Um sistema experimental para estudar Mecanotransdução em células do pulmão fetal

Summary

Forças mecânicas desempenham um papel chave no desenvolvimento de pulmão e lesão pulmonar. Aqui, nós descrevemos um método para isolar roedores fetais de pulmão de células do tipo II epiteliais e fibroblastos e expô-los a estimulação mecânica utilizando um

Abstract

Forças mecânicas geradas in utero pelos repetitivos movimentos como de respiração e pela distensão líquido são essenciais para o desenvolvimento do pulmão normal. Um componente-chave do desenvolvimento do pulmão é a diferenciação de células alveolares do tipo II epiteliais, a principal fonte de surfactante pulmonar. Estas células também participar na homeostase de fluido no lúmen alveolar, de defesa do hospedeiro, e reparação de lesão. Além disso, as células do pulmão distais do parênquima pode ser directamente exposta ao estiramento exagerada durante a ventilação mecânica após o nascimento. No entanto, os mecanismos precisos moleculares e celulares, através da qual as células do pulmão detectam estímulos mecânicos para influenciar o desenvolvimento do pulmão e para promover a lesão pulmonar não são completamente compreendidos. Aqui, nós proporcionar um método simples e de alta pureza para isolar células de tipo II e de fibroblastos a partir de pulmões de roedores fetais. Em seguida, nós descrevemos um sistema in vitro, A Unidade de Strain Flexcell, para proporcionar a estimulação mecânica para células fetais, simulando forças mecânicas emdesenvolvimento pulmonar fetal ou lesão pulmonar. Este sistema experimental fornece uma excelente ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares em células de pulmão de feto expostos a esticar. Usando essa abordagem, nosso laboratório identificou vários receptores e proteínas sinalizadoras que participam mecanotransdução no desenvolvimento do pulmão fetal e lesão pulmonar.

Protocol

1. Revestimento de placas com ECM proteínas

1. Sob condições estéreis, misturar 120 ug de laminina com 12 ml de frio estéril 1X PBS por placa.
2. Tome Bioflex placas não tratadas e adicionar 2 ml da solução a cada poço (concentração final de laminina é 2 ug / cm ^2). Alternativamente, outras proteínas de ECM podem ser utilizados, tais como colagénio-1 [10 ug / cm ^2], fibronectina [5 ug / cm ^2], vitronectina [0,5 ug / cm ^2] ou elastina [10 ug / cm ^2]. A técnica de revestimento é semelhante ao que é descrito para a laminina-revestimento. Assegure-se os poços são completamente cobertas pela solução.
3. Enrole as placas de plástico e colocado a 4 ° C sobre uma superfície plana durante a noite para permitir que o laminina para adsorver para o fundo dos poços. Nestas condições, as placas podem ser armazenadas durante pelo menos uma semana, mantendo a função de ECM boa.
4. No dia seguinte, sob condições estéreis, lavar os poços 3 vezes com PBS 1X.
5. Lavam-se as placas 3 vezes com PBS 1X para remover as proteínas unadsorbed.
6. Manter as placas a 37 ° C em DMEM até que as células são isoladas a partir do passo 2,14.

2. Isolamento de células fetais de roedores pulmão do tipo II epiteliais

Um dia antes de isolamento têm os copos de tela com malhas de diferentes tamanhos de nylon autoclavado e pronto.

1. Obter pulmões fetais de timed-grávida mouse / rato em E17-19 da gestação. Transferir o tecido para um tubo de 50 ml cónico contendo meio DMEM e colocá-lo em gelo.
2. Fazer tampão de digestão num tubo cónico de 50 ml: (10 ml). Para este volume, o tecido de pulmão a partir de cerca de 20 fetos de rato / rato é usado.
   8,5 ml de DMEM
   0,5 ml 500mM pH 7.4 HEPES
   5 mg de colagenase 1
   5 mg de colagenase 1A
   1 ml de galinha soro, inactivado pelo calor
3. Misturar bem até que todos os componentes são dissolvidos e filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 micron dentro do capuz estéril. Colocar o tubo cónico contendo o tampão de digestão num banho de água a 37 ° C.
4. Remover o meio DMEM a partir do tubo cónico a partir do passo 2.1 e transferir o tecido em uma placa de Petri estéril.
5. Picar os pulmões bem com uma tesoura estéreis ou lâmina de barbear para fazer peças de tecido inferior a 1 mm e transferir o tecido para dentro do tubo cónico contendo o tampão de digestão de pré-aquecida a partir do passo 2.3.
6. Digerir o tecido pipetando cima e para baixo:
   100 vezes com 10 ml de pipeta
   100 vezes com 5 ml de pipeta
   100 vezes com uma pipeta de Pasteur
7. Centrifugar o homogeneizado a 1300 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente.
8. Cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração e re-suspender o sedimento contendo as células em 15 ml de DMEM mais 20% de FBS.
9. Retire os copos de tela com 100 -, 30 - e malhas de 15 mícron de náilon e po lugarem em estéreis de 150 ml copos.
10. Adicionar homogenato celular a partir do passo 2,8 e sequencialmente filtrar através de 100 -, 30 -, e 15 micras copos tela de malha.
11. Collect agregada não filtrados células a partir da 30 - e 15 micron-malhas após várias lavagens com DMEM mais 10% FBS para facilitar a filtração de células não-epiteliais.
12. Descartar o filtrado a partir da malha 15 micron, que contém principalmente fibroblastos.
13. Purifica-se células do tipo II adicionais por incubação de células a partir do passo 2,11 em 75-cm ² frascos para 30 min (approximatelly10 ml de suspensão de células por frasco).
14. Recolher o sobrenadante e centrifugar a 1300 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente para sedimentar as células.
15. Cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração e re-suspender o sedimento contendo as células em DMEM isento de soro. O volume de ressuspensão depende da quantidade de tecido processado. Aproximadamente, nós chapa do equivalente de células obtido a partir de um feto em cada poço (2 ml), a fim de achieve entre 60-70% de confluência no dia seguinte.
16. Suspensão placa da célula em Bioflex seis poços pré-revestidos com laminina ou fibronectina.

3. Isolamento de fibroblastos de pulmão de feto de roedores

1. Siga os mesmos passos descritos acima para o tipo de isolamento das células II até 2,11.
2. Tome-se o filtrado a partir da malha 15-micron (sem lavagem anterior; volume aproximado é de 10-15 ml) e da placa em 75 cm de ² a 37 ° C durante 30-60 min para permitir que os fibroblastos de aderir.
3. Aspirar o supernantant e substituir com DMEM isento de soro e incubar durante a noite.
4. No dia seguinte, a colheita das células com 0,25% (peso / vol) de tripsina em 0,4 mM de EDTA e da placa-as em placas Bioflex pré-revestidas com fibronectina.

4. Sistema experimental para proporcionar a estimulação mecânica para as células do pulmão

1. De sementes as células (cerca de 50% confluentes) em placas de cultura de Bioflex em DMEM isento de soro (2 ml / poço) e deixá-los anexar e SPREanúncio por pelo menos 6h antes dos experimentos. Em geral nosso laboratório mantém células em cultura por cerca de 24 horas antes de aplicar tensão mecânica. Se um número específico de células são necessárias para as experiências, após isolamento, as células do tipo II são mantidas em DMEM isento de soro de 75-cm ² frascos e no dia seguinte, as células são tripsinizadas, contadas e então semeadas.
2. No dia seguinte, os meios são substituídos com fresco DMEM isento de soro (2 ml / poço) e as placas Bioflex são montados numa Unidade Strain Flexcell FX-5000. Monocamadas não deve ser maior do que 80% confluente antes do início das experiências.
3. Estirpe Equibiaxial é aplicada às membranas. O regime de tensão varia dependendo de simulação de forças mecânicas in vivo (ver discussão).
4. Células cultivadas em não-esticado membranas cultivadas em paralelo são utilizados como controlos.
5. No final dos ensaios, as monocamadas pode ser processada para analisar as mudanças na expressão de genes (por exemplo C de proteína surfactante)por abundância de proteínas em tempo real-PCR, por Western blot, etc Além disso, as monocamadas pode ser fixado para experiências imunocitoquímica. Para esta técnica, após a fixação, as membranas de silastic são cortados a partir das placas e montadas em lâminas de vidro usando 10-20 ul de água como agente de montagem antes permeabilização e incubação com anticorpos. Sobrenadante pode também ser usado para investigar a presença de factores de crescimento, citocinas, etc

5. Os resultados representativos

A Figura 1 ea Figura 2 mostram representativos contraste de fase fotografias de E18 fetais de rato células de tipo II isolado utilizando a técnica descrita no presente manuscrito.

A Figura 3 demonstra que a esforços mecânicos induz a diferenciação de células de tipo II fetais epiteliais utilizando surfactante proteína C, como um marcador.

Figura 1. Repfotografia de contraste de fase representativa tirada logo após o isolamento mostrando a aparência agregado de células fetais do tipo II.

Figura 2. E18 células de tipo II fetais epiteliais foram isolados como descrito aqui e plaqueadas em placas de Bioflex revestidas com laminina. Fotografia foi tirada no dia seguinte após não esticados as células foram fixadas em paraformaldeído. A pureza das células foi determinada ser de 90 ± 5% por análise microscópica da morfologia das células epiteliais e imunocoloração para SP-C.

Figura 3. Células de tipo II Fetal epiteliais foram expostas a estirpe cíclico de 5% a 40 ciclos / min durante 16 h. Um blot) Northern de surfactante de proteína C (SP-C) a expressão do mRNA que mostra que a estirpe tipo induz a diferenciação das células II utilizando diferentes substratos ECM . Sinais + / - representam a exposição ou não streinar, respectivamente. Os dados são apresentados como média + / - SEM, n = 3; * P <0,05 B) imagens de fluorescência imunocitoquímica demonstrando níveis de proteína SP-C (verde) em células de tipo II fetais expostos ou não (controle) a uma tensão mecânica.. Os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul). Bar, 10 uM. C) Os resultados de Western blot de três experiências que mostram que estiramento mecânico aumenta SP-C da proteína. N = 3; * P <0,05.

Discussion

Neste artigo, nós descrevemos um método para isolar as células fetais do tipo II epiteliais e fibroblastos e expô-los a estimulação mecânica usando o aparelho Strain Flexcell. Usámos esta técnica para avaliar a diferenciação de células epiteliais ^1,2 e para estudar receptor e vias de sinalização activados por estiramento ^3-9. Além disso, este método também pode ser usado para investigar as respostas das células induzidas por lesão mecânica ^10,11. O procedimento baseia-se a digestão do tecido pulmonar com colagenase. Aproveita-se à tendência de células do tipo II para se aglutinarem após a digestão. Passos importantes durante a realização desta técnica são picagem do tecido bem para facilitar a digestão do pulmão e lavando completamente as células não-filtrado em 30 e 15 malhas micron para facilitar a filtração de células epiteliais não-e, portanto, para alcançar uma maior pureza de células do tipo II .

Nosso laboratório emprega membranes revestidos com colagénio ou laminina para simular a composição ECM das membranas basais. No entanto, quando as células são expostas ao alongamento de 20%, as células podem separar a partir do substrato durante o alongamento e fibronectina deve ser considerada como um substrato alternativo.

Outra consideração importante é evitar a 100% de confluência de monocamadas de células antes de se esticar, dado que este pode promover a célula a célula de contato em vez de célula a matriz de contato e, portanto, as células não poderiam "sentir" o percentual de alongamento criado pela o protocolo.

A Unidade de Strain Flexcell utiliza um vácuo para deformar uma placa de cultura flexível inferior. Aplicação de vácuo estende-se cada membrana sobre o poste central do cilindro, criando estirpe radial e circunferencial uniforme em toda a superfície da membrana e, portanto, proporcionar distensão equibiaxial, semelhante a condições in vivo (ver desenhos animados, vídeo visão esquemática, com permissão, Dr. AJ Banes Flexcélula International Corporation, www.flexcellint.com). Este sistema proporciona uma definido, deformação controlada estático ou cíclico pelo regime de tensão especificada. Para imitar os movimentos respiratórios fetais um regime de estiramento cíclico entre trecho 2,5-5% em 40-60 ciclos por minuto é aplicada. Não há acordo sobre o percentual de alongamento que os sentidos do pulmão fetal durante a respiração fetal. Alguns autores acreditam que a distensão de 5% é ¹² apropriada, enquanto outros pesquisadores argumentam que 2,5% é mais representativo do condições in vivo ^13,14. Para simular a pressão constante distensão, um protocolo de estiramento de 2,5% contínua é usado. Para imitar a lesão pulmonar, estiramento cíclico de 20% a 40 ciclos / min é usado. Limitações potenciais desta técnica incluem o aumento da deformação de células inoculadas na área da membrana periférica para o posto de carregamento. Outra limitação é a incapacidade de fornecer% de alongamento maior do que 15-20 se uma taxa de ciclo de alta é usado (acima de 40 ciclos / min).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5648
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagenase 1	Sigma-Aldrich	C0130
Collagenase 1A	Sigma-Aldrich	C9891
Chicken serum	Sigma-Aldrich	C5405
Screen cups	Sigma-Aldrich	CD1-1KT
Syringe filters	Fisher Scientific	09-754-25
100 micron nylon mesh	Small Parts, Inc.	CMN-100-D
30 micron mesh	Small Parts, Inc.	CMN-30-D
15 micron mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX15
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Collagen-1	Collagen Biomed	PC0701
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Vitronectin	Sigma-Aldrich	V-0132
Elastin	Sigma-Aldrich	E-6402
Bioflex plate	Flexcell International	BF-3001U	Uncoated
Flexcell Strain Unit	Flexcell International	FX-5000