Summary
हम पारंपरिक खमीर दो संकर स्क्रीनिंग, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने में एक प्रभावी उपकरण आनुवंशिक संशोधित किया है. इस संशोधन स्पष्ट रूप से प्रक्रिया shortens, काम का बोझ कम कर देता है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, झूठी सकारात्मक की संख्या को कम कर देता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है.
Abstract
(PGRN) progranulin भी granulin epithelin अग्रदूत (GEP) के रूप में जाना जाता है, एक 593 अमीनो एसिड autocrine वृद्धि कारक है. PGRN जल्दी embryogenesis, घाव 1 उपचार, सूजन 2, 3, और 4 रक्षा मेजबान सहित शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं की एक किस्म में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा जाना जाता है. PGRN neurotrophic 5 कारक है, और PGRN PGRN प्रोटीन कारण frontotemporal 6 मनोभ्रंश, 7 का आंशिक नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप जीन में उत्परिवर्तन के रूप में भी कार्य करता है. हमारे हाल ही के अध्ययन उपास्थि विकास और 8-11 गिरावट का एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में PGRN के अलगाव के लिए नेतृत्व किया है. हालांकि PGRN, लगभग दो दशक पहले की खोज की, कई शारीरिक और रोग की स्थिति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, PGRN की कार्रवाई का फायदा उठाने के लिए और शामिल तंत्र को समझने के प्रयासों को काफी हमारी असमर्थता के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है करने के लिए अपने बाध्यकारी रिसेप्टर (ओं) की पहचान है. इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम एक मोदी विकसितfied खमीर दो संकर (MY2H) सबसे अधिक इस्तेमाल किया GAL4 2 संकर आधारित प्रणाली पर आधारित दृष्टिकोण. पारंपरिक खमीर दो संकर स्क्रीन के साथ तुलना में, MY2H नाटकीय रूप से स्क्रीन प्रक्रिया shortens और झूठी सकारात्मक क्लोन की संख्या कम कर देता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है, और हम सफलतापूर्वक विभिन्न फँसाना चाहे का बंधनकारी प्रोटीन आयन चैनल 12, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन 10, 13, और वृद्धि कारक 14 सहित, को अलग करने में इस प्रणाली कार्यरत है. इस पत्र में, हम विस्तार में एक उदाहरण है कि पहली ज्ञात PGRN जुड़े 14 रिसेप्टर, 15 के रूप में TNFR2 की पहचान करने के लिए नेतृत्व के रूप में PGRN उपयोग इस MY2H प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन.
Protocol
1. पृष्ठभूमि जानकारी
खमीर प्रणाली दो संकर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत 16, 17 की खोज के लिए एक शक्तिशाली आनुवंशिक तकनीक का इस्तेमाल है. LexA आधारित सिस्टम, मुसीबत का इशारा भर्ती प्रणाली, और बैक्टीरिया या स्तनधारी सेल आधारित 2 संकर के रूप में 2 संकर प्रणाली, के कई प्रकार के उपलब्ध वाणिज्यिक कर रहे हैं, इस कागज विशेष रूप से सबसे अधिक इस्तेमाल किया GAL4 आधारित संशोधन पर ध्यान केंद्रित 2 संकर खमीर प्रणाली. संक्षेप में, विधि खमीर GAL4 प्रोटीन है कि डीएनए बाध्यकारी और transcriptional सक्रियण के लिए जिम्मेदार वियोज्य डोमेन के होते हैं के गुणों पर आधारित है. चारा प्रोटीन GAL4 डीएनए बाध्यकारी डोमेन (डीएनए - बी) के एक संलयन के रूप में व्यक्त किया है, जबकि शिकार प्रोटीन GAL4 सक्रियण डोमेन (ई.) के fusions के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. चारा और शिकार संलयन प्रोटीन के बीच बातचीत GAL4 बाध्यकारी संवाददाता जीन युक्त साइटों है कि खमीर छ में एकीकृत कर रहे हैं के transcriptional सक्रियकरण की ओर जाता है हैenome. Y2H के सिद्धांत चित्र में सचित्र है. 1 और प्रयोगात्मक प्रक्रिया छवि में सारांशित है. 2.
2. आवश्यक सामग्री और समाधान
- YPD ग्रोथ मध्यम (peptone का एक मिश्रण, खमीर निकालने, और सबसे Saccharomyces cerevisiae उपभेदों उगाने के लिए इष्टतम अनुपात में dextrose).
- मिनिमल एसडी ठिकानों (मिनिमल सिंथेटिक परिभाषित अड्डों (एसडी) एक खमीर नाइट्रोजन बेस, अमोनियम सल्फेट, और एक कार्बन स्रोत, dextrose शामिल छोड़ने वालों की खुराक (DO) मिनिमल एसडी बेस के लिए जोड़ा जा सकता है है एक सिंथेटिक, परिभाषित निर्दिष्ट कमी मध्यम. ) पोषक तत्वों.
- लियू / - टीआरपी (DO) छोड़ने वालों की पूरक (leucine और tryptophan के लिए अलावा हर आवश्यक अमीनो एसिड युक्त)
- -His/-Leu/-Trp/-Ura (DO) छोड़ने वालों की अनुपूरक (leucine, tryptophan, हिस्टडीन, और uracil के लिए छोड़कर हर आवश्यक अमीनो एसिड युक्त)
- Luria (पौंड) शोरबा (Tryptone 10 छ / एल, खमीर निकालने 5 छ / एल, NaCl 5 / जी एल)
- एक्स- लड़की (5 ब्रोमो - 4 क्लोरोफ्लूरोकार्बन 3 indolyl-β-डी galactopyranoside) समाधान: एक 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्टॉक एन में समाधान, एन Dimethylformamide के रूप में तैयार
- 10X ते (100 मिमी Tris - एचसीएल (पीएच 7.5), 10 मिमी EDTA, autoclaved)
- Sonicated हेरिंग या सलमोन शुक्राणु डीएनए, उबला हुआ (10 मिलीग्राम / एमएल)
- 10X LiAc (1 एम लिथियम एसीटेट, autoclaved)
- 50% खूंटी +३३५० समाधान, फिल्टर निष्फल
- 3 अमीनो-1, 2, 4-Triazole (3AT)
- Kanamycin
- एम्पीसिलीन
- ELECTROMAX DH5α कोशिकाओं
- Z बफर: 16.1 छ Na2HPO4 7H2O (या 8.52 छ निर्जल), 5.5 छ NaH2PO4 H2O (या 4.8 ganhydrous), 0.75 छ KCl, 0.246 MgSO4 छ 7H2O (या 0.12 छ निर्जल), 1 एल autoclaved, आसुत जल में भंग करने के लिए समायोजित 7.0 पीएच.
3. चारा पीढ़ी (pDBLeu - PGRN)
एक सीडीएनए टुकड़ा एन्कोडिंग संकेत पेप्टाइड (aa21-588) की कमी PGRN directionally साल मैं नहीं मैं pDBLeu वेक्टर की साइटों (ProQuest दो संकर प्रणाली, Invitrogen) में क्लोन किया गया था,GAL4 डीएनए बाध्यकारी डोमेन के रूप में एक ही अनुवाद पढ़ने फ्रेम pDBLeu - PGRN उत्पन्न करने के लिए रखे हुए हैं.
- PGRN के सीडीएनए टुकड़ा पीसीआर द्वारा ऊपर वर्णित oligonucleotide प्राइमरों प्रतिबंध साइटों (5'end साल मैं और नहीं मैं 3'end में) फ्रेम संलयन की अनुमति शामिल करने के लिए डिज़ाइन का उपयोग बढ़ाना.
- जेल पीसीआर उत्पाद शुद्ध, प्रतिबंध के साथ पचाने में साल मैं और नहीं मैं endonucleases
एक ही प्रतिबंध endonucleases के साथ डबल प्रतिबंध पाचन द्वारा DB वेक्टर pDBLeu तैयार करें. - Linearized pDBLeu वेक्टर में प्रतिबंध PGRN टुकड़ा कटी घमनी को बांधना और लेग के लिए चयन के साथ DH5α में बदलना + 25 μg / मिलीलीटर में kanamycin.
- सुधार के निर्माण के डीएनए अनुक्रमण द्वारा सत्यापित करें.
4. प्लाज्मिड चारे की लघु परिवर्तन
- Mav203 (Invitrogen) के एक कॉलोनी के साथ YPD के 5 मिलीलीटर टीका लगाना, 30 में रातोंरात हिला ° सी.
- YPD के 50 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति पतला. जोड़ने के आगे बढ़ेंitional 2-4 घंटे.
- गोली आरटी पर 5 मिनट के लिए 3000 rpm पर कोशिकाओं. Autoclaved, आसुत पानी की 40 मिलीलीटर में गोली Resuspend.
- पुन: गोली कोशिकाओं. मैं, आरटी 10 मिनट पर सेते समाधान के 2 मिलीलीटर में Resuspend.
समाधान मैं: 0.5 मिलीलीटर 10xLiAc, 0.5 मिलीलीटर 10xTE, 4 मिलीलीटर एच 2 हे - PDBLeu - PGRN के 2-3 μl (0.25μg/μl) और विकृत, sheared सामन शुक्राणु डीएनए (10μg/μl) के 10 μl: ट्यूबों करने के लिए डीएनए बग़ैर. 100μl खमीर कोशिकाओं को जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से.
- 700μl समाधान II जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से. 30 डिग्री 30 मिनट के लिए सी सेते हैं. समाधान द्वितीय: 0.2 मिलीलीटर 10xLiAc, 0.2 मिलीलीटर 10xTE, 1.6 मिलीलीटर 50 PEG3350%.
- पर 42 हीट सदमे ° सी 15 मिनट के लिए.
- 2 मिनट के लिए गोली. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. 200 μl autoclaved, आसुत जल में गोली Resuspend.
- प्लेट धारावाहिक dilutions के साथ एसडी लियू प्लेटों पर निलंबन. 30 ° C पर 2-3 दिनों के लिए थाली सेते हैं.
5. चारा मान्यता
Yea के प्रदर्शन से पहलेसेंट दो संकर स्क्रीन आत्म सक्रियण के लिए pDBLeu PGRN परीक्षण और बेसल HIS3 रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण. यह परीक्षण यह निर्धारित करता है कि क्या फँसाना चाहे प्रतिलेखन सक्रिय करने और चाहे आत्म सक्रियण inhibitors के द्वारा neutralized जा सकता. 3 अमीनो-1, 2, 4 triazole (3 पर) HIS3 जीन उत्पाद की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध करनेवाला है और HIS3 हिस्टडीन की कमी मीडिया पर विकास के लिए आवश्यक अभिव्यक्ति के न्यूनतम स्तर टाइट्रेट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- खमीर Mav203 तनाव, थाली एसडी लियू प्लेटों पर परिवर्तन में pDBLeu PGRN रूपांतरण, और 30 में 48-72 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- प्रत्येक परिवर्तन से पैच कालोनियों पर autoclaved toothpicks का उपयोग एसडी - लियू-10 मिमी की सांद्रता में उनकी 3 - एटी युक्त प्लेटें, 25 मिमी, 50 मिमी, 75 मिमी और 100 मिमी. 3 - एटी HIS3 एंजाइम और केवल फँसाना चाहे कि आत्म सक्रियण प्रदर्शन के प्रतिस्पर्धी अवरोध करनेवाला है 3 - एटी की उपस्थिति में विकसित करने में सक्षम हो जाएगा.
- चारा उपभेदों कि प्लेटों containi बढ़ने परएनजी 3 - एटी 100 मिमी दो संकर स्क्रीन में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त नहीं हैं. फँसाना चाहे कि इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए, एकाग्रता है कि सेल के विकास को रोकता है एटी 3 न्यूनतम का उपयोग करें. कई मामलों में, 3 - एटी के 25 मिमी स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है.
6. सीडीएनए लाइब्रेरी स्क्रीनिंग
प्लाज्मिड pDBLeu - PGRN MaV203 में शुरू की है ऊपर वर्णित के रूप में एक छोटे पैमाने पर परिवर्तन का उपयोग कर. MaV203 (pDBLeu - PGRN) में pPC86 - पुस्तकालय (Invitrogen) पेश करने के लिए, प्रक्रिया नीचे वर्णित आमतौर पर प्लाज्मिड पुस्तकालय डीएनए के 0.5 μg के साथ 4 ~ 4 x 10 कालोनियों देता है. इसलिए, 2.5 x 10 6 खमीर transformants ~ 30.0 pPC86 सीडीएनए μg लायब्रेरी प्लास्मिड डीएनए, 25 परिवर्तनों, और पचास 10 सेमी प्लेटें (एटी 3 एसडी लियू - टीआरपी उनकी-ura) की आवश्यकता होगी.
- प्लेट (50 नीचे दी गई प्रक्रिया के लिए) 10 सेमी 3 एसडी लियू - टीआरपी उनकी-ura की उपयुक्त संख्या पर तैयार करें. इसके अलावा transformants की संख्या का आकलन करने के लिए कम से कम चार 10 सेमी एसडी लियू टीआरपी प्लेटें तैयार करते हैं.
- में पुस्तकालय रूपांतरणप्रक्रिया के अनुसार pDBLeu - PGRN युक्त MaV203 नीचे वर्णित है.
- MaV203 के कई पृथक ~ 100μl autoclaved, आसुत जल में (pDBLeu PGRN) कालोनियों को निरस्त करने और उन्हें एक 10 सेमी एसडी लियू थाली पर फैल गया. एक दूसरे की थाली एसडी लियू के लिए प्रक्रिया दोहराएँ. 18-24 घंटे के लिए 30 पर दोनों प्लेटों सेते डिग्री सेल्सियस
- परिमार्जन और पूरी तरह से 10 मिलीलीटर autoclaved, आसुत जल में निलंबित कोशिकाओं. एक कुप्पी में तरल YPD माध्यम से 500 मिलीलीटर के लिए सेल निलंबन की एक पर्याप्त मात्रा जोड़ें 0.1 ~ 600 आयुध डिपो दे .
- सत्यापित करें कि आयुध डिपो टीका के बाद 0.1 ~ है.
- 30 में हिलाओ डिग्री सेल्सियस के 600 आयुध डिपो तक 0.4 ~ तक पहुँचता है.
- ताजा तैयार:
- 110 मिलीलीटर 1X ते / 11 मिलीलीटर 10X ते, 11 मिलीलीटर 10X LiAc, और 88 मिलीलीटर autoclaved पानी के संयोजन के द्वारा LiAc.
- 16 मिलीलीटर खूंटी / LiAc 1.6 मिलीलीटर 10X ते, 1.6 मिलीलीटर 10X LiAc, और 12.8 मिलीलीटर 50% खूंटी +३३५० के संयोजन के द्वारा.
- गोली 3000g पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं.
- टी त्यागेंsupernatants और वह धीरे pipetting और 100 मिलीलीटर autoclaved, कमरे के तापमान पर आसुत जल में नीचे से गोली resuspend.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए जी 3000 में अपकेंद्रित्र.
- Centrifuged कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 50 मिलीलीटर 1X ते / LiAc समाधान में सेल गोली resuspend.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए जी 3000 में अपकेंद्रित्र.
- Supernatants निकालें और 2.5 मिलीलीटर 1X ते / LiAc समाधान के अंतिम मात्रा में गोली resuspend.
- 25 परिवर्तनों प्रदर्शन. 2.5 मिलीलीटर कोशिकाओं, 125 (10μg/μl) μl विकृत, sheared सामन शुक्राणु डीएनए, और 30 μg सीडीएनए लाइब्रेरी का मिश्रण. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स. 15 मिलीलीटर / खूंटी LiAc समाधान जोड़ें और धीरे मिश्रण. 25 में अशेष भाजक 1.5 मिलीलीटर 700 प्रत्येक μl के microcentrifuge ट्यूबों autoclaved.
- एक 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए गर्मी झटका.
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 6,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र. ध्यान सुपर हटायेंतैरनेवाला. धीरे 400 μl autoclaved, आसुत जल में ऊपर और नीचे pipetting द्वारा प्रत्येक गोली resuspend.
- प्लेट एक 10 सेमी 3 एसडी लियू - टीआरपी उनकी-ura एटी (3AT एकाग्रता: 25 मिमी) पर प्रत्येक परिवर्तन से 200 μl परिवर्तन मिश्रण प्लेटें एक फैल पट्टी का उपयोग, तो 25 autoclaved 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों 50 प्लेटें कर सकते हैं (एसडी लियू - टीआरपी उनकी-ura 3 एटी).
- 30 में 5-10 दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए सेते प्लेटें
- एसडी लियू टीआरपी थाली पर चढ़ाया; परिवर्तन करने के लिए प्रतिक्रिया की दक्षता, (1:400 और 1:4000 01:40) प्रतिक्रिया के धारावाहिक dilutions का अनुमान है. 30 में 3 दिन ° सी, कालोनियों की संख्या गिना जाता है और गणना transformants की कुल संख्या के लिए incubating के बाद.
7. एक्स - लड़की परख
- YPD थाली कालोनियों स्थानांतरण, 30 में सेते डिग्री सेल्सियस रातोंरात.
- YPD थाली पर प्लेस nitrocellulose झिल्ली गोल, झिल्ली और YPD प्लेट के बीच कोई बुलबुले हैं सुनिश्चित करें. 1-2 के बाद मिनट, MAके लिए सुनिश्चित करें कि सभी कालोनियों झिल्ली (कागज nitrocellulose) के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.
- एल्यूमीनियम पन्नी कागज के साथ की गई नाव में झिल्ली कॉलोनी की ओर रखें.
- तरल नाइट्रोजन में झिल्ली रखो, तरल नाइट्रोजन में मिनट के एक जोड़े के लिए बीस सेकंड, और डूब इंतजार.
- गलना झिल्ली ले लो.
- इस बीच निम्नलिखित अभिकर्मक मिश्रण:
1.5ml जेड बफर
20μl एक्स - लड़की (20 मिलीग्राम / एमएल) - जेड बफर / एक पेट्री डिश में एक्स - लड़की, उस के शीर्ष पर जगह वाटमान कागज गिरा.
- वाटमान कागज के शीर्ष पर ध्यान nitrocellulose कागज जगह.
- 37 ° सेते तक नीले कालोनियों दिखाई देते हैं.
8. Retransformation परख
शिकार संलयन प्रोटीन (AD - वाई) लाइब्रेरी स्क्रीनिंग से अलग चारा संलयन प्रोटीन (DB एक्स) के साथ बातचीत करने के लिए रिपोर्ट जीन प्रेरित बनाए रखने, और चाहिए शिकार क्लोन और चारा retransformation खमीर में निर्माण और झूठी सकारात्मक को समाप्त कर सकते हैं और जोड़ने को सुविधाजनक बनाने केitional विश्लेषण.
- खमीर उपभेदों से प्लास्मिड डीएनए संभावित बातचीत प्रोटीन युक्त अलग.
- ई. कोलाई में डीएनए रूपांतरण DH5α कोशिकाओं, लेग पर परिवर्तनों प्लेट 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन प्लेटें चुनिंदा pPC86 - सीडीएनए पुस्तकालय अलग, और 37 पर रात में सेते डिग्री सेल्सियस
- थाली से कई कालोनियों उठाओ लेग में 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन शोरबा डाल.
- Miniprep डीएनए तैयार है और साल मैं और नहीं मैं के साथ डबल प्रतिबंध विश्लेषण द्वारा जांच
- प्लाज्मिड शिकार और चारा प्लाज्मिड सह MaV203 में परिणत करने के लिए, थाली प्लेटों पर अनुसूचित जाति लियू - टीआरपी परिवर्तन मिश्रण, और 30 में 2-3 दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए सेते
- अनुसूचित जाति लियू - टीआरपी थाली से तीन अलग अलग कालोनियों उठाओ, एक्स - लड़की परख करते हैं.
9. अनुक्रमण और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण
अनुक्रम प्लास्मिड डीएनए कि संभावना सच सकारात्मक क्लोन से पृथक किया गया, GenBank में उन BLA का उपयोग करने के लिए इन दृश्यों की तुलनाअनुसूचित जनजाति के कार्यक्रम, और उन दो संकर क्लोन है कि ज्ञात जीन के अनुरूप की पहचान. अनुक्रमण डेटा से पता चला है कि दो 12 से ऊपर प्राप्त सकारात्मक के सेल सतह TNFR2 (TNFRSF1B/CD120b, परिग्रहण # NM_130426) थे. इसके अलावा, PGRN और TNFR के बीच बातचीत विभिन्न प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत assays, इन विट्रो में ठोस चरण बंधन परख, सह immunoprecipitation, भूतल plasmon अनुनाद विश्लेषण, और प्रवाह cytometry परख 14 सहित का उपयोग कर सत्यापित किया गया था.
10. प्रतिनिधि परिणाम
स्क्रीनिंग के प्रवाह चार्ट छवि में उल्लिखित है. 3. 50-100 आमतौर पर सकारात्मक क्लोन उम्मीदवारों के इस कदम पर प्राप्त हो जाएगा. हम शुरू में 2.5 मिलियन PGRN चारे के साथ जांच transformants के बीच 54 उम्मीदवारों सकारात्मक क्लोन अलग. सकारात्मक क्लोन उम्मीदवारों तो एक्स - लड़की परख प्रदर्शन द्वारा सत्यापित किया गया. आमतौर पर, लगभग 50% झूठी सकारात्मक क्लोन एक्स - लड़की परख के माध्यम से हटा रहे हैं. हम 23 सकारात्मक खरा क्लोन प्राप्त PGRN चारा (4 छवि) के लिए इस कदम पर ates . शिकार क्लोन और खमीर में चारा का निर्माण Retransformation आगे झूठी सकारात्मक और क्लोन है कि अभी भी सक्रिय रिपोर्टर जीन संभावना सच सकारात्मक का प्रतिनिधित्व करते हैं खत्म. आमतौर पर, लगभग 50% सकारात्मक क्लोन उम्मीदवारों को हटा दिया जाएगा. हम अंत में 12 सकारात्मक क्लोन है कि खमीर में PGRN के साथ बातचीत पृथक.
चित्रा 1 दो संकर प्रणाली खमीर के सिद्धांत.
चित्रा 2 प्रोटीन बाध्यकारी दो संकर खमीर प्रणाली का उपयोग भागीदारों की पहचान की पाइपलाइन .
चित्रा 3 स्क्रीनिंग खमीर के फ्लो चार्ट पुस्तकालय दो संकर.rge.jpg "लक्ष्य ="> इस छवि का एक पूर्ण आकार संस्करण को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें _blank ".
चित्रा 4. सकारात्मक क्लोन उम्मीदवारों की परख बीटा Galactosidase. एक, सकारात्मक पुस्तकालय स्क्रीन से प्राप्त क्लोन YPD थाली करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया और 30 ° रातोंरात सी incubated, बी, YPD प्लेट पर सभी कालोनियों nitrocellulose झिल्ली को हस्तांतरित किया गया और बीटा galactosidase परख प्रदर्शन किया.
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Discussion
दो संकर खमीर स्क्रीनिंग के लिए प्रोटीन बातचीत 16, 17 की पहचान करने में एक प्रभावी उपकरण साबित हो गया है . , प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए अन्य जैव रासायनिक सह शुद्धि और प्रोटीन चिप्स, दो संकर प्रणाली एक संवेदनशील आनुवंशिक दृष्टिकोण है कि एक अपेक्षाकृत सरल प्रयोग में कोडन दृश्यों का बहुत ही उच्च संख्या स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है खमीर के रूप में दृष्टिकोण के साथ तुलना में इसके अलावा, यह vivo बातचीत में पता लगाता है और जटिल प्रोटीन शुद्धि की आवश्यकता नहीं है. बेशक खमीर के दो संकर प्रणाली सीमाएँ हैं, उदाहरण के लिए, आवश्यक संशोधनों के बाद translational, अपर्याप्त तह और / या एक संलयन प्रोटीन की स्थिरता, और बदल subcellular स्थान के अभाव (प्रोटीन नाभिक को लाया जाता है और यह हो सकता है हो) नहीं वास्तविक शारीरिक राज्य. इसके अलावा, प्रोटीन है कि रिपोर्टर जीन, जैसे आत्म activators, नकली सक्रियण प्रदर्शन सीधे फँसाना चाहे के रूप में शिकार सीडी स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता हैएनए पुस्तकालयों. आदेश में इस खामी को दूर करने के लिए, के बजाय व्यक्तिगत कार्यात्मक डोमेन बरकरार प्रोटीन, आमतौर पर बरकरार प्रोटीन के साथ विभिन्न तरीकों का उपयोग कर बातचीत की वैधीकरण के बाद फँसाना चाहे के रूप में इस्तेमाल किया जाता है. उदाहरण के लिए, हम सफलतापूर्वक ADAMTS-7 metalloproteinase और progranulin COMP के बंधन भागीदारों के एक 10 चारा, 13 के रूप में COMP के EGF की तरह डोमेन का उपयोग कर के रूप में वृद्धि कारक अलग है.
पारंपरिक स्क्रीनिंग प्रक्रिया में समय लगता है, के बाद से खमीर transformants पहली शून्य से तीन प्लेटें (एटी एसडी लियू - टीआरपी उनकी तीन) पर चढ़ाया जाता है उसकी + क्लोन, जो तब दूसरा ऋण तीन प्लेट (एसडी करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं का चयन ) एटी ura चयन के लिए तीन - लियू-TRP - ura. इसके अलावा, सकारात्मक क्लोन के हजारों की प्रतिकृति विशेष उपकरण की जरूरत है, और इस स्क्रीन की प्रक्रिया अक्सर झूठी सकारात्मक की एक बड़ी संख्या में परिणाम है. हम सीधे शून्य से चार (एसडी लियू - टीआरपी उनकी-ura 3 एटी) के बजाय दो प्लेटें minu पर खमीर transformants मढ़वायाएस तीन प्लेटें, क्योंकि सच बातचीत क्लोन साथ ही रिपोर्टर constructs (अर्थात् उत्पादन हिस्टडीन, और uracil) खमीर जीनोम में एकीकृत के सभी सक्रिय और शून्य से चार प्लेटों पर जीवित रहने चाहिए सक्षम होना चाहिए (एसडी लियू - टीआरपी उनकी - ura 3) एटी. इस संशोधन स्पष्ट रूप से प्रक्रिया (जैसे 10-20 दिनों पारंपरिक स्क्रीनिंग प्रक्रिया आम तौर पर लेता है, जबकि 5-10 दिनों संशोधित स्क्रीन प्रक्रिया केवल की जरूरत है) shortens, काम का बोझ कम कर देता है, और सबसे महत्वपूर्ण, झूठी सकारात्मक की संख्या को कम कर देता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है, और हम सफलतापूर्वक सोडियम चैनल 12 और बाह्य मैट्रिक्स 10 प्रोटीन, 13 सहित विभिन्न फँसाना चाहे, बंधनकारी प्रोटीन को अलग में इस संशोधित प्रणाली कार्यरत है. हाल ही में, हम इस दृष्टिकोण 14, 15 का उपयोग TNF रिसेप्टर्स के एक उपन्यास ligand के रूप में PGRN की पहचान, भविष्य इस वृद्धि कारक से संबंधित खोजों के लिए एक ठोस नींव प्रदान करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NIH अनुसंधान K01AR053210 अनुदान, R01AR061484 और राष्ट्रीय Psoriasis फाउंडेशन से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ProQuest two-hybrid system | Invitrogen | 10835 | |
| YPD Growth Medium | Clontech Laboratories | 630409 | |
| YPD Agar Medium | Clontech Laboratories | 630410 | |
| Minimal SD agar Base | Clontech Laboratories | 630412 | |
| -Leu DO Supplement | Clontech Laboratories | 630414 | |
| -Leu/-Trp DO Supplement | Clontech Laboratories | 630417 | |
| -His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement | Clontech Laboratories | 630425 | |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3AT) | Sigma-Aldrich | A8056 | |
| Luria broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Invitrogen | 15520-034 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA | Stratagene, Agilent Technologies | 201190 | |
| Ampicillin | AMRESCO | 0339 | |
| Kanamycin Sulfate | Invitrogen | 11815-024 | |
| Subcloning Efficiency™ DH5α™ Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| 10-cm petri dish | ITI Scientific | CT-903 | |
| Incubator (30 °C) | ATR (Ecotron) |
References
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- Zhu, J. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
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