Summary
의 연결을 네트워크를 개발 자발적인 활동은 칼슘에 민감한 지표 염료의 AM - 에스테르 양식을 사용하여 측정할 수 있습니다. 의 연결을 활성화를 나타내는 세포 내 칼슘의 변화는 하나 또는 두 개의 광자 이미징과 형광 표시기에 일시적 변화로 감지됩니다. 이 프로토콜은 발달 종속의 연결 네트워크의 범위에 대해 적용할 수 있습니다
Abstract
신경 시스템을 개발 활동의 특징 패턴은 자발적인 동기 네트워크 활동입니다. 동기 활동은 그대로 척수, brainstem, 망막, 피질과 dissociated의 연결을 문화 준비에서 관찰되었습니다. 자발적인 활동 기간 동안, 뉴런은 많은 이온 채널을 활성화, 단일 또는 행동 잠재력의 파열 화재 depolarize. 탈분극는 칼슘 유입을 중재 dendrites하고 쪽이에서 전압 - 문이 칼슘 채널을 활성화한다. 높은 동기 전기적 활동은 현장 전극을 사용하여 로컬의 연결을 네트워크에서 측정되었습니다. 이 기술은 하나의 전극에 의한 읽기 밖으로 여러 뉴런의 통합으로 높은 시간적 샘플링 속도지만, 낮은 공간 해상도를 수 있습니다. 의 연결 활동의 단세포 해상도는 활동을 발사 측정하는 하나의 뉴런에 패치 - 클램프 전기 생리학을 사용 할 수 있습니다. 그러나 네트워크에서 측정하는 능력 뉴런 패치의 수를 제한됩니다imultaneously, 그리고 일반적으로 하나 또는 두 개의 뉴런이다. 칼슘 의존 형광 표시기 염료의 사용은 세포의 네트워크를 통해 동기화된 활동의 측정을 활성화하고 있습니다. 이 기술 개발 네트워크의 자발적인 활동을 기록하는 높은 공간 해상도와 충분한 시간적 샘플링을 모두 제공합니다.
사전 및 초기 출생 후의 개발 기간 동안 새로 형성 피질과 hippocampal 네트워크의 주요 기능은 (; Khaziphov & Luhmann, 2006 카츠 & Shatz, 1996)의 연결 작업을 동기화, 자연입니다. 이 상관 네트워크 활동은 개발 신경계의 기능 회로의 세대 (Spitzer, 2006)에 필수적인 것으로 생각됩니다. 영장류와 설치류의 뇌 모두에서 초기 전기 및 칼슘 네트워크 파도가 관찰 사전 및 postnatally 생체내 및 시험 관내 (Adelsberger 외, 2005.; Garaschuk 외, 2000;.. Lamblin 외, 1999) 인치 몇 가지를 제어하는 것으로 알려져 있습니다 이러한 초기 활동 패턴,의 연결을 분화, synaptogenesis 및 소성 (. Rakic & Komuro, 1995; Spitzer 외, 2004)를 포함한 개발 프로세스는 대뇌 피질 회로의 올바른 발전과 성숙을 위해 매우 중요 있습니다.
이 주피터 비디오에서 우리는 대뇌 피질의 네트워크를 개발 이미지 자발적인 활동을하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 세포 esterase 활동이 앞을 세포막에 걸쳐 같은 Fura로 칼슘에 민감한 지표, 2 AM의 에스테르 확산 표시기 색소의 세포 impermeant 양식을 떠나 에스테르입니다. 표시기의 impermeant 형태는 다음 검색 및 intracellularly 칼슘 이온을 바인딩 수 있습니다 카르복실산 그룹을 가지고 ... 칼슘에 민감한 염료의 형광은 transiently 칼슘에 구속력에 따라 변경됩니다. 단일 또는 다중 광자 이미징 기술은 염료에서 방출되는 광자의 변화를 측정하는 데 사용하고, 따라서 세포 내 칼슘의 변경을 나타냅니다 있습니다. 또한, 이러한 칼슘 - Dependent 지표는 활성화된 네트워크 내에서 셀 유형을 조사하기 위해 다른 형광 마커와 결합 수 있습니다.
Protocol
1. 수평 entorhinal - hippocampal 뇌 조각 만들기
Entorhinal - hippocampal 뇌 슬라이스는 캔토, Wouterlood & Witter (2008) 신경 소성 ID가 381,243 9 따라 지역의 3D 개요에 대한 자세한 해부 가이드를 사용하여 만들어집니다.
- 최소한 20 분 동안 carbogen 가스 (95 % 산소, 5 % 이산화탄소)와 산소, 슬라이스 솔루션 500ml 확인 후 아이스 250ml까지 동결. 깔끔히 전에 분, 호감과 절개와 깔끔히 챔버의 절단에 사용되는 나머지 250ml 버블링 슬라이스 솔루션 슬라이스 얼음 조화.
- R - ACSF의 200ml (복구 ACSF) 및 e - ACSF (실험 ACSF) 솔루션 중 적어도 500ml하십시오. 조직 준비하기 전에 최소한 20 분 동안 carbogen 가스 (95 % 산소, 5 % 이산화탄소)와 지속적으로 산소를 모두 솔루션을 제공합니다.
- 이 프로토콜은 3 주 된 최대까지 0 출생 후의 생쥐 날로부터 유효합니다. 애니마 목을 벨난, 지역 윤리위원회 절차에 따라, 이상, 1 단계에서 준비가 얼음처럼 차가운 슬라이스 솔루션을 포함하는 배양 접시에 빠르게 두뇌를 해부하다 (솔루션 및 시약에 대해 표 1 참조).
- 슬라이스 솔루션 젖었 필터 종이에 머리를 전송하고 날카로운 면도날로 두 반구를 구분한다. 얼음처럼 차가운 슬라이스 솔루션에 다시 한 반구를 전송합니다.
- 다른 북반구의 소뇌를 제거합니다. 그 중간선에 두뇌를 플립하고 주동이의 끝을 향해 약간 각도로 두뇌의 상단을 잘라.
- 부드럽게 목화 버드와 함께 추진하여 거꾸로 기계의 조직 자로 컷 (지느러미) 표면과 접착제 그것에 머리를 플립.
- 1 단계에서 만든 나머지 얼음처럼 차가운 슬라이스 솔루션에 낮은 주파수와 속도를 사용하여 슬라이스 300 μm의 두께 뇌 슬라이스. 우리의 조건에서, 우리는 0.05 mm 설정 / s와 36Hz에서 써모 피셔 과학 vibratome을 (Microm, HM 650V)을 사용합니다.
- 으로실온에서.; 슬라이스가 절단되는 즉시, 산소 인공 세리 브로 척수의 유체 (ACSF) (표 2 참조 2.5mM MG 2 +, 1.6mM 칼슘 2 +)를 포함하는 슬라이스 홀더 (잠수)에 그것을 전송 R - ACSF에서 높은 마그네슘 농도가 깔끔히하고 우리의 경험에 다음과 같은 NMDA 수용체를 통해 신경 세포에 칼슘의 유입을 감소, 실험에 대한 슬라이스의 더 나은 품질로 안내합니다. 필요한 경우, 나중에 두 번째 대뇌 반구를 했네요.
- 복구 한 시간 슬라이스를 남겨주세요.
| 슬라이스 솔루션 (MM)를 - 10 | |
| 110 | 콜린 클로라이드 |
| 25 | NaHCO 3 |
| 11.6 | 11.6 |
| 10 | D - 글루코오스 |
| 7 | MgCl 2 |
| 3.1 | sodiumpyruvate |
| 2.5 | KCl |
| 1.25 | 아니 2 PO 4 |
| 0.5 | CaCl 2 |
표 1. 슬라이스 솔루션을위한 레시피.
| ACSF (MM)을 | |
| 125 | NaCl |
| 26 | NaHCO 3 |
| 10 | D - 글루코오스 |
| 3 | KCl |
| 2.5/1.5 | MgCl 2 (복구 / 실험) |
| 1.6 | CaCl 2 |
| 1.25 | 아니 2 PO 4 |
표 2. 모두 복구 (R - ACSF)과 실험 (E - ACSF) 솔루션을위한 레시피.
2. 얼룩의 채널의 준비호박
칼슘 의존 표시기 또는 셀 특정 마커와 세포를로드하려면, 조각은 얼룩 절차 챔버로 이송해야합니다. 상업 회의소를 사용할 수 있지만, 하나는 쉽게 아주 작은 비용에 대한 표준 실험실 장비에서 조립하실 수 있습니다. 이러한 챔버의 주요 기능은 조각 30 35 사이로 예열하는 아르 ° C, 지속적으로 산소 매체와 챔버가 빛으로부터 격리되어 incubated.
- 가열 막대를 사용하여, 통과하는 실리콘 튜브의 섹션 (직경 약 1.5mm)을 허용 충분 크다이 일회용 폴리스티렌 배양 접시의 측면 벽 (35 100mm 직경)에 작은 구멍을 확인하십시오.
- 스레드 실리콘 작은 배양 접시에있는 구멍을 통해 튜브와 작은 접시의 내부 벽 내부에 루프를 형성합니다.
- 튜브의 열린 끝을 밀봉하고 페트리 접시의 내부 벽에 튜브의 나머지 부분을 메모리에 superglue를 사용합니다. 바늘을 사용하여 내부 페트리 접시 내에 튜브에 균등하게 간격의 간격으로 미세 구멍을합니다.
- 정렬 양쪽 구멍 하나가 큰 내부 접착제는 작은 페트리 접시. 큰 페트리 접시의 벽에 구멍을 통해 실리콘 튜브의 다른 쪽 끝을 실.
- 인터페이스 요리, 세포 배양은 반 투과 막과 잘 삽입 가지고 열띤 메스를 사용하여 부화하는 동안 조각을 가질 얕은 접시를 떠나 멀리 가기 1cm를 잘라.
- 큰 페트리 접시의 뚜껑에 구멍 약합니다. 의회에 흐름에 carbogen (95% O 2, 5 % CO 2)를 허용하는 0.5 - 1cm 직경.
- 5 10ml 플라스틱 주사기를 가져가라. 가열 메스를 사용하여 주사기의 끝을 제거하고 팁과 주사기 튜브 몇 cm 길이를 유지하는 직각 절단합니다. superglue 사용하여 0.5 - 1cm 직경의 구멍을 통해, 페트리 접시의 뚜껑에 주사기 튜브의 절단 표면을 첨부합니다.
- 실리콘 튜브 및에서를 첨부주사기 팁에 커넥터를 ubing. 배양 접시의 기본을 입력 실리콘 튜브에 다른 튜브 커넥터를 연결합니다.
- carbogen (95% O 2, 5퍼센트 CO 2) 공급 레귤레이터로 두 튜브를 연결합니다. 30-35 사이에 부화를위한 뜨거운 접시에 얼룩 챔버 ° C. 놓으십시오 챔버는 전체 배양 과정에서 빛으로부터 격리 수 있는지 확인합니다. 얼룩 챔버는 이제 조립 및 슬라이스 보육을 위해 사용할 수 있습니다.
방법론 그림 1. 슬라이스 보육 (위)와 칼슘에 민감한 표시기 (아래 녹색 염료를 pipetted)의 애플 리케이션을 보여주는 얼룩 챔버의 크로스 섹션을 참조하십시오.
3. 조각의 얼룩
형광 염료와 관련된 모든 처리를 통해, 조금 가벼운 작업을하여 photobleaching 방지 및 염료와 T를 유지그 처리 사이의 어둠 속에서 조직을 얼룩.
- 열 플레이트 (35 ° C)에서 얼룩 챔버를 넣어 carbogen 가스 공급에 연결하고 슬라이스 홀더에서 약 1.5ml R - ACSF로 작성하십시오.
- 얼룩 챔버의 인터페이스 접시를 놓고 1ml ACSF로 작성하십시오.
- 부드러운, 안정된 속도로 ACSF의 버블링을 유지하기 위해 얼룩 챔버에 좋은 carbogen 공급을 보장합니다.
- 50 μg Fura 2 - AM의 유리병에 9 μl DMSO와 1 μl pluronic 산 (DMSO 재고 용액에 20 %, Invitrogen)를 추가합니다. 와동 15 분 염료 섞는다.
- 인터페이스 그릇에 조각 전송 및 50mM의 최종 염료 농도를 달성, 직접 같은 방법론 그림 1 (위)에 표시된 관심 hippocampal와 entorhinal 피질의 지역을 통해 R - ACSF에 염료를 피펫.
- 얼룩 챔버의 뚜껑을 닫고 20 염료 품어 - (표 3 참조) 동물의 연령에 따라 40 분.
- 트랜스다시 슬라이스 홀더에 슬라이스 그다지.
| 연령 (출생 후의 일) | 부화 시간 (분) |
| <P8 | 20 |
| P8 - p9 | 25 |
| p10 - p11 | 30 |
| P12 - 13 | 35 |
| > p13 | 40 |
표 3. 다른 연령대에 부화 시간은, 실험실에서 경험적으로 결정된.
4. 다른 염료 세 이상 조직
아마도 인해 뇌 조직에서 증가 myelination에, 나이가 설치류의 조각이 Fura 소요될하지 않는 것이 쉽게 에스테르 2 - AM. Cremophor EL (시그마)를 사용 preincubation 단계는 P13 및 11 세 이상의 생쥐의 두뇌에 사용되는이 염료의 이해를 촉진한다. Cremophor 많은 pharmaceutic에서 부형제로 사용 비 이온 계면 활성제입니다알 응용 프로그램. 이 단계없이, 우리는 세포에 특정한 라벨 너무나 가난하고 대뇌 피질의 슬라이스에 걸쳐 일관성 것을 발견했습니다.
- 3ml R - ACSF 및 ° C 3 분 35 가열 8 μl 0.5 % cremophor (시그마)로 가득 얕은 preincubation 요리로 오래된 조각 전송합니다.
- 인터페이스 접시에 슬라이스를 전송하고 일반적인 얼룩 절차 (단계 4-7 위 참조)를 따릅니다.
칼슘 염료는 슬라이스 준비 뉴런과 뉴런이 아닌 모두를로드합니다. 식별하고 네트워크 내에서 이러한 세포 유형을 구별하기, sulforhodamine 101 (SR101)이 슬라이스 내의 레이블 astrocytes하는 데 사용할 수 있습니다.
sulforhodamine 101에 대한 조각의 염색법
(섹션 3) 이전처럼 1-3 단계를 따르십시오.
-20 ° C에서 자사의 스토리지에서 sulforhodamine (시그마)의 10mM 재고 솔루션 1 μl를 타고 10 μm의 솔루션을 제공하기 위해 999 μl R - ACSF에 디졸브. 보라색 염료 오븐을 피펫이전처럼 음의 조각 (5-7 단계), 15 분 동안 잠복기 슬라이스를 떠나.
Microglia 및 내피 세포는 FITC 토마토 렉틴의 염료를 사용하여 레이블 아르
이전처럼 1-3 단계를 따르십시오.
2mg/ml Lycopersicon esculentum (토마토) 렉틴 FITC 공액 (L0401, 시그마) 20 μg / ML 농도를 제공 2.5ml R - ACSF에 재고 솔루션을 25 μl를 가져가라. 45분 동안 잠복기 조각 떠나 (단계 5-7) 이전과 조각 위에 염료를 피펫.
참고이 Fura 2 AM 또는 오레곤 그린 BAPTA - 1 모두 염료에서 광자 이후 스펙트럼의 녹색 범위에서 형광 (OGB - 1)가 방출됩니다 같은 칼슘에 민감한 지표로이 염료를 결합하는 것은 불가능합니다 중복 파장에서. 그러나, 지혜를 결합하기 위해 적절한 필터 또는 텍사스 레드 렉틴의 conjugates와 함께 사용할 수있는 등 칼슘 오렌지, Fura 레드 같은 다른 칼슘 표시기 염료가 없습니다녹색 스펙트럼의 H는 칼슘 지표 염료.
5. 녹화 실로 조각 첨부
동안 영상 조각은 현미경으로 안정해야합니다. 일반적으로 금속 하프는 조직을 잡아 위치하지만 unevenly 초점 이미징에 대한 전망이 분야의 일부만 제공 단면의 표면을 왜곡 수 있습니다. 이것을 방지하려면 슬라이스가 Polyethylenimine (PEI)를 사용하여 녹화 실로 붙어 있습니다.
- PEI 솔루션 (250ml 붕소의 버퍼 (표 4)에 1ml Polyethyleneimine 솔루션)를 준비합니다. PEI는 (야간 볶음)을 완전히 해소되었는지 확인합니다.
- 당신은 조각을 적용하려는 전에 바닥이 유체 최소 1 시간으로 덮여되도록 PEI 솔루션으로 레코딩 방을 채우기
- 증류수와 다음 보관 챔버에서 R - ACSF로 녹화 실 씻으십시오.
- 녹화 실에 한 조각을 전송합니다.
- 피펫과 위치 SL과 R - ACSF을 제거브러시를 사용하여 중간에 얼음.
- filterpaper 조각을 사용하여 슬라이스 주변의 R - ACSF을 제거합니다. 안정성과 준수를위한, 그것은 더 이상 조각 주위 ACSF이 없다하는 것이 중요합니다.
- 피펫 약 0.5 - 1ml ACSF, 슬라이스에, 기록 챔버의 크기에 따라 다릅니다. ACSF 단지 슬라이스 표면을 커버한다.
- carbogen와 perfused 큰 humidified 인터페이스 컨테이너로 슬라이스와 함께 녹음 챔버를 넣고, 그리고 조각이 적어도 한 시간 동안 회복하자.
| PEI 솔루션 | |
| 1ml | 폴리 (ethyleneimine) 솔루션 |
| 250ml 붕소의 버퍼 | |
| 40mM | 붕산 |
| 10mM | 나트륨 테트라 보 레이트의 decahydrate |
표 4. 레시피 PEI 솔루션입니다.
6. 임노화
칼슘 의존 지표 염료는 하나 또는 두 개의 광자 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 두 광자 이미징의 사용은 따라서 조직에서 빛의 산란의 양을 줄일 수, 관심 지역의 초점 볼륨 내의 지표 염료를 활성화됩니다. 또한, 그것은 슬라이스로 빛을 더 깊이 침투 수 있습니다.
기능성 칼슘 이미징을 위해 우리는 20x 목적 (NA 0.95)과 LaVision Biotec하여 Trimscope 시스템 올림푸스 현미경으로 일관된 결합하여 제공하는 티타늄 사파이어 레이저를 사용합니다. Trimscope 시스템은 동시에 64 beamlets와 스캐닝 프레임을 활성화하고 빠른 프레임 스캔 속도 하마 마츠 C9100 EM - CCD 카메라와 결합됩니다.
- 현미경으로 녹음 챔버 위치하고 최소 30보다 생리적 온도 ° C.로 가열 이미징 E - ACSF (1.6 칼슘 2 + / 1.5 MG 2 + 비율 (표 2))와 함께 안정적인 재관류를 확립
- Foc우리가 흰색 빛으로 조명을 사용하여 관심을 (ROI)의 지역으로. 더 이상 필요 이상으로 조명하기 위해 슬라이스를 노출하지 마십시오.
- 파장,보기의 영상 분야, 스캔 주파수, 픽셀 밀도 및 측정하고자하는 조직과 생물 학적 신호에 적용할 추가 소프트웨어 옵션을 선택합니다. Fura과 칼슘 네트워크 이미징을위한 2 - AM 우리가 일반적으로 820nm의 파장,보기가 250x250 μm의 이미징 분야 linescanning의 1200Hz의 주파수 및 2로 2 binning을 선택합니다. 따라서 약 100ms 약 10Hz의 영상 주파수의 frametime이 발생합니다.
- 투자 수익 (ROI)가 연속 스캔 모드와 laserlight 선택된 파장을 사용하여 초점 있는지 확인하십시오. 이미지의 픽셀 채도와 표백을 피하기 위해 집중하고 레이저 강도를 조정합니다.
- 투자 수익 (ROI)의 timelapse 영화를합니다. 우리는 일반적으로 2000 프레임 각각의 두 timelapse 영화를 취득.
- 셀 감지 및 식별을 위해 1 μm의의 stepsize을 사용하고 imag Z - 스택을 E + / 20 초점의 몇 군데 비행기 주위 μm의.
7. 대표 결과
칼슘 지표 성공적으로 로딩은 Fura 2 AM는 multiphoton 이미징을 사용하여 neocortical 및 entorhinal 피질의 네트워크를 개발 그림 1에 표시됩니다. 일부 염료는 여전히 조직지만 세포 소마와 어떤 경우에는 배경 얼룩으로 존재하는, 근위 dendrites 명확하게 표시 및 neuropil 주변에서 분리됩니다. 로딩이 성공하지 않은 경우, 매우 작은 셀 - 특정 얼룩을 준수하고 염료 명소의 작은 클러스터가 죽었 멤브레인 파편 슬라이스 표면에 종종 볼 수 있습니다 것입니다.
이 화면에서는 세포의 네트워크 동시 세포 이미징을위한 초점의 단일 비행기에서 명확하게 볼 수 있습니다. 금속 하프 또는 녹화 실로 슬라이스의 불완전한 고집의 사용은 몇 군데로 고르지 않은 슬라이스 표면에 발생할 수 있습니다.
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그림 1. Fura 2 - AM 에스테르로드 neocortical 개발 (A, 왼쪽)와 entorhinal (B, 오른쪽) 네트워크. 스케일 바는 100 μm의.
astrocytes에서 신경을 분리하려면 Fura과 sulforhodamine 101 공동 어플 리케이션 2 - AM 에스테르는 네트워크 내의 세포 유형의 분리 수 있습니다.
그림 2. sulforhodamine 101과 Astrocyte 라벨. Fura 2 AM 에스테르와 sulforhodamine 101 공동 상표. 여기 파장 : 820nm. 신경 세포 (위)과 astrocyte (아래)에서 파장 분리를위한 560/70nm에서 이색성 거울 PMTs의 이미지 모음입니다. B 대표 형광 흔적. 스케일 바 60 초, ΔF 10 (AU fluo).
그림 3. FITC - 복합 Lycopersicon esculentum (토마토) 렉틴의 염색법 . 마우스 해마 (A)와 표면 entorhinal 피질 (B)를 개발 microglia와 내피 세포의 Labelling.
칼슘 표시기 염료는 대뇌 피질과 hippocampal 네트워크 개발에 동시에 여러 세포에서 활동을 아웃 읽는 데 사용됩니다.
그림 4. hippocampal과 대뇌 피질의 네트워크에서 동적 칼슘 과도.
영화 1 : Fura 2 AM 초 출생 후의 주 동안 마우스 entorhinal 피질의 에스테르 로딩.
동영상 1 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2 : Fura 2 - AM 최초의 출생 후의 주 동안 마우스 해마의 에스테르로드합니다.
동영상 2 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 3 : 첫 번째 출생 후의 주 동안 마우스 피질의 Fluo - 4로드.
50movie3.avi은 "> 영화 3 볼하려면 여기를 클릭하십시오.
Fura의 경우 2 - AM 칼슘의 탈분극 유도 유입과 관련된 에스테르, 세포 활성화, 염료의 형광을 감소시킵니다. 이러한 Fluo - 4와 같은 염료 들어, 반대 사실이며 세포는 탈분극 광자 방출의 증가로 관찰됩니다. 체세포 칼슘 과도은 주로 측정되지만 큰 근위 dendrites의 활동 또한 영화 2에 표시된 일부 준비에서 볼 수 있습니다.
읽기 아웃 네트워크 활동은 상업적 또는 내부 소프트웨어 스크립트를 사용하여 계량하실 수 있습니다. 우리 실험실, 세포 식별과 네트워크 활동에 측정하고 Matlab (Mathworks)에 대한 내부 코드를 사용하여 반 자동화된 방식으로 분석했다.
그림 5. 개발 피질 네트워크에서 동기화된 칼슘 과도의 대표적인 분석. 하나 신경 세포의 3D 표현 (
Discussion
우리가 마우스에서 또한 쥐의 두뇌의 대뇌 피질과 hippocampal 네트워크를 개발 내에서 식별 세포의 네트워크 역학의 칼슘 이미징에 적합한 프로토콜을 보여주 여기 입증 방법. 이러한 방법은 suprathreshold 활동을 측정하는 동시에 세포 somas의 로컬 네트워크를 시각화하는 최적의 공간 해상도를 제공합니다. 일반적으로 개발 신경계에서 발견 긴 기간 suprathreshold 이벤트에 대한 소음 측정 : 네트워크 활동의 시간적 해상도는 신호를 최적화하기위한 프레임 수집 CCD 카메라 설정에 따라 다양한 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 개발 신경계 전반에 걸쳐 hippocampal와 대뇌 피질의 네트워크뿐만 아니라 레이블 세포에 국한되지 않습니다. 이 방법의 한계는 오직 suprathreshold 활동가 기록될 수 있습니다.
Disclosures
LaVision Biotec GmbH의 (빌레펠트, 독일)이 원고 문서의 제출 비용을 후원.
Acknowledgments
실험실에서 작업이 RMM에 Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) (917.10.372)에 의해 지원됩니다. JD는 EU FP7 BrainTrain 프로그램 (에 연관되어있다 www.brain - train.nl ). 우리는 FP multielectrode 배열 파형 및 비디오 시퀀스의 연결에 사용되는 문화의 이미지에 대한 피터 Laurens - Baljon와 사빈 Schmitz을 (모두 CNCR, VU 대학 암스테르담) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| Choline chloride | Sigma | C7527 | |
| cremaphor | Fluka | 27963 | Cremophor EL® |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | 16325 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F-1221 | special packaging |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 31437 | |
| NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
| Pluronic® F-127 | Invitrogen | P-3000MP | 20% solution in DMSO |
| sodium ascorbate | Sigma | A7631 | |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | |
| Lectin from Lycopersicon esculentum (tomato) | Sigma | L0401 | |
| Sulforhodamine 101 acid chloride | Sigma | S3388 | |
| Poly(ethyleneimine) solution | Fluka | P3143 | |
| boric acid | Sigma | B6768 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | B3545 | |
| PEI | |||
| Staining chamber | |||
| Syringe (5 or 10 ml) | Terumo | with luer lock | |
| Cell Culture Inserts for 6-well plates, 8.0 µm, transparent PET membrane | BD Falcon™ | 353093 | |
| Petri dish (35 and 100mm) | disposable, polystyrene | ||
| tubing and connectors | |||
| super glue | |||
| Holders and Chambers | |||
| Slice holder | submerged | ||
| Staining chamber | interface chamber | ||
| recording chamber | e.g. MEA probes | ||
| Imaging setup | |||
| Titanium Sapphire laser (Chameleon) | Coherent | ||
| Trim Scope | LaVision | 64 beams | |
| Microscope | Leica | High NA lense |
References
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
- Khazipov, R., Luhmann, H. J. Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents. Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).
- Spitzer, N. C. Electrical activity in early neuronal development. Nature. 444, 707-712 (2006).
- Adelsberger, H., Garaschuk, O., Konnerth, A. Cortical calcium waves in resting newborn mice. Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).
- Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., Konnerth, A. Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex. Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).
- Lamblin, Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary. Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).
- Rakic, P., Komuro, H. The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration. J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).
- Spitzer, N. C., Root, C. M., Borodinsky, L. N. Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice. Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).
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