Summary
Mechanische Kräfte spielen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung und Lunge Lungenversagen. Hier beschreiben wir eine Methode, um Nager fetalen Lunge Typ II Epithelzellen und Fibroblasten zu isolieren und sie auf mechanische Stimulation mit ein Exposé
Abstract
Mechanische Kräfte in der Gebärmutter mit sich wiederholenden Bewegungen wie Atmung-und Spannungsgefühl durch Flüssigkeit erzeugt werden, sind entscheidend für die normale Entwicklung der Lunge. Ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung der Lunge ist die Differenzierung der alveolaren Typ II Epithelzellen, die Hauptquelle der pulmonalen Surfactant. Diese Zellen auch in Flüssigkeitshomöostase Teilnahme an der Alveolarlumen, Immunabwehr und zu reparieren. Darüber hinaus können distalen Lungenparenchym Zellen direkt auf übertriebene Dehnung werden während der mechanischen Beatmung ausgesetzt nach der Geburt. Allerdings sind die genauen molekularen und zellulären Mechanismen, durch die Lungenzellen spüren, mechanische Reize, um die Entwicklung der Lunge zu beeinflussen und zu fördern Lungenschädigung nicht vollständig verstanden. Hier bieten wir eine einfache und hoher Reinheit Methode, um Typ-II-Zellen und Fibroblasten von Nagern fetalen Lunge zu isolieren. Dann beschreiben wir ein in vitro System, das Flexcell Dehnungseinheit, auf mechanische Reize, um fötale Zellen liefern, die Simulation mechanischer Kräfte infetalen Lunge Entwicklungs-oder Lungenversagen. Dieses experimentelle System bietet ein ausgezeichnetes Werkzeug, um molekulare und zelluläre Mechanismen der fetalen Lunge ausgesetzten Zellen strecken zu untersuchen. Mit diesem Ansatz hat sich unser Labor mehrere Rezeptoren und Signalproteine, die in der Mechanotransduktion Teilnahme an fetalen Lunge Entwicklung und Lungenschädigung identifiziert.
Protocol
1. Beschichtung von Platten mit ECM-Proteine
- Unter sterilen Bedingungen mischen 120 ug von Laminin mit 12 ml kaltem sterile 1X PBS pro Platte.
- Nehmen Bioflex unbehandelten Platten und fügen 2ml der Lösung in jede Vertiefung (Endkonzentration von Laminin ist 2 pg / cm 2). Alternativ könnten andere ECM-Proteine verwendet werden, wie Kollagen-1 [10 ug / cm 2], Fibronektin [5 ug / cm 2], Vitronectin [0,5 ug / cm 2] oder Elastin [10 ug / cm 2]. Das Beschichtungsverfahren ist ähnlich zu dem, was sie für Laminin-Beschichtung beschrieben. Sicherstellen, dass die Kavitäten werden vollständig von der Lösung bedeckt.
- Wickeln der Platten mit Kunststoff und mit über 4 ° C auf einer ebenen Fläche über Nacht auf das Laminin zu adsorbieren können auf den Boden der Vertiefungen. Unter diesen Bedingungen können die Platten für mindestens eine Woche aufbewahrt werden, während noch guter ECM-Funktion.
- Am nächsten Tag, unter sterilen Bedingungen, waschen Sie die Vertiefungen 3 mal mit 1X PBS.
- Spülen Sie die Platten 3 mal mit 1X PBS, um nicht adsorbierten Proteine zu entfernen.
- Halten der Platten bei 37 ° C in DMEM, bis die Zellen aus Schritt 2,14 isoliert.
2. Isolierung von fetalen Lunge Nager Typ II Epithelzellen
Am Tag vor Isolation haben die Bildschirm Tassen mit unterschiedlicher Größe Nylon Maschen autoklavierten und fertig.
- Erhalten fetalen Lunge aus timed-schwangeren Maus / Ratte auf E17-19 Schwangerschaftswoche. Übertragen Sie das Gewebe in einem 50 ml konischen Röhrchen mit DMEM-Medium und stellen Sie ihn auf Eis.
- Machen Verdauung Puffer in einem 50 ml konischen Röhrchen: (10 ml). Für dieses Volumen, wird Lungengewebe von etwa 20 Föten von Maus / Ratte verwendet.
8,5 ml DMEM
0,5 ml 500 mM HEPES pH 7,4
5 mg Collagenase 1
5 mg Collagenase 1A
1 ml Serum vom Huhn, hitzeinaktiviertem - Gut mischen, bis alle Komponenten aufgelöst werden und durch ein 0,2-Mikrometer-Spritze Filter innerhalb des sterilen Haube. Platzieren Sie die konische Röhrchen mit dem Verdau-Puffer in einem Wasserbad bei 37 ° C
- Entfernen Sie die DMEM-Medium von dem konischen Röhrchen aus Schritt 2.1 und übertragen das Gewebe in einer sterilen Petrischale.
- Hackfleisch in die Lunge und mit einer sterilen Schere oder Rasierklinge, um Gewebeteile weniger als 1 mm und übertragen das Gewebe in den konischen Röhrchen mit dem vorgewärmten Verdau-Puffer aus Schritt 2.3.
- Verdau des Gewebes durch Auf-und Abpipettieren:
100-mal mit 10 ml Pipette
100-mal mit 5 ml Pipette
100-mal mit Pasteurpipette - Zentrifuge das Homogenat bei 1.300 UpM für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie vorsichtig die Überstände durch Absaugen und erneut zu suspendieren das Pellet mit den Zellen in 15 ml DMEM plus 20% FBS.
- Nehmen Sie die Pokale Bildschirm mit 100 -, 30 - und 15-Mikron-Nylon Maschen und Stelle them auf sterile 150 ml Becher.
- Fügen Sie Zellhomogenat aus Schritt 2.8 und der Reihe nach durch 100 Filter -, 30 - und 15-Mikron-Sieb Tassen.
- Sammeln Sie verklumpt nicht gefilterten Zellen aus dem 30 - und 15-Mikron-Maschen nach mehrmaligem Waschen mit DMEM plus 10% FBS, um die Filtration von nicht-epithelialen Zellen zu erleichtern.
- Entsorgen Sie das Filtrat von dem 15-Mikron Maschenweite, die meist enthält Fibroblasten.
- Reinigen weiterer Typ II-Zellen durch Inkubieren von Zellen aus Schritt 2.11 75 cm 2-Kolben für 30 min (approximatelly10 ml Zellsuspension pro Kolben).
- Die überstehende Flüssigkeit und zentrifugiert bei 1300 UpM für 5 Minuten bei Raumtemperatur die Zellen zu pelletieren.
- Entfernen Sie vorsichtig die Überstände durch Absaugen und erneut zu suspendieren das Pellet mit den Zellen in serumfreiem DMEM. Das Volumen der Resuspension hängt von der Menge an Gewebe verarbeitet. Etwa wir Kennzeichen des Zellen von einem Fötus in jeder Vertiefung (2 ml) erhalten wird, um achiVorabend zwischen 60-70% Konfluenz am folgenden Tag.
- Platte die Zellsuspension auf Bioflex Sechs-Well-Platten mit Laminin oder Fibronectin beschichtet.
3. Isolierung von fetalen Nagetier Lungenfibroblasten
- Führen Sie die gleichen Schritte für Typ II-Zellen beschrieben Trennung bis zu 2,11.
- Nehmen des Filtrats aus dem 15-Mikrometer-Maschensieb (ohne vorheriges Waschen; ungefähre Volumen 10-15 ml) und die Platte auf 75-cm 2 bei 37 ° C für 30-60 min zu ermöglichen Fibroblasten zu haften.
- Saugen Sie die supernantant und ersetzen mit serumfreiem DMEM, Inkubation über Nacht.
- Am nächsten Tag, Ernte der Zellen mit 0,25% (Gew / Vol) Trypsin in 0,4 mM EDTA und sie auf Platte Bioflex Platten mit Fibronectin beschichtet sind.
4. Experimental-System auf mechanische Reize zu bieten Lungenzellen
- Seed die Zellen (ca. 50% konfluent) auf Bioflex Kulturplatten in serumfreiem DMEM (2 ml / Vertiefung) und lassen Sie sie anbringen und SPREAnzeige für mindestens 6h vor Experimenten. Im Allgemeinen unserem Labor unterhält Zellen in Kultur für rund 24 Stunden vor der Anwendung mechanischer Beanspruchung. Wenn eine bestimmte Anzahl von Zellen für die Experimente erforderlich sind, nach der Isolierung, sind Typ II-Zellen in serumfreiem DMEM 75-cm 2-Kolben und am nächsten Tag, werden die Zellen trypsiniert, gezählt und ausgesät.
- Am nächsten Tag werden Medien mit frischem serumfreiem DMEM (2 ml / Vertiefung) und Bioflex Platten ersetzt werden in einer Flexcell FX-5000 Stamm Einheit angebracht ist. Monoschichten sollte nicht größer als 80% konfluent vor dem Beginn der Experimente.
- Äquibiaxiale Spannung wird an den Membranen aufgebracht. Das Regime der Belastung hängt von Simulation von mechanischen Kräften in vivo abhängig (siehe Diskussion).
- Zellen, die auf nicht-verstreckte Membranen parallel kultiviert angebaut werden als Kontrollen verwendet.
- Am Ende des Experiments kann Monoschichten verarbeitet, um Veränderungen der Genexpression (zB Surfactant Protein C) zu analysierendurch Echtzeit-PCR, Protein Fülle von Western-Blot, etc. Auch kann Monoschichten für Immunzytochemie Experimente fixiert werden. Für diese Technik, nach der Fixierung sind Silastic Membranen aus den Platten geschnitten und auf Objektträger mit 10-20 l Wasser als Montage-Agent vor Permeabilisierung und Inkubation mit Antikörpern. Der Überstand kann auch verwendet werden, um die Anwesenheit von Wachstumsfaktoren, Cytokine usw. zu untersuchen
5. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen repräsentative Phasen-Kontrast-Fotos von E18 fetale Maus-Typ II-Zellen isoliert wurde unter Verwendung der Technik in diesem Manuskript beschrieben.
3 zeigt, dass mechanische Belastung induziert die Differenzierung von fötalem Typ II Epithelzellen mit Surfactant-Protein-C als Marker.
Abbildung 1. Representative Phasenkontrast-Aufnahme direkt nach der Isolierung, welche die verklumpten Erscheinungsbild der fetalen Typ-II-Zellen aufgenommen.
Abbildung 2. E18 fetalen Typ II Epithelzellen wurden isoliert, wie hier und vergoldet auf Bioflex Platten mit Laminin beschichtet beschrieben. Foto aufgenommen wurde am folgenden Tag nach dem nicht gestreckten Zellen in Paraformaldehyd fixiert wurden. Die Reinheit der Zellen war entschlossen, sein 90 ± 5% durch mikroskopische Analyse von epithelialen Zellmorphologie und Immunfärbung für SP-C.
3. Fetal Typ II Epithelzellen wurden in 5% zyklische Dehnung bei 40 Zyklen / min für 16 h ausgesetzt. A) Northern-Blot von Surfactant-Protein C (SP-C)-mRNA-Expression zeigt, dass der Stamm vom Typ II induziert Zelldifferenzierung unter Verwendung verschiedener Substrate ECM . + / - Zeichen repräsentieren Belichtung oder nicht zu strainieren, jeweils. Daten werden als Mittelwert dargestellt + / - SEM, n = 3; * P <0,05 B) Fluoreszenz-Immunzytochemie Bilder zeigen, SP-C-Protein-Spiegel (grün) in der fetalen Typ II-Zellen ausgesetzt sind oder nicht (Kontrolle) mechanisch beansprucht werden.. Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Bar, 10 um. C) Western-Blot-Ergebnisse aus drei Experimenten zeigen, dass die mechanische Dehnung erhöht SP-C-Protein. N = 3; * P <0,05.
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Discussion
In diesem Manuskript, beschreiben wir eine Methode zur fetalen Typ-II-Epithelzellen und Fibroblasten zu isolieren und sie auf mechanische Stimulation mit dem Apparat Flexcell Stamm freizulegen. Wir haben diese Technik verwendet, um Differenzierung von Epithelzellen zu bewerten und 1,2-Rezeptor und Signalwege durch Dehnung 3-9 aktiviert zu studieren. Darüber hinaus kann dieses Verfahren auch verwendet werden, um Zell-Reaktionen durch mechanische Verletzung 10,11 induziert werden wird. Das Verfahren wird auf die Verdauung des Lungengewebes mit Kollagenase basiert. Es nutzt die Vorteile der Tendenz der Typ II-Zellen zu verklumpen nach der Verdauung. Wichtige Schritte bei der Ausführung dieser Technik sind Zerkleinerung des Gewebes gut für die Verdauung der Lunge und Waschen gründlich die nicht gefilterten Zellen auf 30 und 15 Mikron Maschen, um die Filtration von nicht-epithelialen Zellen zu erleichtern und damit zu größerer Reinheit von Typ II-Zellen zu erreichen erleichtern .
Unser Labor arbeitet mit membranes mit Kollagen oder Laminin, um die ECM-Zusammensetzung der Basalmembranen simulieren beschichtet. Jedoch, wenn die Zellen auf 20% Dehnung ausgesetzt sind, könnte Zellen von dem Substrat während der Dehnung zu lösen und Fibronectin als Alternative Substrats betrachtet werden.
Ein weiterer wichtiger Aspekt ist zu 100% Zusammenfluss von Zell-Monolayer vor sich zu strecken, da diese möglicherweise Zell-zu-Zell-Kontakt statt Zell-zu-Matrix Kontakt zu fördern und somit Zellen könnten nicht "Sinn" der Prozentsatz der Dehnung durch gesetzt vermeiden das Protokoll.
Die Flexcell Dehnungseinheit arbeitet mit Unterdruck, um eine flexible untere Platte Kultur zu verformen. Anlegen eines Vakuums erstreckt sich jede Membran über dem zentralen Zylinder Post, die Schaffung einheitlicher radialer und Umfangsrichtung Belastung über die Membranfläche und damit die Bereitstellung äquibiaxiale Distension, ähnlich wie bei in vivo-Bedingungen (siehe Cartoon, schematische Übersicht Video-Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung, Dr. AJ Banes FlexZelle International Corporation, www.flexcellint.com). Dieses System bietet eine definierte und kontrollierte statische oder zyklische Verformung durch den angegebenen Belastungen Regime. Um fetalen Atembewegungen imitieren ein zyklischer Dehnung Regime zwischen 2,5-5% Dehnung bei 40-60 Takte / Minute angewendet wird. Es gibt keine Einigung über den Prozentsatz der Dehnung dass fetalen Lunge Sinnen während der fetalen Atmung. Einige Autoren glauben, dass 5% Dehnung 12 ist geeignet, während andere Forscher, dass 2,5% mehr repräsentativ für die in vivo-Bedingungen 13,14 ist zu argumentieren. Um konstante Dehnung Druck simulieren, wird eine kontinuierliche Dehnung 2,5%-Protokoll verwendet. Um Lungenschädigung zu imitieren, 20% zyklischer Dehnung bei 40 Zyklen / min verwendet wird. Mögliche Einschränkungen dieser Technik umfassen die Erhöhung der Verformung der Zellen im Bereich der Membran der Peripherie des Ladestift ausgesät. Eine weitere Einschränkung ist die Unfähigkeit, Dehnung von mehr als 15-20% geben, wenn ein hoher Taktrate verwendet wird (über 40 Takte / min).
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Unterstützt von NIH HD052670.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
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