Summary
Les forces mécaniques jouent un rôle clé dans le développement du poumon et des lésions pulmonaires. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler les rongeurs fœtales du poumon cellules de type II épithéliales et les fibroblastes et de les exposer à une stimulation mécanique en utilisant un
Abstract
Les forces mécaniques générées in utero par répétitives de respiration-comme des mouvements et par la distension de fluide sont essentiels pour le développement normal des poumons. Un élément clé du développement du poumon est la différenciation des cellules alvéolaires de type II épithéliales, la principale source de surfactant pulmonaire. Ces cellules participent également à l'homéostasie du fluide dans les alvéoles du lumen, défense de l'hôte, et la réparation des blessures. En outre, distales du poumon cellules du parenchyme peut être directement exposés à l'étirement exagéré pendant la ventilation mécanique après la naissance. Cependant, les mécanismes moléculaires précis et cellulaires par lesquels les cellules pulmonaires détectent des stimuli mécaniques pour influencer le développement des poumons et de promouvoir des lésions pulmonaires ne sont pas complètement compris. Ici, nous donnons une méthode simple et la pureté élevée pour isoler des cellules de type II et les fibroblastes de poumons des rongeurs fœtaux. Puis, nous décrivons un système in vitro, L'Unité de la souche Flexcell, pour fournir une stimulation mécanique des cellules foetales, simulant des forces mécaniques dansle développement des poumons du foetus ou des lésions pulmonaires. Ce système expérimental fournit un excellent outil pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires dans les cellules pulmonaires fœtales exposées à étirer. En utilisant cette approche, notre laboratoire a identifié plusieurs récepteurs et des protéines de signalisation qui participent à la mécanotransduction dans le développement des poumons du foetus et les lésions pulmonaires.
Protocol
1. Revêtement des plaques avec des protéines ECM
- Dans des conditions stériles, mélanger 120 ug de la laminine avec 12 ml de PBS stérile à froid 1X par plaque.
- Prenez Bioflex plaques non traitées et ajoutez 2 ml de la solution dans chaque puits (concentration finale de la laminine est de 2 pg / cm 2). Alternativement, d'autres protéines de la MEC pourrait être utilisé, comme le collagène-1 [10 pg / cm 2], la fibronectine [5 ug / cm 2], la vitronectine [0,5 pg / cm 2] ou de l'élastine [10 pg / cm 2]. La technique de revêtement est similaire à ce qu'elle est décrite pour la laminine-revêtement. Assurez-vous que les puits sont complètement couvertes par la solution.
- Envelopper les plaques de matière plastique et mis à 4 ° C sur une surface plane pendant une nuit à permettre la laminine pour adsorber au fond des puits. Dans ces conditions, les plaques peuvent être stockés pendant au moins une semaine, tout en conservant la fonction ECM en bon état.
- Le lendemain, dans des conditions stériles, se laver les puits 3 fois avec du PBS 1X.
- Rincer les plaques 3 fois avec du PBS 1X pour éliminer les protéines non adsorbées.
- Garder les assiettes à 37 ° C dans du DMEM jusqu'à cellules sont isolées de l'étape 2.14.
2. Isolement des foetus de rongeurs des cellules pulmonaires épithéliales de type II
Le jour avant l'isolement ont des tasses écran avec différentes mailles en nylon taille autoclavés et prêt.
- Obtenir les poumons du fœtus à partir cadencée enceinte de la souris / rat sur E17-19 de la gestation. Transfert le tissu dans un tube de 50 ml conique contenant du milieu DMEM et le placer sur la glace.
- Assurez-tampon de digestion dans un tube de 50 ml conique: (10 ml). Pour ce volume, le tissu pulmonaire d'environ 20 fœtus de rat / souris est utilisée.
8,5 ml de DMEM
0,5 ml 500 mM pH 7,4 HEPES
5 mg collagénase 1
5 mg collagénase 1A
1 ml de sérum de poulet, inactivé par la chaleur - Mélangez bien jusqu'à ce que tous les composants sont dissous et le filtre à travers un filtre de 0,2 micron seringue à l'intérieur de la hotte stérile. Placer le tube conique contenant le tampon de digestion dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Retirez le milieu DMEM du tube conique de l'étape 2.1 et de transférer le tissu dans un boîte de Pétri stérile.
- Hacher les poumons et avec des ciseaux stériles ou lame de rasoir pour fabriquer des pièces de tissu inférieure à 1 mm et transférer le tissu dans le tube conique contenant le tampon de digestion préchauffée de l'étape 2.3.
- Digèrent le tissu par aspiration et refoulement:
100 fois avec pipette de 10 ml
100 fois avec 5 ml pipette
100 fois avec une pipette Pasteur - Centrifuger l'homogénat à 1300 tours par minute pendant 5 minutes à température ambiante.
- Retirez délicatement le surnageant par aspiration et remettre en suspension le culot contenant les cellules dans 15 ml de DMEM plus 20% de FBS.
- Sortez les coupes d'écran de 100 -, 30 - et mailles en nylon de 15 microns et e placeem sur béchers stériles de 150 ml.
- Ajouter homogénat cellulaire de l'étape 2.8 et séquentielle filtrer à travers 100 -, 30 -, et 15 microns tasses grillage.
- Recueillir agglomérés non-filtrés cellules des années 30 - et 15-micron mailles après plusieurs lavages avec du DMEM plus 10% de FBS pour faciliter la filtration des cellules non épithéliales.
- Jeter le filtrat de la grille de 15 microns qui contient surtout des fibroblastes.
- Purifier d'autres cellules de type II par incubation des cellules de l'étape 2.11 du 75-cm 2 flacons pour 30 min (approximatelly10 ml de suspension cellulaire par flacon).
- Recueillir le surnageant et centrifuger à 1300 tours par minute pendant 5 minutes à température ambiante pour obtenir un culot des cellules.
- Retirez délicatement le surnageant par aspiration et remettre en suspension le culot contenant les cellules dans du DMEM sans sérum. Le volume de la remise en suspension dépend de la quantité de tissu traitée. Environ, nous plaque l'équivalent de cellules obtenues à partir d'un fœtus dans chaque puits (2 ml) de manière à achiveille entre 60-70% de confluence le jour suivant.
- Plaque de la cellule de suspension sur Bioflex six des plaques pré-revêtu avec la laminine ou la fibronectine.
3. Isolement des fibroblastes pulmonaires fœtales chez les rongeurs
- Suivez les étapes décrites ci-dessus pour les cellules d'isolement de type II à 2.11.
- Prendre le filtrat de la grille de 15 microns (sans lavage préalable; volume approximatif est de 10-15 ml) et la plaque sur 75 cm 2 à 37 ° C pendant 30-60 min pour permettre d'adhérer fibroblastes.
- Aspirer le surnageant et le remplacer par du DMEM sans sérum et incuber pendant la nuit.
- Le lendemain, la récolte des cellules avec 0,25% (poids / volume) de la trypsine dans 0,4 mM EDTA et les plaque sur des plaques Bioflex préenduites avec de la fibronectine.
4. Système expérimental pour fournir une stimulation mécanique des cellules pulmonaires
- Ensemencer les cellules (environ 50% de confluence) sur des plaques de culture Bioflex en DMEM sans sérum (2 ml / puits) et les laisser attacher et spreannonce pendant au moins 6h avant les expériences. En général, notre laboratoire conserve des cellules en culture pendant environ 24h avant d'appliquer une contrainte mécanique. Si un certain nombre de cellules sont nécessaires pour les expériences, après l'isolement, les cellules de type II sont maintenus dans DMEM sans sérum de 75 cm 2 flacons et le lendemain, les cellules sont traitées à la trypsine, comptés puis ensemencé.
- Le lendemain, les médias sont remplacés par des frais DMEM sans sérum (2 ml / puits) et des plaques bioflex sont montés dans une unité de Flexcell FX-5000 Strain. Monocouches ne devrait pas être supérieure à 80% de confluence avant le début des expériences.
- Souche équibiaxiale est appliquée aux membranes. Le schéma de la souche varie en fonction de simulation de forces mécaniques in vivo (voir la discussion).
- Les cellules cultivées sur la non-étirés membranes cultivées en parallèle sont utilisés comme témoins.
- A la fin des expériences, des monocouches peuvent être traitées pour analyser les changements sur l'expression des gènes (pour la protéine C par exemple tensio-actif)par l'abondance des protéines en temps réel-PCR, par Western blot, etc En outre, les monocouches peut être fixé pour des expériences d'immunocytochimie. Pour cette technique, après la fixation, des membranes en silastique sont découpés dans des plaques et monté sur des lames de verre à l'aide de 10 à 20 pi d'eau comme agent de montage avant de perméabilisation et l'incubation avec des anticorps. Le surnageant peut également être utilisé pour rechercher la présence de facteurs de croissance, des cytokines, etc
5. Les résultats représentatifs
Figure 1 et Figure 2 montrent représentatives en contraste de phase des photographies de cellules fœtales de souris E18 de type II isolé en utilisant la technique décrite dans ce manuscrit.
La figure 3 montre que la souche mécanique induit la différenciation des cellules fœtales épithéliales de type II en utilisant tensioactif protéine C en tant que marqueur.
Figure 1. Repsentant à contraste de phase photo prise juste après l'isolement montrant l'aspect agglomérées de cellules fœtales de type II.
Figure 2. E18 fœtales des cellules de type II épithéliales ont été isolés comme décrit ici et plaquée sur des plaques recouvertes de laminine bioflex. Photographie a été prise le lendemain, après la non-tendues cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde. La pureté des cellules a été évaluée à 90 ± 5% par analyse microscopique de la morphologie des cellules épithéliales et immunomarquage pour le SP-C.
Figure 3. Foetales cellules de type II épithéliales ont été exposés à la déformation cyclique de 5% à 40 cycles par minute pendant 16 heures. Un blot) Nord de la protéine C du surfactant (SP-C) indiquant que l'expression d'ARNm induit la différenciation souche de type II à l'aide de cellules différente ECM substrats . + / - Signes représentent l'exposition ou non à l'artformer, respectivement. Les données sont présentées sous forme de moyenne + / - SEM, n = 3; * P <0,05 B) images immunocytochimie fluorescence démontrant la teneur en protéines SP-C (vert) dans cellules fœtales de type II ou non exposées (contrôle) à une contrainte mécanique.. Les noyaux ont été DAPI (bleu). Bar, 10 um. C) les résultats du Western blot à partir de trois expériences montrant que stretch mécanique augmente SP-protéine C. N = 3; * P <0,05.
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Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour isoler les cellules de type II fœtales épithéliales et les fibroblastes et de les exposer à une stimulation mécanique en utilisant l'appareil souche Flexcell. Nous avons utilisé cette technique pour évaluer la différenciation des cellules épithéliales 1,2 et d'étudier les voies de signalisation du récepteur et activés par l'étirement 3-9. En outre, cette méthode peut également être utilisée pour étudier les réponses des cellules induites par une blessure mécanique 10,11. La procédure est basée sur la digestion du tissu pulmonaire avec de la collagénase. Il tire parti de la tendance des cellules de type II à s'agglutiner après la digestion. Des mesures importantes, tandis que l'exécution de cette technique sont hacher le tissu bien à faciliter la digestion du poumon et de laver soigneusement les cellules non-filtrés sur 30 et 15 mailles microns afin de faciliter la filtration des cellules non épithéliales et donc d'atteindre une plus grande pureté des cellules de type II .
Notre laboratoire utilise membranes recouverte de collagène ou de la laminine pour simuler la composition ECM des membranes basales. Toutefois, lorsque les cellules sont exposées à un allongement de 20%, les cellules peuvent se détacher du substrat pendant étirement et de la fibronectine doit être considéré comme un substrat de remplacement.
Une autre considération importante est d'éviter 100% de confluence des monocouches de cellules avant de s'étirer, étant donné que ce qui peut favoriser la cellule à cellule de contact plutôt que de cellule à la matrice de contact et donc les cellules pourraient ne pas «sens», le pourcentage d'allongement mis en place par le protocole.
L'Unité de la souche Flexcell utilise un aspirateur pour déformer une plaque de fond souple de la culture. Demande de vide s'étend de chaque membrane sur le poste central du cylindre, la création d'uniforme déformation radiale et circonférentielle à travers la surface de la membrane et donc fournir une distension équibiaxiale, semblable à des conditions in vivo (voir dessin animé, vidéo de présentation schématique, avec la permission, le Dr AJ Banes Flexcellulaire International Corporation, www.flexcellint.com). Ce système fournit une définition, une déformation contrôlée statique ou cyclique par le régime de souche spécifiée. Pour imiter les mouvements respiratoires foetaux un régime étirement cyclique entre étirement 2,5-5% à 40-60 cycles par minute est appliquée. Il n'y a pas accord sur le pourcentage d'allongement qui détecte des poumons du foetus pendant la respiration du fœtus. Certains auteurs pensent que la distension de 5% est de 12 alors que les enquêteurs appropriée d'autres estiment que 2,5% est plus représentatif de la dans des conditions in vivo 13,14. Pour simuler la pression de distension constante, un protocole tronçon de 2,5% en continu est utilisé. Pour imiter une lésion pulmonaire, étirement cyclique de 20% à 40 cycles / min est utilisé. Limites potentielles de cette technique comprennent l'augmentation de la déformation de cellules ensemencées dans la zone périphérique de la membrane au poste de chargement. Une autre limitation est l'incapacité de fournir un allongement supérieur à 15-20% si un taux de cycle élevé est utilisé (au-dessus de 40 cycles par minute).
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Soutenu par NIH HD052670.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
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