Summary
כוחות מכניים לשחק תפקיד מפתח בהתפתחות הריאות ופגיעה ריאות. כאן אנו מתארים שיטה לבודד העובר מכרסמים ריאה מסוג תאים השנייה אפיתל fibroblasts ולחשוף אותם באמצעות גירוי מכני
Abstract
כוחות מכניים שנוצר בתוך הרחם על ידי נשימה דמויי תנועות החוזרות על עצמן ועל ידי distension נוזלים חיוניים להתפתחות הריאות נורמלי. מרכיב מרכזי של התפתחות הריאות הוא הבידול של מכתשיים תאים מסוג II של אפיתל, המקור העיקרי של פעילי שטח ריאתי. תאים אלה גם להשתתף הומאוסטזיס נוזל לומן מכתשיים, ההגנה המארחת, ותיקון פציעה. בנוסף, דיסטלי ריאות תאים parenchyma יכולים להיחשף ישירות מתיחה מוגזמת במהלך הנשמה מלאכותית לאחר הלידה. עם זאת, המנגנונים של המולקולה והתא מדויק שבו לתאי ריאה לחוש גירויים מכניים להשפיע על התפתחות הריאות ולקדם פציעה ריאות אינם מובנים לחלוטין. כאן, אנו מספקים שיטה פשוטה טוהר גבוהה על מנת לבודד סוג התאים השנייה ו fibroblasts מהריאות מכרסמים העובר. לאחר מכן, אנו מתארים במבחנה המערכת, יחידת הזנים Flexcell, כדי לספק גירוי מכאני לתאים עובריים, המדמה כוחות מכניים בריאות התפתחות העובר או פציעה ריאות. מערכת הניסוי מספק כלי מצוין כדי לחקור מנגנונים מולקולריים הסלולר לתאי ריאה בעובר שנחשפו להתמתח. באמצעות גישה זו, המעבדה שלנו זיהתה כמה קולטנים וחלבונים איתות המשתתפות mechanotransduction בפיתוח ריאות העובר פציעה ריאות.
Protocol
1. ציפוי של צלחות עם ECM חלבונים
- בתנאים סטריליים, לערבב 120 מיקרוגרם של laminin עם 12 מ"ל של קר סטרילית 1X PBS לכל צלחת.
- קח את הצלחות שלא טופלו Bioflex ולהוסיף 2ml של פתרון זה גם (הריכוז הסופי של laminin היא 2 מיקרוגרם / cm 2). לחלופין, חלבונים אחרים ECM יכול לשמש, כגון קולגן-1 [10 מיקרוגרם / cm 2], fibronectin [5 מיקרוגרם / cm 2], vitronectin [0.5 מיקרוגרם / cm 2] או ואלסטין [10 מיקרוגרם / cm 2]. טכניקת ציפוי דומה למה שהוא מתואר לציפוי-laminin. ודא בארות מכוסים לחלוטין על ידי פתרון.
- לעטוף את הצלחות עם פלסטיק לשים על 4 מעלות צלזיוס על משטח ישר בן לילה כדי לאפשר laminin כדי לספוג אל החלק התחתון של וולס. בתנאים אלה, צלחות ניתן לאחסן במשך שבוע אחד לפחות תוך שמירה על תפקוד טוב ECM.
- למחרת, בתנאים סטריליים, לשטוף 3 פעמים בארות עם 1X PBS.
- יש לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם 1X PBS להסרת חלבונים unadsorbed.
- שמור את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס עד DMEM תאים מבודדים צעד 2.14.
2. הבידוד של העובר ריאה מסוג תאים מכרסמים השנייה אפיתל
יום לפני הבידוד יש כוסות עם מסך שונים ניילון meshes גודל autoclaved ומוכן.
- להשיג בריאות העובר מ-מתוזמן בהריון העכבר / עכברוש על E17-19 של ההריון. העברת רקמה לתוך צינור מ"ל 50 חרוטי המכיל בינוני DMEM ומניחים אותו על קרח.
- להפוך את המאגר בצינור העיכול מ"ל 50 חרוטי: (10 מ"ל). בכרך זה, רקמת הריאה מ כ 20 עוברים של העכבר / חולדה משמש.
8.5 מ"ל DMEM
0.5 מ"ל 500mm pH 7.4 HEPES
5 מ"ג collagenase 1
5 מ"ג collagenase 1A
1 מ"ל עוף סרום, חום מומת - מערבבים היטב עד שכל המרכיבים, נמוגות מסנן דרך מסנן 0.2 מיקרון מזרק בתוך מכסה המנוע סטרילית. מניחים את צינור חרוטי המכיל מאגר העיכול באמבט מים ב 37 ° C.
- הסר בינוני DMEM מהצינור קוני משלב 2.1 ולהעביר את הרקמה לתוך צלחת פטרי סטרילית.
- לרכך את הריאות היטב עם מספריים או סכין גילוח סטריליים לעשות חתיכות רקמה פחות מ 1 מ"מ ולהעביר את הרקמה לתוך צינור חרוטי המכיל מאגר מחומם מראש העיכול משלב 2.3.
- לעכל את הרקמה על ידי pipetting מעלה ומטה:
100 פעמים עם 10 מ"ל פיפטה
פי 100 עם 5 מ"ל פיפטה
100 פעמים עם פיפטה פסטר - בצנטריפוגה homogenate בסל"ד 1300 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוציאים בזהירות את supernatant ידי השאיפה מחדש להשעות גלולה המכילה את התאים ב 15 מ"ל של DMEM FBS בתוספת 20%.
- להוציא את כוסות עם מסך 100 -, 30 - ו 15 מיקרון meshes ניילון במקום האותם ב 150 מ"ל כוסות סטריליות.
- הוסף homogenate התא משלב 2.8 ו ברצף לסנן דרך 100 -, 30 - ו -15 מיקרון מסך כוסות רשת.
- איסוף בכבדות שלא סוננו תאים 30 ו - 15 מיקרון meshes אחרי כמה שטיפות עם DMEM בתוספת 10% FBS כדי להקל על הסינון הלא אפיתל תאים.
- מחק תסנין של רשת 15 מיקרון אשר מכיל בעיקר fibroblasts.
- לטהר נוספים מסוג תאים השנייה דוגרים על ידי תאים משלב 2.11 על 75 ס"מ 2 צלוחיות למשך 30 דקות (approximatelly10 מ"ל של תרחיף תאים לכל בקבוק).
- איסוף supernatant ו צנטריפוגות בסל"ד 1300 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
- מוציאים בזהירות את supernatant ידי השאיפה מחדש להשעות גלולה המכילה את התאים בנסיוב ללא DMEM. היקף resuspension תלוי בכמות הרקמה מעובד. כ, אנו צלחת המקבילה של תאים המתקבל עובר אחד בכל טוב (2 מ"ל) על מנת אחיערב בין 60-70% confluency למחרת.
- תא פלייט ההשעיה על Bioflex שש גם צלחות עם precoated laminin או fibronectin.
3. הבידוד של fibroblasts ריאות העובר מכרסמים
- בצע את אותם השלבים שתוארו לעיל עבור בידוד מסוג תאים השנייה עד 2.11.
- קח את תסנין מ רשת 15 מיקרון (ללא כביסה הקודם, נפח משוער הוא 10-15 מ"ל) ואת הצלחת על 75 ס"מ 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות, כדי לאפשר fibroblasts לדבוק.
- Aspirate supernantant ולהחליף עם סרום ללא DMEM ו דגירה בן לילה.
- למחרת, למסוק את התאים עם 0.25% (wt / כרך א ') טריפסין ב 0.4 mM EDTA ואת צלחת אותם על צלחות Bioflex precoated עם fibronectin.
4. מערכת ניסיונית לספק גירוי מכני לתאי ריאה
- את הזרעים תאים (בסביבות 50% confluent) על צלחות תרבית Bioflex בסרום ללא DMEM (2 מ"ל / גם) ולתת להם לצרף spreמודעות לפחות 6 שעות לפני ניסויים. באופן כללי במעבדה שלנו שומר על התאים בתרבית במשך כ 24 שעות לפני יישום מתח מכני. אם מספר מסוים של תאים נדרשים עבור הניסויים, לאחר הבידוד, סוג התאים השנייה נשמרות סרום ללא DMEM 75 ס"מ 2 צלוחיות ולמחרת, תאים trypsinized, ספר ויוציא זרעים אז.
- למחרת, התקשורת מוחלפים טרי סרום ללא DMEM (2 מ"ל / טוב) וצלחות bioflex הם רכובים על יחידת FX-5000 הזנים Flexcell. Monolayers צריך להיות גדול מ 80% confluent לפני תחילת הניסויים.
- זן Equibiaxial מוחל על ממברנות. משטר של מתח משתנה בהתאם סימולציה של כוחות מכניים in vivo (ראה דיון).
- תאים שגודלו על הלא מתוחים קרומי בתרבית במקביל משמשים שולטת.
- בתום הניסויים, monolayers ניתן לעבד ולנתח את השינויים על ביטוי גנים (עבור פעילי שטח C למשל חלבון)על ידי שפע חלבון בזמן אמת-PCR, על ידי כתם המערבי, וכו 'כמו כן, monolayers ניתן לתקן לניסויים immunocytochemistry. על טכניקה זו, לאחר קיבוע, ממברנות silastic נחתכים מן הצלחות רכוב על שקופיות הזכוכית באמצעות 10-20 μl מים כסוכן גובר לפני permeabilization ו הדגירה עם נוגדנים. Supernatant יכול לשמש גם כדי לבדוק את נוכחותם של גורמי גדילה, ציטוקינים וכו '
5. נציג תוצאות
איור 1 ואיור 2 נציג להראות שלב ניגודיות תמונות של E18 העובר מסוג תאים עכבר השנייה מבודדים תוך שימוש בטכניקה המתוארת כתב היד הזה.
תרשים 3 מראה כי הלחץ המכני גורם התמיינות של תאים עובריים סוג II של אפיתל באמצעות פעילי שטח החלבון C-כסמן.
באיור 1. הודעותתצלום resentative שלב לעומת זאת נלקח מיד אחרי הבידוד מראה מראה בכבדות של תאים עובריים סוג II.
2. איור E18 העובר מסוג תאים אפיתל השנייה היו מבודדים כפי שתואר כאן, מצופה על צלחות bioflex מצופה laminin. צולמה למחרת, לאחר שאינם מתוחים התאים קבוע paraformaldehyde. הטוהר של התאים נקבע להיות 90 ± 5% על ידי ניתוח מיקרוסקופי של תאים מורפולוגיה immunostaining אפיתל ועל SP-C.
איור 3. עוברית מסוג תאים אפיתל השנייה נחשפו לזן מחזורית 5% לאחר 40 מחזורים / דקה עבור 16h. כתם) הצפוני של חלבון פעילי שטח C (SP-C) ביטוי mRNA מראה כי המתח גורם בידול סוג II באמצעות תא שונה ECM מצעים . + / - סימנים לייצג את החשיפה או לא זהלאמן, בהתאמה. הנתונים מוצגים ממוצע + / - SEM, n = 3; * p <0.05 ב ') תמונות immunocytochemistry הקרינה הוכחת SP-C רמות החלבון (ירוק) בתאים מסוג II של העובר חשוף או לא (שליטה) למתח מכני.. הגרעינים היו counterstained עם dapi (כחול). בר, 10 מיקרומטר. C) תוצאות המערב למחוק משלושה ניסויים שהראו כי קטע מכני מעלה SP-C חלבון. N = 3, * p <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה לבודד תאים עובריים סוג II של אפיתל fibroblasts ולחשוף אותם גירוי מכני באמצעות מנגנון הזנים Flexcell. השתמשנו בטכניקה זו כדי להעריך את התמיינות של תאים אפיתל 1,2 ו ללמוד הקולטן מסלולי איתות מופעל על ידי מתיחה 3-9. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את תגובות התא הנגרמת על ידי פגיעה מכנית 10,11. הנוהל מבוסס על עיכול של רקמת הריאה עם collagenase. הוא מנצל את הנטייה של תאים מסוג II של גוש ביחד לאחר העיכול. צעדים חשובים בעת ביצוע טכניקה זו הם וקוצצים את הרקמה גם כדי להקל על העיכול של הריאה ואת הכביסה ביסודיות את התאים שלא סוננו על 30 ו 15 מיקרון meshes כדי להקל על הסינון הלא אפיתל תאים, ולכן כדי להשיג את הטוהר גבוהה יותר של תאים מסוג II של .
המעבדה שלנו משתמשת מ 'embranes מצופה קולגן או laminin כדי לדמות את ההרכב ECM של ממברנות מרתף. עם זאת, כאשר תאים נחשפים התארכות 20%, תאים יכול לנתק מן המצע במהלך למתוח fibronectin צריך להיחשב מצע חלופי.
שיקול חשוב נוסף הוא להימנע מפגש 100% של monolayers התא לפני למתוח, שכן זה עשוי לקדם את התא אל התא קשר ולא תאים ל-matrix קשר ולכן התאים אולי לא "הגיוני" אחוז התארכות שהוקם על ידי פרוטוקול.
יחידת הזנים Flexcell משתמש ואקום כדי לעוות צלחת גמישה תרבות התחתונה. היישום של ואקום משתרע על פני כל הממברנה הפוסט גליל מרכזי, יצירת עומס רדיאלי ההיקפי אחיד על פני הממברנה ולכן מתן distension equibiaxial, בדומה בתנאים ב vivo (ראה, קריקטורה סקירה סכמטית וידאו, ברשות, ד"ר AJ הקללות Flexתא בינלאומי, www.flexcellint.com). מערכת זו מספקת מוגדר, עיוות סטטי או מחזורית נשלט על ידי משטר זן מסוים. כדי לחקות את תנועות הנשימה של העובר קטע מחזורי הטיפול בין רצועת 2.5-5% לאחר 40-60 מחזורים לדקה מוחל. אין הסכם על אחוז התארכות כי החושים ריאות העובר במהלך הנשימה של העובר. מחברים אחדים מאמינים כי distension 5% הוא 12 המתאים ואילו חוקרים אחרים טוענים כי 2.5% מייצג יותר בתנאים ב vivo 13,14. כדי לדמות הלחץ distension קבוע, פרוטוקול 2.5% מתיחה רציפה משמש. לחקות פציעה ריאות, למתוח מחזורית 20% לאחר 40 מחזורים / דקה משמש. המגבלות האפשריות של טכניקה זו כוללים גידול של עיוות של תאים שנזרעו באזור של קרום היקפי להודעה הטעינה. מגבלה נוספת היא חוסר היכולת לספק יותר מ 15-20% התארכות אם שיעור מחזור גבוה משמש (מעל 40 מחזורי / ד ').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
נתמך על ידי NIH מענק HD052670.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
