Summary
机械力发挥关键作用，在肺发育和肺损伤。在这里，我们描述了一个隔离啮齿动物胎儿肺Ⅱ型上皮细胞和成纤维细胞，并揭露他们使用的机械刺激的方法
Abstract
在子宫内产生的机械力通过重复呼吸运动和流体腹胀是正常的肺发育的关键。肺发育的一个关键组成部分是分化的肺泡Ⅱ型上皮细胞，肺表面活性物质的主要来源。这些细胞也参与流体的动态平衡，在肺泡腔，宿主防御，损伤修复。此外，远端肺组织细胞，可以直接暴露在机械通气，出生后夸张的拉伸。然而，其中肺细胞感应机械刺激影响肺癌的发展和促进肺损伤的确切的细胞和分子机制尚未完全了解。在这里，我们提供了一个简单的和高纯度的方法来隔离II型细胞和啮齿动物胎肺成纤维细胞。然后，我们描述了在体外系统，Flexcell的应变单位，提供机械刺激胎儿细胞，模拟机械力胎儿肺发育或肺损伤。该实验系统提供了一个极好的工具来暴露伸展胎儿肺细胞的细胞和分子机制研究。使用这种方法，我们的实验室已经确定了几个受体和信号转导蛋白在胎儿肺发育和肺损伤，机械传导参加。
Protocol
1。与ECM蛋白涂层板
- 在无菌条件下，混合冷无菌1X PBS每盘12毫升120微克的粘连。
- 采取Bioflex未处理板，并添加到每口井的解决方案2毫升（粘连最后的浓度为2微克/厘米2）。另外，其他的ECM蛋白可以使用，如胶原-1 [10微克/厘米2]，纤维连接蛋白[5微克/厘米2]，玻[0.5微克/厘米2]或弹性[10微克/厘米2]。什么是粘连涂层的涂层技术是类似的。确保井完全覆盖解决方案。
- 包装用塑料板，并在4°C过夜允许的粘连吸附井底部放在一个平面上。在这种情况下，板可以存储至少一个星期，同时仍然保持良好的ECM功能。
- 第二天，在无菌条件下，用1X PBS洗井的3倍。
- 冲洗板3次用1X PBS删除unadsorbed蛋白质。
- 保持在37°Ç的DMEM板，直至细胞分离步骤2.14。
2。胎鼠肺II型上皮细胞的分离
隔离前一天有不同大小的尼龙网格蒸压和准备的屏幕杯。
- 定时怀孕小鼠/大鼠获得E17的19对妊娠胎儿肺部。转移到50毫升锥形管含有DMEM培养基的组织和它放置在冰上。
- 在50毫升锥形管消化缓冲液：（10毫升）。此卷，来自约20个从小鼠/大鼠胎儿肺组织使用。
8.5毫升培养液
500mm的pH值0.5毫升7.4肝素钠
5毫克胶原酶1
5毫克胶原酶1A
1毫升鸡血清，热灭活 - 拌匀，直到所有的组件都溶解并通过0.2微米的无菌罩内的注射器过滤器的过滤器。将锥形管水浴中含有消化缓冲液在37°C。
- 从步骤2.1锥形管的DMEM培养基和组织转移到无菌培养皿。
- 剁碎，用无菌剪刀或刀片的肺组织块小于1毫米，并组织转移到锥形管预热的消化缓冲包含从步骤2.3。
- 消化吸取了组织：
与10毫升吸管的100倍
用5毫升吸管的100倍
巴斯德吸管的100倍 - 在1300转离心5分钟，在室温下匀浆。
- 小心取出吸上清，重新悬浮颗粒细胞中含有15毫升加20％胎牛血清的DMEM。
- 取出屏幕杯与100 - 30 - 15微米尼龙网及地方日EM在无菌的150毫升烧杯。
- 从步骤2.8中加入细胞匀浆和顺序筛选到100 - 30 - 15微米筛网杯。
- 收集从30成群的非过滤的细胞 - 促进非上皮细胞过滤后用DMEM加10％胎牛血清的几个洗和15微米的网格。
- 丢弃滤液，其中包含主要是成纤维细胞从15微米网。
- 孵化75厘米2瓶30分钟（approximatelly10瓶悬浮细胞每毫升）从步骤2.11细胞，净化进一步II型细胞。
- 收集上清1300转的离心机在室温下5分钟沉淀细胞。
- 小心取出吸上清，重新悬浮颗粒含有细胞在无血清DMEM。悬浮量取决于组织的处理量。约，我们板相当于细胞获得在每口井（2毫升），以ACHI从一个胎儿前夕之间的60-70％汇合翌日。
- 预涂板暂停Bioflex六孔板细胞与层粘连蛋白或纤维连接蛋白。
3。胎鼠肺成纤维细胞的分离
- 按照相同的步骤如上所述II型细胞的分离，至2.11。
- 取滤液从15微米网（没有先前洗涤;近似体积为10-15毫升）和板在37°C为30-60分钟，使成纤维细胞坚持到75厘米2。
- 吸的supernantant及更换无血清培养液孵育过夜。
- 第二天，收获细胞，0.25％（重量/体积）胰蛋白酶在0.4毫米EDTA和他们Bioflex板与纤维连接蛋白预涂板。
4。提供机械刺激肺细胞的实验系统
- 种子细胞在无血清培养液（2毫升/孔），并让他们重视和SPRE的Bioflex文化板块（约50％汇合）广告之前至少6小时的实验。在我们的实验室一般维持约24小时前应用机械应变细胞培养。如果一个特定的细胞数量的实验需要，经隔离后，II型细胞保持在无血清培养液75厘米2瓶，第二天，细胞胰酶消化，计数，然后播种。
- 第二天，媒体与新鲜无血清培养液（2毫升/）和bioflex的板取代安装在Flexcell FX-5000应变单位。单层应不大于80％汇合前开始实验。
- equibiaxial应变膜。应变方案，取决于模拟体内的机械力量（见讨论）。
- 并行培养的非拉伸膜生长的细胞作为对照。
- 在实验结束时，单层可以处理，分析基因表达的变化（如表面活性蛋白C）同时实时-PCR技术，蛋白印迹，等丰度，单层可固定的免疫细胞化学实验。这种技术，固定后，硅橡胶膜切出板和玻片上安装使用安装代理前通透性和抗体的潜伏期为10-20μL水。上清也可用于研究生长因子，细胞因子等的存在
5。代表结果
图1和图2显示了代表相衬照片E18胎鼠II型细胞的分离，使用在这个手稿中描述的技术。
图3表明，机械应变诱导胎儿型作为标记使用表面活性蛋白C型II上皮细胞的分化。
图1。声望余丹丹相衬拍照后显示胎儿II型细胞成群的外观隔离。
图2。E18胎儿II型上皮细胞分离这里粘连涂bioflex板和镀。这张照片是采取后翌日非拉伸细胞，多聚甲醛固定。细胞的纯度被确定为90±5％的上皮细胞形态和免疫组化SP-C的微观分析。
图3。胎儿II型上皮细胞暴露于循环应变5％，在40次/分钟为16H。）表面活性蛋白C（SP-C）的mRNA表达，应变诱导II型细胞分化，使用不同的ECM基板Northern杂交。 + / - 符号代表接触或训练，分别。数据作为意味着+ / -扫描电镜（SEM），N = 3; *，P <0.05），荧光免疫细胞化学图像展示（绿色）SP-C蛋白水平在胎儿的II型细胞暴露或不能（控制）机械应变。 counterstained细胞核用DAPI（蓝色）。酒吧，10微米C）西部三个实验的印迹结果显示，机械牵张增加SP-C蛋白。 n = 3 * P <0.05;
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Discussion
在这个手稿中，我们描述了一种方法来隔离胎儿II型上皮细胞和成纤维细胞和揭露他们使用的Flexcell应变仪的机械刺激。我们已经用这种技术来评估上皮细胞的分化1,2和研究舒展3-9激活的受体和信号通路的。此外，这种方法也可以用来研究由10,11机械损伤诱导细胞反应。胶原酶消化肺组织的程序是基于。它需要利用II型细胞的倾向消化后聚集在一起。在执行这一技术的重要步骤是切碎的组织，以促进消化肺和彻底清洗非过滤的细胞在30和15微米的网格，以促进非上皮细胞的过滤，并因此取得更大的II型细胞的纯度。
我们的实验室使用Membranes涂模拟基底膜ECM成分与胶原蛋白或粘连。然而，当细胞暴露于20％的伸长，细胞可能脱离基板在拉伸和FN应考虑作为替代基板。
另一个重要的考虑因素是避免细胞单层的100％汇合前舒展，因为这可能会促进细胞与细胞接触，而不是细胞与基质接触，因此细胞可能无法“感觉”的伸长率，成立了由协议。
Flexcell应变单位使用真空变形灵活的底部培养板。真空中的应用横跨中央缸后，每个膜，创造均匀的径向和圆周穿过细胞膜表面的应变，因此在体内条件下提供equibiaxial腹胀，类似（卡通，示意图，视频，看到与权限，博士AJ巴内斯的Flex细胞国际公司，www.flexcellint.com）。该系统提供了定义，控制静态或循环变形，由指定的应变方案。要模仿胎儿呼吸运动疗程为40-60次/分钟之间的2.5-5％舒展的周期性牵张应用。伸长率上没有达成协议，在胎息的胎儿肺的感觉。一些学者认为，5％腹胀是适当的12，而另一些研究人员认为，2.5％是更多的代表在体内条件下13,14。为了模拟不断扩张的压力，2.5％，连续拉伸协议。来模仿肺损伤，20％在40次/ min的循环舒展。这种技术的潜在限制，包括增加在加载后膜周边地区种植的细胞变形。另一个限制是无法提供伸长率大于15％-20％，如果使用高循环率（40次/ min以上）。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持由NIH资助的HD052670。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
