Summary
Механические силы играют ключевую роль в развитии легких и повреждения легких. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать грызунов плода легкого типа II эпителиальных клеток и фибробластов и подвергать их механическим раздражением использования
Abstract
Механические силы, возникающие внутриутробно повторяющихся дыхательных движениях, как и жидкости растяжению имеют решающее значение для нормального развития легких. Ключевым компонентом развития легких является дифференциация альвеолярных типа II эпителиальные клетки, основным источником легочного сурфактанта. Эти клетки также участвуют в жидкости гомеостаза в альвеолярной просвет, иммунной защиты и повреждения ремонта. Кроме того, дистальный легочной паренхимы клеток может быть прямой контакт с преувеличенным растяжения во время искусственной вентиляции легких после рождения. Тем не менее, точные молекулярные и клеточные механизмы, посредством которых клетки легких чувствовать механические раздражители влияют на легкие развития и содействовать повреждения легких полностью не поняты. Здесь мы предоставляем простые и высокой чистоты методом изоляции II типа клеток и фибробластов от грызунов легкие плода. Затем мы опишем в пробирке системы, Группа Flexcell деформации, для обеспечения механической стимуляции клеток плода, имитируя механических сил вэмбрионального развития легких или легкие травмы. Эта экспериментальная система обеспечивает превосходный инструмент для исследования молекулярных и клеточных механизмов в эмбриональные клетки легких подвергаются растяжению. Используя этот подход, наша лаборатория выявила несколько рецепторов и сигнальных белков, участвующих в механотрансдукции в развитии плода легких и повреждения легких.
Protocol
1. Покрытие пластин с ECM белков
- В стерильных условиях, смешайте 120 мкг ламинина с 12 мл холодного стерильного 1X PBS в тарелку.
- Возьмите Bioflex необработанные плиты и добавьте 2 мл раствора в каждую лунку (конечная концентрация ламинина составляет 2 мкг / см 2). Кроме того, другие белки ECM могут быть использованы, например, коллаген-1 [10 мкг / см 2], фибронектина [5 мкг / см 2], витронектин [0,5 мкг / см 2] или эластин [10 мкг / см 2]. Покрытие техника похожа на то, что описано в ламинин покрытие. Убедитесь, что скважины полностью покрыта раствором.
- Оберните плиты с пластиковым и поставить на 4 ° C на плоской поверхности ночью, чтобы ламинин адсорбировать на дно скважины. В этих условиях, плиты можно хранить в течение как минимум за неделю с сохранением хорошей функции ECM.
- На следующий день, в стерильных условиях, промыть лунки 3 раза 1X PBS.
- Промыть пластины 3 раза 1X PBS, чтобы удалить неадсорбированный белков.
- Держите пластин при 37 ° С в DMEM до клетки выделяют из шаг 2.14.
2. Выделение эмбриональных легких грызунов тип II эпителиальных клеток
За день до изоляции имеет экран с чашки разного размера нейлоновых сетках автоклавного и готово.
- Получить легкие плода от своевременного беременных мышей / крыс на E17-19 беременности. Передача ткани в 50 мл коническую трубку с DMEM среднего и разместить его на лед.
- Сделать пищеварения буфера в 50 мл коническую трубку: (10 мл). Для этого объема, легочной ткани, из примерно 20 плодов от мыши / крысы используется.
8,5 мл DMEM
0,5 мл 500 мм рН 7,4 HEPES
5 мг 1 коллагеназы
5 мг коллагеназы 1A
1 мл куриного сыворотки, инактивированной тепла - Хорошо перемешайте, пока все компоненты растворяются и процеживают через 0,2 мкм фильтр в шприц стерильным капотом. Поместите конические трубки, содержащей пищеварения буфера в водяной бане при температуре 37 ° C.
- Удалить среде DMEM с конической трубе с шагом 2.1 и передать ткань в стерильную чашку Петри.
- Фарш легких и стерильными ножницами или лезвием бритвы, чтобы ткань части менее 1 мм и передать ткань в коническую трубку с предварительно нагретым пищеварения буфера с шагом 2.3.
- Дайджест ткани с помощью пипетки вверх и вниз:
100 раз по 10 мл пипетки
100 раз по 5 мл пипетки
100 раз с пипетки Пастера - Центрифуга гомогената при 1300 оборотов в минуту в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Осторожно удалите супернатант аспирацией и вновь приостановить гранул содержащих клеток в 15 мл DMEM плюс 20% FBS.
- Выньте экран чашки с 100 -, 30 - и 15-микронной сетки и нейлона-е местоет на стерильные стаканы 150 мл.
- Добавить клетки гомогената с шагом 2,8 и последовательно фильтровать до 100 -, 30 - и 15-микронной чашки меш.
- Соберите слипаются нефильтрованное клеток из 30 - и 15-микронной сетки после нескольких стирок с DMEM с добавлением 10% FBS, чтобы облегчить фильтрацию без эпителиальных клеток.
- Откажитесь от фильтрата с 15-микронной сеткой, которая содержит в основном фибробласты.
- Очищать дальнейшей второго типа клеток путем инкубации клеток с шагом 2.11 в 75-см 2 колбах в течение 30 мин (approximatelly10 мл клеточной суспензии в колбе).
- Соберите супернатант и центрифуги в 1300 оборотов в минуту в течение 5 минут при комнатной температуре в гранулах клетки.
- Осторожно удалите супернатант аспирацией и вновь приостановить гранул содержащих клетки в бессывороточной DMEM. Объем ресуспендирования зависит от количества ткани обрабатываются. Примерно, мы пластины эквивалент клеток, полученных из одного плода в каждую лунку (2 мл) для того, чтобы ACHIНакануне между 60-70% слияния на следующий день.
- Пластина клеточной суспензии на Bioflex шесть луночных предварительно покрытые с ламинин и фибронектин.
3. Выделение эмбриональных фибробластов легких грызунов
- Выполните те же шаги, описанные выше, для изоляции II типа клеток до 2.11.
- Возьмите фильтрата с 15-микронной сеткой (без предварительной стирки, примерный объем 10-15 мл) и пластины на 75-см 2 при 37 ° С в течение 30-60 мин, чтобы фибробластов придерживаться.
- Аспирируйте supernantant и заменить бессывороточной DMEM и инкубировать в течение ночи.
- На следующий день, урожай клеток с 0,25% (вес / объем) трипсина в 0,4 мМ ЭДТА и пластины их Bioflex пластины предварительно покрытые с фибронектина.
4. Экспериментальная система для обеспечения механической стимуляции клетки легких
- Семенной клеток (около 50% сливной) на Bioflex пластин культуры в бессывороточной DMEM (2 мл / лунку), и пусть они придают и иметь благоприятныеобъявления, по крайней мере 6 часов до эксперимента. В целом наша лаборатория сохраняет клетки в культуре около 24 часа до применения механических напряжений. Если определенное количество клеток, необходимых для экспериментов, после изоляции, тип II клетки сохраняются в бессывороточной DMEM 75-см 2 колбах и на следующий день, клетки трипсином, рассчитывал, а затем высевают.
- На следующий день средства массовой информации заменяются свежей бессывороточной DMEM (2 мл / лунку) и bioflex плиты монтируются в Flexcell FX-5000 штамм группы. Монослоев должно быть не более 80% сливной до начала эксперимента.
- Equibiaxial деформации применяется для мембран. Режим деформации меняется в зависимости от моделирования механических сил в естественных условиях (см. обсуждение).
- Клетки, выращенные на без растянутой мембраны культивировали параллельно используется в качестве контроля.
- В конце эксперимента, монослои могут быть обработаны для анализа изменений в экспрессии генов (например, C белка ПАВ)в режиме реального времени по-PCR, белок обилие западных пятно и т.д. Кроме того, монослои могут быть установлены для иммуноцитохимии экспериментов. Для этой техники, после фиксации, силиконовые мембраны вырезали из пластины и монтируются на стеклах использование 10-20 мкл воды, установки агента до пермеабилизации и инкубации с антителами. Супернатант также может быть использован для изучения наличия факторов роста, цитокины и др.
5. Представитель результаты
Рисунках 1 и 2 показывают, представитель фазового контраста фотографии E18 плода мыши типа клеток II изолирован по методике, описанной в этой рукописи.
Рисунок 3 показывает, что механическое напряжение вызывает дифференциацию эмбриональных типа II эпителиальных клеток с помощью поверхностно-активных веществ белка C в качестве маркера.
Рисунок 1. Весставителем фазового контраста фотографии, сделанной сразу после изоляции показывает слипаются появление плода тип клеток II.
Рисунок 2. E18 плода тип II эпителиальные клетки выделяли, как описано здесь, и покрытие на bioflex плиты с покрытием из ламинина. Фотография была сделана на следующий день после того, как не-растянутые клетки фиксировали в параформальдегида. Чистоту клеток была определена в 90 ± 5% от микроскопического анализа морфологии эпителиальных клеток и иммуногистохимическое SP-C.
Рисунок 3. Плода тип II эпителиальные клетки подвергались воздействию 5% циклические деформации в 40 циклов / мин в течение 16 часов.) Северная пятном ПАВ протеина С (SP-C) экспрессию мРНК показывают, что штамм вызывает тип II дифференцировки клеток с помощью различных ECM субстратов . + / - Знаки представляют экспозиции или не собучения, соответственно. Данные представлены как среднее + / - SEM, п = 3; * P <0,05 В) флуоресцентных изображений иммуноцитохимии демонстрируя SP-C белка (зеленый) в эмбриональной клетки типа II подвергается или нет (контроля) на механическое напряжение.. Ядер контрастным DAPI (синий). Бар, 10 мкм. C) Вестерн блот результаты трех экспериментов показали, что механическое растяжение увеличивает SP-C белка. N = 3; * P <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы опишем метод, чтобы изолировать плода тип II эпителиальных клеток и фибробластов и подвергать их механическим раздражением использованием аппарата Flexcell деформации. Мы использовали этот метод для оценки дифференциации эпителиальных клеток 1,2 и изучение рецепторов и сигнальных путей активируется протяжении 3-9. Кроме того, этот метод может быть использован для исследования клеточных ответов индуцированных механических повреждений 10,11. Процедура основана на переваривание легочной ткани с коллагеназы. Он использует тенденцию тип клеток II собираться вместе после пищеварения. Важные шаги при выполнении этой техники измельчения ткани также для облегчения пищеварения легких и стиральные тщательно нефильтрованное клеток на 30 и 15 микрон сетки для облегчения фильтрации без эпителиальных клеток и, следовательно, для достижения большей чистоты элементов типа II .
Наша лаборатория использует мembranes покрытие с коллагеном или ламинин для моделирования состава ЕСМ из базальной мембраны. Однако, когда клетки подвергаются до 20% удлинении, клетки могут отделить от подложки во время растяжения и фибронектин следует рассматривать в качестве альтернативы подложки.
Еще одним важным фактором, чтобы избежать 100% слияния клеточного монослоя до растянуть, учитывая, что это может способствовать клетки к клетке, а не контакт клетка-матрица контактов и, следовательно, клетки, возможно, не «чувствуют» процент удлинения создана протокол.
Группа Flexcell Штамм использует вакуум, чтобы деформировать гибкую пластину культуры дно. Применение вакуумных тянется каждая мембрана над центральным цилиндром сообщение, создавая единый радиальных и кольцевых деформаций по поверхности мембраны и тем самым обеспечивая equibiaxial растяжение, подобные условия в естественных условиях (см. мультфильм, схема видео обзор, с разрешения доктора AJ Бэйнс Flexячейки международной корпорации, www.flexcellint.com). Эта система обеспечивает определенную, контролируемых статической или циклической деформации указанного режима напряжения. Для имитации движений плода дыхание режим циклического перегоне между 2,5-5% растяжение на 40-60 циклов / мин применяется. Существует не соглашение о процентах удлинения, что плод чувствует легкое в период внутриутробного дыхания. Некоторые авторы считают, что 5% растяжение подходит 12 в то время как другие исследователи утверждают, что на 2,5% больше представитель в условиях естественных 13,14. Чтобы имитировать постоянное давление живота, 2,5% непрерывный протокол растяжение используется. Чтобы имитировать повреждение легких, 20% циклическом протяжении 40 циклов / мин используется. Потенциальные ограничения этого метода включают увеличение деформации клетки высевают на поверхность мембраны периферических на загрузку почты. Еще одним ограничением является невозможность обеспечить удлинение больше чем на 15-20%, если высокая скорость цикла используются (более 40 циклов / мин).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддерживается NIH грант HD052670.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
