Stamcellstransplantation i en In vitro Simulerad ischemi / Reperfusion Modell

Summary

Vi visar hur du ställer in en

Abstract

Stamcellstransplantation protokoll är att hitta sin väg in i klinisk praxis ^1,2,3. Att få bättre resultat, vilket gör protokollen mer robust, och hitta nya källor för implanterbara celler är i fokus för den senaste forskningen ^4,5. Undersöka effektiviteten av cellterapi är inte en lätt uppgift och nya verktyg behövs för att undersöka mekanismer som är involverade i behandlingsprocessen ^6. Vi har utformat ett experimentellt protokoll av ischemi / reperfusion för att möjliggöra observation av cellulära anslutningar och även subcellulära mekanismer vid ischemi / reperfusionsskada och efter stamcellstransplantation och för att utvärdera effekten av cellterapi. H9c2 cardiomyoblast celler placerades på tallrikar cellodling ^7,8. Ischemi var simuleras med 150 minuter i en glukos fritt medium med syre nivån under 0,5%. Då var normala media och syrehalt återinfördes för att simulera reperfusion. Efter syre glukos deprivation,de skadade cellerna behandlades med transplantation av märkt människans benmärg härrör mesenkymala stamceller genom att lägga till dem i kulturen. Mesenkymala stamceller är att föredra i kliniska prövningar, eftersom de är lätt tillgängliga med minimal invasiv kirurgi, lätt att bygga och autologa. Efter 24 timmar av samarbete odling, var cellerna färgas med kalcein och Ethidium-homodimer att skilja mellan levande och döda celler. Denna inställning gjorde att vi kunde undersöka intercellulära anslutningar med konfokala fluorescerande mikroskopi och att kvantifiera överlevnad postischemic celler genom flödescytometri. Konfokalmikroskopi visade interaktion mellan två cellpopulationer som cellfusion och bildandet av intercellulära nanorör. Flödescytometri analys visade tre grupper av skadade celler som kan ritas på en graf och analyseras statistiskt. Dessa populationer kan undersökas separat och slutsatser kan dras av dessa uppgifter om effektiviteten i den simuleradeterapeutiska förhållningssätt.

Protocol

1. Förbereda H9c2 cardiomyoblast celler

H9c2 råtta cardiomyoblasts erhölls från ATCC (Wesel, Tyskland) och expanderade i hög glukos (4,5 g / L) DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum, 4 mm L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 mikrogram / ml streptomycin. Den H9c2 myoblast cellinje härstammar från embryonala råtta hjärta, det används som en in vitro modell för både skelett-och hjärtmuskulatur ^8,9.

Förbered 12 brunnar i H9c2 celler:

1. Ta bort odlingsmedium från petriskål med H9c2 celler.
2. Tvätta cellerna två gånger med 5 ml PBS och smälta med 2-3 ml 0,05% trypsin / EDTA.
3. Placera petriskål i 5 minuter i 37 ° C inkubator.
4. Hämmar trypsin med 10 ml DMEM odlingsmedium.
5. Snurra ned cellerna vid 1200 rpm i 8 minuter.
6. Efter att supernatanten, återsuspendera cellerna i 1 ml DMEM odlingsmedium och celler räkna med hemocytometer med Trypan Blå färgning.
7. Seed 30.000 H9c2 celler i 2 ml DMEM per brunn i en 12 brunnar.
8. Placera plattan i 37 ° C CO ₂ inkubator i 24 timmar.

2. Simulerad ischemi / reperfusion

Ischemi / reperfusion simulerades in vitro genom att utföra deprivation syre glukos (OGD) på H9c2 cellkulturer. Denna procedur utfördes på scenen av Zeiss konfokalmikroskop med PeCon cellen inkubationen system (Erbach, Tyskland) som möjliggör observation av celler under OGD.

1. Ta bort mediet genom aspiration från 12 brunnar i H9c2 celler.
2. Tvätta cellerna två gånger med PBS.
3. Tillsätt 3 ml glukos fria medel per brunn.
4. Placera plattan i cellen inkubation systemet.
5. Start kvävgas för att rensa syre ur inkubationstiden systemet.
6. Vänta tills nivån av syre når 0,5% starta tidtagningen. 0,5% syre innebär cirka 3 mmHg del spänning. Ämne celler till en50 minuter av simulerade ischemi.
7. I slutet av simulerade ischemi, avlägsna glukos fria medel från cellerna.
8. Pipettera 2 ml normalt odlingsmedium till brunnarna.
9. Placera 12 brunnar i 30 minuter i 37 ° C CO ₂ inkubator, detta är "reperfusion perioden".

3. Förbereda rädda mesenkymala stamceller

Benmärg av mänskligt ursprung togs i T75 kolvar och spädas ut med Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) odlingsmedium innehållande 10% fetalt kalv serum (FCS), 100 U / ml penicillin och 100 mikrogram / ml streptomycin, 4 mm L-glutamin och 1 g / l glukos. Kolvarna inkuberades vid 37 ° C i en helt fuktig atmosfär av 5% CO ₂ i 3 dagar. Efter inkubationstiden på BMSCs anslutit sig till ytan av kolvarna och de resterande delarna av benmärg togs bort genom tvättning med PBS. Den använda BMSCs var mellan 1 och 5 stycken i experimenten. Den idenkvantitet av celler bekräftades av närvaron av släkt-specifika markörer på cellytan med flödescytometri. Hematopoetiska RADANTAL-specifik yta markörer (CD34, CD45) och mesenkymala markörer yta (CD73, CD90, CD105 och CD166) undersöktes.

Under simulerade ischemi, förbereda räddnings mesenkymala stamceller för transplantation.

1. Späd fluorescerande färg Vybrant gjorde i 1:200 förhållandet i DMEM odlingsmedium.
2. Sug medium från undsättning cellerna och tillsätt 300 l DMEM med Vybrant gjorde.
3. Placera petriskål i 30 minuter i 37 ° C CO ₂ inkubator.
4. Ta bort odlingsmedium från petriskål med mesenkymala stamceller.
5. Tvätta cellerna två gånger med 5 ml PBS och smälta med 2-3 ml 0,05% trypsin / EDTA.
6. Placera petriskål i 5 minuter i 37 ° C inkubator.
7. Hämmar trypsin med 10 ml DMEM odlingsmedium.
8. Snurra ned cellerna vid 1200 rpm i 8 minuter.
9. Efter att de Supernatant, resuspendera cellerna i 1 ml DMEM odlingsmedium och celler räkna med hemocytometer med Trypan Blå färgning.
10. Efter 30 minuter i slutet av reperfusion lägga 20 tusen mesenkymala stamceller per brunn till postischemic H9c2 hjärt myoblasts.
11. Placera co-kultur av celler i 37 ° C CO ₂ inkubator i 24 timmar.

4. Analys med konfokalmikroskopi

Efter den simulerade ischemi / reperfusionsskada, celler inkuberas i normala odlingsmedium i 24 timmar.

1. Efter 24 timmar tvättas cellerna två gånger med PBS.
2. Färga cellerna i 500 l live / döda färglösningen i 30 minuter (5 nM kalcein och 400 nm Ethidium-homodimer-2 i PBS) (5x10 ⁴ celler / ml).

Utvärderingen av konfokala bilder för levande och döda celler som morfologi och fluorescens kan utföras med ImageJ programvaran (National Institutes of Health, USA). I händelse av co-kulturer, kan MSC särskiljas från H9c2 celler på grund av deras Vybrant DiD cell märkning. Förhållandet mellan döda celler kan utvärderas i 4 oberoende synfält (objektiv 10x) för varje kultur i en blind sätt ^10.

H9c2 cardiomyoblasts odlade på 42 täckglas mm glas kan också undersökas med tid förfaller video mikroskopi under och efter ischemi / reperfusionsskada använda systemet cellen inkubering av konfokalmikroskop. Cell-till-cell interaktioner som cellfusion och bildandet av intercellulära nanorör kan studeras över tid.

5. Analys med flödescytometri

Efter den simulerade ischemi / reperfusionsskada, celler inkuberas i normala odlingsmedium i 24 timmar.

1. Efter 24 timmar skörda kultur media. Det är mycket viktigt att samla odlingsmediet också att några döda celler kan ha lossnat från den kultur skålen ytan under 24 timmar företagskuvöserning.
2. Tvätta cellerna två gånger med PBS och sammandrag med 0,05% trypsin-EDTA.
3. Hämmar trypsin med DMEM odlingsmedium.
4. Snurra ned cellerna och de skördade odlingsmediet vid 1200 rpm (ca 150-200g) i 8 minuter.
5. Kassera supernatanten.
6. Häng upp cellerna i 500 mikroliter live / döda färglösningen i 30 minuter (5 nM kalcein och 400 nm Ethidium-homodimer-2 i PBS) (5x10 ⁴ celler / ml).
7. Överför celler till flödescytometri rör.
8. Starta CellQuest Pro.
9. För att ställa in flödescytometern för mätning, förbereda kontrollproverna av levande och döda celler.
   1. Tavla H9c2 celler med en täthet på 3x10 ⁴ i 12-brunnars plattor som beskrivs i punkt 1.
   2. Förbered levande cell kontroller med enstaka trypsinisation enligt punkt 1.
   3. Förbered döda cellen kontrollerar genom behandling med 10 mikroM H ₂ O ₂ i 1 timme.
   4. Efter trypsinisation, resuspend levande och döda kontroller cell i 500 l live / döda färglösningen (5 nM kalcein-AM och 400 nm Ethidium-homodimer-2 i PBS).
10. Instrumentet inställningar bör justeras så att levande celler kalcein positiva och Ethidium homodimer negativa, medan de döda celler kalcein negativa och Ethidium homodimer positiv.
11. Andelen av dessa populationer kan uttryckas som bar på en graf och statistisk analys kan utföras på dessa värden.
12. Mät olika experimentella grupper.

6. Representativa resultat:

Våra resultat visade att läggas mesenkymala stamceller skulle kunna förbättra överlevnaden av postischemic hjärtats celler. Konfokalmikroskopi bilder visade direkt cell till cell interaktioner, såsom partiell membran anslutning eller intercellulära nanorör, som troligen spelar en viktig roll i den observerade skydd ^10. Dessa nanorör spänner över avstånd på flera cell diameters, och deras diameter var mellan 200 och 500 nm (vita pilar).

Figur 1. Nanotube bildas mellan cellerna. Nanotube bildning (vit pil) observerades mellan Vybrant märkt DIO cardiomyoblasts och Vybrant DiD märkta mesenkymala stamceller.

Flödescytometri analys visade befolkningen att överleva och nekrotisk cardiomyoblasts och mesenkymala stamceller. Intressant noterade vi även en tredje, "skadade" befolkning cardiomyoblast cell som innehöll kalcein men också innehöll indikator på döda celler, Ethidium homodimer (Figur 2).

Figur 2. Representant dot-plot av de olika cellpopulationer efter simulerad ischemi.

Utvärderingen av flera experiment shoons att tillägg av mesenkymala stamceller till postischemic H9c2 cardiomyoblast ökade signifikant andelen levande celler jämfört med hjärt myoblasts odlade ensam efter ischemi (Figur 3).

Figur 3. . Effekt av stamceller behandling på postischemic cardiomyoblasts Andel av levande celler minskade signifikant efter simulerade ischemi jämfört med kontroll (styrning kontra IR-modell: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p> 0,001), som ökade efter tillsats av mesenkymala stamceller (IR-modellen vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p> 0,001). Data representerar medelvärde ± SEM. Statistisk analys av data genomfördes med hjälp av en-vägs variansanalys med Tukey är multipeljämförelse post hoc test.

Discussion

Det visade protokollet är ett in vitro förhållningssätt till mycket mer komplexa frågan om stamcellsterapi i hjärtinfarkt, med alla fördelar och nackdelar med en sådan modell. Uppenbarligen inte kan återspegla den komplexa (t.ex. immunologiska) händelser som äger rum under och efter hjärtinfarkt utan kan fokusera på de direkta effekterna av den extra celler på postischemic celler. Effekterna av simulerade ischemi på H9c2 cardiomyoblasts beror mycket på vilken tid på OGD, på tidens många av de använda cellerna och på O _{2-koncentrationen.} Man måste justera dessa parametrar noggrant och hitta den optimala förhållanden för en viss celltyp för att få ett standardiserat protokoll. Efteråt kan protokollet kan användas på många sätt (njur-, lever-eller cerebral ischemi / reperfusion ^11,12,13,14) för att undersöka effekterna av olika läggas celltyper, t.ex. embryonala stamceller, inducerade pluripotenta stamceller och vuxna stamceller ^15, effectiveness av konditionerat medelhög ¹⁶ eller olika förbehandlingar ^17,18 eller någon parameter i fokus.