Summary
Forze meccaniche svolgono un ruolo chiave nello sviluppo del polmone e danno polmonare. Qui, descriviamo un metodo per isolare i roditori le cellule fetali del polmone di tipo II epiteliali e fibroblasti e di esporle alla stimolazione meccanica con un
Abstract
Forze meccaniche generate in utero da ripetitivi respiro, come movimenti e dalla distensione fluida sono fondamentali per lo sviluppo polmonare normale. Una componente chiave dello sviluppo del polmone è la differenziazione delle cellule epiteliali alveolari di tipo II, la principale fonte del surfattante polmonare. Queste cellule partecipano anche l'omeostasi del liquido nel lume alveolare, la difesa ospite, e la riparazione del pregiudizio. Inoltre, cellule parenchimatiche polmonari distali possono essere direttamente esposti al tratto esagerata durante la ventilazione meccanica dopo la nascita. Tuttavia, i precisi meccanismi molecolari e cellulari con cui le cellule polmonari rilevano stimoli meccanici di influenzare lo sviluppo del polmone e per promuovere danno polmonare non sono completamente compresi. Qui, forniamo un metodo semplice e di elevata purezza per isolare cellule di tipo II e fibroblasti dai polmoni fetali roditori. Poi, ci descrivono un sistema in vitro, The Unit Strain Flexcell, per fornire la stimolazione meccanica alle cellule fetali, la simulazione di forze meccaniche insviluppo fetale del polmone o lesioni ai polmoni. Questo sistema sperimentale fornisce un ottimo strumento per indagare i meccanismi molecolari e cellulari in cellule polmonari fetali esposte per allungare. Usando questo approccio, il nostro laboratorio ha identificato diversi recettori e proteine di segnalazione che partecipano in meccanotrasduzione nello sviluppo del polmone fetale e danno polmonare.
Protocol
1. Rivestimento di piastre con proteine ECM
- In condizioni sterili, miscelare 120 mg di laminina con 12 ml di freddo sterile 1X PBS per piastra.
- Prendere BioFlex lastre non trattate e aggiungere 2 ml della soluzione in ogni pozzetto (concentrazione finale di laminina è 2 ug / cm 2). In alternativa, altre proteine ECM potrebbero essere utilizzati, come collagene-1 [10 pg / cm 2], fibronectina [5 pg / cm 2], vitronectina [0,5 mg / cm 2] o elastina [10 pg / cm 2]. La tecnica di rivestimento è simile a quanto descritto per la laminina-rivestimento. Assicurarsi che i pozzetti sono completamente coperti dalla soluzione.
- Avvolgere le piastre con plastica e mettere a 4 ° C su una superficie piana notte per consentire la laminina di adsorbire al fondo dei pozzetti. In queste condizioni, piastre possono essere conservate per almeno una settimana, pur mantenendo buona funzione ECM.
- Il giorno dopo, in condizioni sterili, lavare i pozzetti per 3 volte con PBS 1X.
- Lavare le piastre 3 volte con PBS 1X per rimuovere le proteine non adsorbito.
- Conservare le piastre a 37 ° C in DMEM finché le cellule sono isolate dal passaggio 2,14.
2. Isolamento di cellule fetali di tipo roditore epiteliali polmonari II
Il giorno prima di isolamento hanno le coppe dello schermo con diverse maglie in nylon dimensioni autoclave e pronto.
- Ottenere polmoni fetali da timed-incinta topo / ratto sulla E17-19 di gestazione. Trasferire il tessuto in una provetta da 50 ml contenenti terreno DMEM e posizionarlo sul ghiaccio.
- Effettuare tampone digestione in una provetta da 50 ml: (10 ml). Per questo volume, il tessuto polmonare di circa 20 feti di topo / ratto viene utilizzato.
8,5 ml di DMEM
0,5 ml di 500 mM HEPES pH 7.4
5 mg Collagenasi 1
5 mg Collagenasi 1A
1 ml di siero di pollo, inattivato a caldo - Mescolare bene fino a quando tutti i componenti sono sciolti e filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron siringa all'interno della cappa sterile. Posizionare il tubo conico contenente il tampone di digestione in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Rimuovere il mezzo DMEM dal tubo conico da passo 2,1 e trasferire il tessuto in una piastra di Petri sterile.
- Macinare i polmoni e con forbici sterili o lama di rasoio per rendere pezzi di tessuto meno di 1 mm e trasferire il tessuto nel tubo conico contenente preriscaldata dal passaggio tampone digestione 2,3.
- Digerire il tessuto pipettando su e giù:
100 volte con 10 ml pipetta
100 volte con 5 ml pipetta
100 volte con pipetta Pasteur - Centrifugare l'omogeneizzato a 1.300 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere con cautela il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet contenente le cellule in 15 ml di DMEM più 20% FBS.
- Togliere le tazze schermo con 100 -, 30 - e 15-micron in nylon e mesh ° postoem su sterili 150 ml bicchieri.
- Aggiungi omogeneizzato cella dal punto 2.8 e filtrare in modo sequenziale attraverso il 100 -, 30 - e 15 micron tazze mesh.
- Raccogliere aggregata non filtrati cellule dal 30 - e 15-micron maglie dopo numerosi lavaggi con DMEM + 10% FBS per facilitare la filtrazione di non-cellule epiteliali.
- Eliminare il filtrato dai 15 micron in rete che contiene la maggior parte dei fibroblasti.
- Purificare ulteriormente cellule di tipo II incubando le cellule da 2,11 a passo 75-cm 2 flaconi per 30 min (approximatelly10 ml di sospensione cellulare per pallone).
- Raccogliere il supernatante e centrifugare a 1300 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente per agglomerare le cellule.
- Rimuovere con cautela il surnatante tramite aspirazione e risospendere il pellet contenente le cellule in DMEM privo di siero. Il volume di risospensione dipende dalla quantità di tessuto trattati. Approssimativamente, si piastra l'equivalente di cellule ottenute da un feto in ciascun pozzetto (2 ml) per Achieve tra il 60-70% di confluenza il giorno seguente.
- Piastra di sospensione della cella BioFlex sei pozzetti rivestiti con laminina e fibronectina.
3. Isolamento di fibroblasti fetali polmonari roditori
- Seguire la stessa procedura descritta in precedenza per l'isolamento delle cellule di tipo II fino a 2.11.
- Prendere il filtrato dal 15-micron mesh (senza lavaggio precedente; volume approssimativo è 10-15 ml) e sulla piastra 75-cm 2 a 37 ° C per 30-60 min per permettere fibroblasti di aderire.
- Aspirare il supernantant e sostituirlo con DMEM privo di siero e incubare durante la notte.
- Il giorno dopo, raccogliere le cellule con 0,25% (peso / vol) in tripsina 0,4 mM EDTA e piastra sulle placche BioFlex prerivestite con fibronectina.
4. Sistema sperimentale per fornire stimolazione meccanica alle cellule polmonari
- Seed le cellule (circa il 50% confluenti) su piastre di coltura BioFlex in DMEM privo di siero (2 ml / pozzetto) e farli attaccare e SPREad almeno 6 ore prima degli esperimenti. In generale il nostro laboratorio dispone di cellule in coltura per circa 24 ore prima di applicare sollecitazioni meccaniche. Se un numero specifico di cellule sono necessari per gli esperimenti, dopo l'isolamento, cellule di tipo II sono mantenute in DMEM privo di siero da 75 cm 2 flaconi ed il giorno successivo, le cellule vengono tripsinizzate, contate e quindi seminate.
- Il giorno dopo, vengono sostituiti con mezzi freschi DMEM privo di siero (2 ml / pozzetto) e le piastre BioFlex sono montati in un FX-5000 Flexcell unità Strain. Monostrati dovrebbe essere non superiore al 80% confluenti prima dell'inizio degli esperimenti.
- Ceppo Equibiaxial viene applicato alle membrane. Il regime di deformazione varia a seconda simulazione di forze meccaniche in vivo (si veda la discussione).
- Le cellule cresciute su membrane non stirati coltivate in parallelo vengono usati come controlli.
- Al termine degli esperimenti, monostrati possono essere elaborati per analizzare i cambiamenti di espressione genica (per esempio C proteina tensioattivo)dall'abbondanza proteina-PCR in tempo reale, mediante Western blot, ecc Inoltre, monostrati può essere fissata per esperimenti immunocitochimica. Per questa tecnica, dopo la fissazione, membrane silastic vengono tagliati dalle piastre e montate su vetrini utilizzando 10-20 microlitri di acqua come agente di montaggio prima permeabilizzante e l'incubazione con anticorpi. Il supernatante può anche essere usato per studiare la presenza di fattori di crescita, citochine, ecc
5. Rappresentativi risultati
Figura 1 e Figura 2 mostrano rappresentativi contrasto di fase fotografie di E18 cellule fetali di topo di tipo II isolato impiegando la tecnica descritta in questo manoscritto.
Figura 3 dimostra che induce sollecitazioni meccaniche differenziazione delle cellule fetali di tipo II epiteliali usando tensioattivo proteina-C come marcatore.
Figura 1. Reppresentante a contrasto di fase fotografia scattata subito dopo l'isolamento che illustra l'aspetto agglomerato di cellule fetali di tipo II.
Figura 2. E18 fetali di tipo II cellule epiteliali sono state isolate come descritto qui e piastrata su piastre rivestite con BioFlex laminina. Fotografia è stata scattata il giorno seguente, dopo non stirati cellule sono state fissate in paraformaldeide. La purezza delle cellule è stato determinato in 90 ± 5% mediante analisi microscopica della morfologia delle cellule epiteliali e immunocolorazione per SP-C.
Figura 3. Fetali di tipo II, cellule epiteliali sono state esposte a deformazione ciclica del 5% a 40 cicli al minuto per 16 ore. A) Northern blot della proteina C surfattante (SP-C) espressione di mRNA mostrano che il ceppo induce la differenziazione delle cellule di tipo II utilizzando diversi substrati ECM . Segni + / - rappresentano l'esposizione o di non sformare, rispettivamente. I dati sono presentati come media + / - SEM, n = 3; * P <0,05 B) immagini Immunocitochimica fluorescenza che dimostrano SP livelli di proteina-C (verde) nelle cellule fetali di tipo II o non esposti (controllo) alle sollecitazioni meccaniche.. I nuclei sono state contrastate con DAPI (blu). Bar, 10 pm. C) i risultati Western Blot di tre esperimenti che mostrano che si estendono meccanica aumenta la proteina SP-C. N = 3; * P <0,05.
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Discussion
In questo manoscritto, si descrive un metodo per isolare le cellule fetali di tipo II epiteliali e fibroblasti e di esporle alla stimolazione meccanica con l'apparecchiatura di Strain Flexcell. Abbiamo utilizzato questa tecnica per valutare la differenziazione delle cellule epiteliali 1,2 e di studiare recettore e vie di segnalazione attivate da tratto 3-9. Inoltre, questo metodo può anche essere usato per studiare le risposte delle cellule indotte da lesioni meccaniche 10,11. La procedura si basa sulla digestione del tessuto polmonare con collagenasi. Si avvale della tendenza di cellule di tipo II a raggrupparsi dopo la digestione. Importanti passi Durante questa tecnica di macinazione sono il tessuto e per facilitare la digestione del polmone e lavaggio a fondo le non filtrati celle 30 e 15 maglie micron per facilitare la filtrazione delle cellule non-epiteliali e quindi ottenere una maggiore purezza di cellule di tipo II .
Il nostro laboratorio utilizza membranes rivestito con collagene o laminina per simulare la composizione ECM delle membrane basali. Tuttavia, quando le cellule sono esposte a 20% di allungamento, le cellule potrebbero staccarsi dal substrato durante l'allungamento e fibronectina dovrebbe essere considerata come un substrato alternativo.
Un'altra considerazione importante è quello di evitare il 100% di confluenza monostrati di cellule prima allungare, dato che questo può promuovere cellula-cellula piuttosto che contatto cellula-matrice contatto e quindi le cellule non potrebbe "sense" la percentuale di allungamento istituito il protocollo.
L'unità Strain Flexcell utilizza un vuoto per deformare una piastra di coltura fondo flessibile. Applicazione del vuoto si estende ogni membrana sopra il perno centrale del cilindro, la creazione di uniforme tensione radiale e circolare su tutta la superficie della membrana e quindi fornire distensione equibiaxial, simile a quello in condizioni in vivo (vedi cartoon, video schematica panoramica, con il permesso, il dottor AJ Banes Flexcell International Corporation, www.flexcellint.com). Questo sistema offre una definito, deformazione controllata statico o ciclico dal regime ceppo specificato. Per simulare i movimenti respiratori fetali un regime ciclico tratto tra il 2,5-5% tratto a 40-60 cicli al minuto viene applicata. Non c'è accordo sulla percentuale di allungamento che rileva polmone fetale durante la respirazione fetale. Alcuni autori ritengono che il 5% distensione è di 12 adeguato, mentre altri ricercatori sostengono che il 2,5% è più rappresentativo della condizioni in vivo 13,14. Per simulare pressione costante distensione, un protocollo di 2,5% tratto continuo viene utilizzato. Per simulare danno polmonare, tratto ciclica del 20% a 40 cicli / min viene utilizzato. Limitazioni potenziale di questa tecnica sono l'aumento della deformazione di cellule inseminate nella zona periferica della membrana al posto di carico. Un'altra limitazione è l'incapacità di fornire allungamento maggiore di 15-20% se un tasso elevato ciclo viene utilizzato (sopra 40 cicli / min).
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Supportato da NIH concessione HD052670.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
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