야하고. 평평한 유체 표면을 달성하기 위해 작은 단위로 플런저를 조정합니다.
- 랙 및 약 8 분 동안 자외선 램프 (365nm, ~ 7 MW / cm 2) 아래 랙은 히드로겔 crosslinking 수 있도록 위치에 pipet를 놓습니다. 이 시간 동안 세포의 준비가 시작됩니다
- 1.8 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포 / 집계의 원하는 번호를 포함 Pipet 볼륨, 모자, 5 분 동안 130g의 튜브를 원심.
- micropipettor를 사용하면, 신중하게 튜브의 끝에 세포 펠렛을 방해하지 않고 미디어를 제거합니다. 미디어 머리가 펠릿 접근로서, 세밀한를 사용하여 10 μL pipet 팁 도움이 될 수 있습니다.
- 부드럽게 광활성이있는 제품 PEGDM 솔루션 (집계 작업을하면 넓은 mouthed pipet 팁 사용) 20 μL의 세포 펠렛을 resuspend 및 일 위에 주사기로 세포 현탁액을 추가할E는 이전에 히드로겔 부분을 가교.
- 히드로겔 공사를 완료하는 데 자외선의 추가 팔분에 주사기를 쉽게받을 수 있습니다. 완료되면, 세포가 완전히 원통형 히드로겔 (그림 3) 내에 캡슐해야합니다.
- 주사기로부터 간단히 젤 씻어 24 잘 접시의 우물에 HBSS 1 ML에 히드로겔를 꺼냅니다. 원하는 조건 24 - 잘 판 문화의 잘 미디어 1 ML로 젤을 전송합니다.
4. Hypoxia 추적
- 어떤 시점에서 문화, 이미지 중에 전지 hypoxic 신호의 개시를 추적하기 위해 형광 현미경을 사용하여. 당신이 다중 잘 플레이트의 이미지거나 현미경 스테이지에 배치하기 전에 현미경 슬라이드로 젤을 전송 군데되는 무엇에 따라. DS 레드 피크 여기는 556nm에서 달성하고 피크 방출 586nm에서 발생합니다. 배출은 매우 강렬하므로 photobleaching가 observ을하지 않았습니다에드는 문제가 될 수 있습니다. 단백질 생산 및 첫번째 신호 검출의 개시 사이의 지연 시간은 약 12 시간입니다. 신호는 각 신호 세포를 식별할 수있을만큼 구체적이지만, 해상도가 세포내 신호 지방화를 결정하는 불충 분한 수 있습니다. 신호 세포에서 신호는 일반적으로 세포질 전반에 걸쳐 균일하게 관찰합니다. 이 증가 단백질 표현, 전체 단백질 축적, 또는 지연 단백질 성숙에 의한 경우에는 우리가 아직 완전히 결정하지 않은 생각 신호 강도는 또한 hypoxia로 확장 노출 증가시킬 수 있습니다.
5. 대표 결과
PEG의 히드로겔에 캡슐 MIN6 집계의 대표적인 예는 그림 4에 표시됩니다. 가교 겔은 반응이 수행된하는 선박의 모양을내어 걸쳐 고체 것입니다. 이식은 외국 바디 재의 예방에 도움 위해 부드러운 외부 표면 겔이 바람직합니다sponse. 겔 내에서 세포 집계는 완전히 모체로 묶여 있으며 homogenously 더 나은 영양 운송 수 있도록 배포되어야합니다.
MIN6 집계에 hypoxic 신호의 대표 이미지는 그림 5에서 그림입니다. 마커 바이러스에 감염된 동일한 MIN6 집계는 이미지 캡처 전에 20% O 2 (5A) 또는 1% O 44시간 2 (5B) 중 하나에 교양되었습니다.
그림 1. 우리 hypoxia 마커 시스템의 활동의 도식. DS 레드 DR 유전자와 업스트림 HRE업자의 Adenoviral 삽입은 HIF - 1의 제어하에 형광 단백질의 hypoxia 유발 생산 수 있습니다.
그림 2.의 단일 단계 캡슐에 대한 절차 플로우 차트는 CR에 MIN6 세포를 분산PEGDM의 히드로겔을 osslinked. 각 젤 들어, 분산형 전지 광활성이있는 제품 PEGDM의 macromer 솔루션 40μL에서 중단되었습니다. 이 참수를 1mL 주사기에 배치되고 히드로겔는 10~12분 후 365nm 자외선 아래에서 형성됩니다. 완료되면, 히드로겔 디스크는 주사기에서 제거 세탁과 부화를위한 중간 채워진 잘 플레이트에 배치됩니다.
그림 3. 가교 PEGDM의 히드로겔에서 집계 MIN6 세포의 이중 캡슐 단계에 대한 절차 플로우 차트. 각 젤 들어, 반 젤은 처음 8 분 동안의 광활성이있는 PEGDM의 macromer 솔루션 20μL의 UV crosslinking에 의해 형성됩니다. MIN6 집합체는 신중하게 사전 구성된 반 젤 위에 추가됩니다 광활성이있는 제품 macromer 솔루션의 추가 20μL에서 중단되었습니다. 전체 젤 완전히 중간에 캡슐 집계와 자외선 노출의 추가 팔분에 의해 형성젤의 비행기.
그림 4. 20X 배율 아래 40μL 히드로겔 이미지. MIN6 집합체 (~ 400,000 총 세포)가 명확하게 젤 내에서 볼 수 있습니다. 히드로겔 직경 (바 = 1mm) 약 6mm입니다.
그림 5. 형광 hypoxia는 PEGDM의 히드로겔에서 집계 MIN6 세포 신호. 44시간 20 % O 2 캡슐 후 부화에 배치되었다 세포가 2% 44시간에 대한 O 2 incubated 후 캡슐되었습니다 세포가 분명 유비 쿼터스 신호를 표시하는 동안 hypoxia 신호를 (A) 표시되지 않습니다. (바 = 100μm) (B).
Discussion
여기서 제시하는 방법이 아닌 생리적 조건의 최소한의 사용 PEG의 히드로겔의 세포 캡슐을위한 빠르고 간단한 방법을 제공합니다. PEG는 biocompatibility 및 수정의 용이성을 위해 매우 유용한 캡슐 소재를 나타냅니다. 광활성이있는 솔루션에 PEG 비율의 간단한 변화는, 예를 들어, 기공 크기를 통해 기계와 같은 압축 계수와 같은 속성, 그리고 교통 속성을 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 PEG 쉽게 사이드 체인의 추가에 의해 수정됩니다. PEG의 hydrogels 따라서 유망한 임상 장치와 체외 연구를위한 유연한 플랫폼을 모두 나타내는
PEG - 캡슐 세포에서 hypoxia를 추적하는 방법도 소개되었습니다. 이 방법은 hypoxia 감지의 단순과 관심의 세포를 희생 필요가 피하에 유용합니다. 이 기술은 그 회사를 만드는 조건을 다양한 세포 유형의 다양한 적용될 수 있습니다넓은 efulness. 예를 들어, 줄기 세포 차별 화를위한 신호로서 hypoxia는 줄기 세포 micromass 문화에서 추적할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 세포가 나중에 집계됩니다 분산되는 전지 시스템 또는 시스템을 해산하기 위해 적용할 수 있습니다. 또한, 형광 신호의 감지가 크거나 밀도 조직에서 어려울 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
넉넉한 MIN6 세포를 공급 콜로라도 대학 볼더의 크리스티 Anseth 연구소에 감사합니다. 이 프로젝트에 대한 자금은 NSF에 의해 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG | Sigma-Aldrich | 309028-500G | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma-Aldrich | 276685-100ML | |
| Microwave | Emerson | MW8784SB | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | SI-A236 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | D65100-1L | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136-1L | |
| Dialysis Tubing | Spectrum | 132640 | |
| Laboratories | |||
| Freezer | |||
| Lyophilizer | Labconco Corp. | 7670521 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | 8917Z-01 | |
| Irgacure 2959 | Ciba-Geigy | 029891301PS04 | |
| HBSS | Mediatech, Inc. | 21-022-CV | |
| Syringe Filter | VWR international | 28145-477 | |
| RPMI 1640 | Mediatech, Inc. | * | *custom formulation |
| FBS | PAA Laboratories | A15-351 | |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech, Inc. | 30-002-CI | |
| Amphotericin B | Mediatech, Inc. | 30-003-CF | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3597 | Napco Series 8000 WJ w/ O2 suppression |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-052-CI | |
| Orbital Shaker | VWR international | 12620-926 | |
| UV Lamp | Sanyo Denki | FLR40SBLB/M | Holds two 40W, 365nm blacklight blue UV bulbs |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010* | *order number. Model 5810 R |
| Microscope | Nikon Instruments | TI-ND6-PFS | With filterset for 556nm excitation/ 586nm emission |
References
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