Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

زرع الخلايا الجذعية في في المختبر مقلد نقص التروية / إعادة إشباع الخلايا النموذجي

Published: November 5, 2011 doi: 10.3791/3575
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Human Physiology and Clinical Experimental Research, Semmelweis University

Summary

نحن لشرح كيفية انشاء

Abstract

بروتوكولات زرع الخلايا الجذعية تجد طريقها إلى الممارسة السريرية 1،2،3. الحصول على أفضل النتائج ، مما يجعل من البروتوكولات أكثر قوة ، وإيجاد مصادر جديدة للخلايا زرع هي محور الأبحاث الحديثة 4،5. التحقيق في فعالية العلاج بالخلايا ليست مهمة سهلة وهناك حاجة إلى أدوات جديدة للتحقيق في الآليات التي تشارك في عملية المعالجة 6. صممنا على بروتوكول التجريبي لنقص التروية / ضخه من أجل السماح للمراقبة الاتصالات الخلوية وآليات التحت خلوية حتى أثناء نقص التروية / ضخه الاصابة وبعد زرع الخلايا الجذعية ، وتقييم مدى فعالية العلاج بالخلايا. ووضعت الخلايا cardiomyoblast H9c2 على لوحات ثقافة الخلية 7،8. وكان نقص التروية محاكاة مع 150 دقيقة في المتوسط ​​الجلوكوز الحرة مع مستوى الاوكسجين أقل من 0.5 ٪. ثم ، أعيد إحياء وسائل الاعلام العادية ومستويات الأكسجين إلى محاكاة ضخه. بعد الحرمان من الأوكسجين الجلوكوز ،تم علاج الخلايا التالفة مع زرع النخاع العظمي المسمى حقوق الإنسان مستمد الخلايا الجذعية الوسيطة عن طريق إضافتها إلى الثقافة. ويفضل الخلايا الجذعية الوسيطة في التجارب السريرية لأنها متاحة بسهولة مع الحد الأدنى من الجراحة ، يمكن أن تتوسع بسهولة وذاتي. بعد 24 ساعة من زراعة المشتركة ، تم صبغ الخلايا مع calcein وإيثيديوم homodimer إلى التفريق بين الخلايا الحية والميتة. يسمح لنا هذا الإعداد للتحقيق في الاتصالات بين الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت مبائر ولقياس معدل البقاء على قيد الحياة من خلايا تال للإقفار بواسطة التدفق الخلوي. وأظهر الفحص المجهري مبائر التفاعلات بين السكان الخلية اثنين من الممثلين والانصهار وتشكيل خلية من الأنابيب النانومترية بين الخلايا. وكشف تحليل التدفق الخلوي 3 مجموعات من الخلايا التالفة والتي يمكن رسم على رسم بياني وتحليلها إحصائيا. ويمكن تحقيق هذه التجمعات السكانية بشكل منفصل والاستنتاجات التي يمكن استخلاصها من هذه البيانات على فعالية محاكاةالعلاجية النهج.

Protocol

1. إعداد الخلايا cardiomyoblast H9c2

وقد تم الحصول على الفئران cardiomyoblasts H9c2 من ATCC (فيسيل ، ألمانيا) ، وتوسعت في ارتفاع نسبة الجلوكوز (4.5 غرام / لتر) DMEM تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني ، 4 مم L - الجلوتامين ، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام الستربتوميسين / مل. مشتق الخلية myoblast H9c2 الخط من قلب الفئران الجنينية ، يتم استخدامه بمثابة نموذج في المختبر لكلا العضلات والهيكل العظمي والقلب 8،9.

إعداد 12 لوحة جيدا H9c2 الخلايا :

  1. إزالة مستنبت من طبق بيتري H9c2 من الخلايا.
  2. غسل الخلايا مرتين مع PBS 5 مل وهضم 2-3 مع التربسين 0.05 ٪ مل / EDTA.
  3. مكان طبق بتري لمدة 5 دقائق في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  4. تمنع التربسين مع 10 مل مستنبت DMEM.
  5. تدور باستمرار في 1200 دورة في الدقيقة الخلايا لمدة 8 دقائق.
  6. بعد إزالة طاف ، والخلايا في 1 مل resuspend مستنبت DMEM والخلايا مع عدد عدادة الكريات به التريبان الأزرق تلطيخ.
  7. البذور 30000 H9c2 الخلايا في DMEM 2 مل لكل بئر في 12 لوحة جيدا.
  8. وضع لوحة في 37 درجة مئوية حاضنة CO 2 لمدة 24 ساعة.

2. محاكاة نقص التروية / ضخه

وكان نقص التروية / ضخه محاكاة في المختبر قبل تنفيذ الحرمان الأوكسجين الجلوكوز (OGD) على الثقافات H9c2 الخلية. تم تنفيذ هذا الإجراء على مسرح المجهر مبائر زايس مع حضانة PeCon نظام الخلية (Erbach ، ألمانيا) السماح للمراقبة من خلال خلايا OGD.

  1. إزالة المتوسطة التي تطلع من 12 لوحة جيدا H9c2 الخلايا.
  2. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  3. أضف 3 مل المتوسطة الجلوكوز مجانا لكل بئر.
  4. وضع لوحة في الخلية نظام الحضانة.
  5. بدء غاز النيتروجين لتطهير الأوكسجين من نظام الحضانة.
  6. انتظر حتى يصل إلى مستوى الأكسجين 0.5 ٪ ثم بدء تشغيل الموقت. الأكسجين 0.5 ٪ يعني حوالي 3 ملم زئبقي التوتر الجزئي. تخضع الخلايا إلى 150 دقيقة من نقص التروية المحاكاة.
  7. في نهاية محاكاة نقص التروية ، وإزالة الجلوكوز المتوسط ​​خالية من الخلايا.
  8. 2 مل ماصة مستنبت الطبيعي أن الآبار.
  9. 12 لوحة مكان جيد لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 ، وهذا هو "فترة ضخه".

3. إعداد الخلايا الجذعية الوسيطة الانقاذ

لقد التقطت نخاع العظام من أصل الإنسان في T75 القوارير والمخففة مع متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) مستنبت تحتوي على 10 ٪ الجنين العجل المصل (FCS) ، و 100 البنسلين يو / مل و 100 الستربتوميسين ميكروغرام / لتر ، 4 ملم لام الجلوتامين و 1 غرام / لتر غلوكوز. وحضنت والقوارير على 37 درجة مئوية في جو كامل من ثاني مرطب 5 2 ٪ لمدة 3 أيام. بعد فترة حضانة المرض والقضاء على BMSCs انضمت إلى السطح من قوارير والعناصر المتبقية من نخاع العظام من خلال برنامج تلفزيوني مع الغسيل. كانت BMSCs تستخدم ما بين 1 و 5 فقرات في التجارب. في الاتساعوأكد tity من الخلايا وجود نسب محددة علامات سطح الخلية مع التدفق الخلوي. وقد تم التحقيق علامات سطح لدم عدد الأسطر المحددة (CD34 ، CD45) ، وعلامات سطح الوسيطة (CD73 ، CD90 ، وCD105 CD166).

خلال محاكاة نقص التروية ، وإعداد الانقاذ الخلايا الجذعية الوسيطة للزرع.

  1. يخفف من صبغة الفلورسنت Vybrant فعلت في نسبة 1:200 في مستنبت DMEM.
  2. نضح متوسطة من خلايا الانقاذ وإضافة 300 DMEM ميكرولتر مع Vybrant فعلت.
  3. مكان طبق بتري لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية حاضنة 2 CO.
  4. إزالة مستنبت من طبق بيتري من الخلايا الجذعية الوسيطة.
  5. غسل الخلايا مرتين مع PBS 5 مل وهضم 2-3 مع التربسين 0.05 ٪ مل / EDTA.
  6. مكان طبق بتري لمدة 5 دقائق في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  7. تمنع التربسين مع 10 مل مستنبت DMEM.
  8. تدور باستمرار في 1200 دورة في الدقيقة الخلايا لمدة 8 دقائق.
  9. بعد إزالة سوبrnatant ، resuspend الخلايا في 1 مل مستنبت DMEM والخلايا مع عدد عدادة الكريات به التريبان الأزرق تلطيخ.
  10. بعد 30 دقيقة على نهاية ضخه إضافة 20000 الخلايا الجذعية الوسيطة لكل بئر لmyoblasts H9c2 تال للإقفار القلب.
  11. شارك في وضع الثقافة من الخلايا إلى 37 درجة مئوية حاضنة CO 2 لمدة 24 ساعة.

4. التحليل المجهري مع مبائر

بعد الإصابة نقص التروية / ضخه المحاكاة ، يتم تحضين الخلايا في مستنبت العادي لمدة 24 ساعة.

  1. بعد 24 ساعة غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  2. وصمة عار على الخلايا الحية في حل 500 / قتيلا ميكرولتر الصبغة لمدة 30 دقيقة (5 calcein نانومتر و 400 نانومتر إيثيديوم homodimer - 2 - في برنامج تلفزيوني) (5x10 4 خلية / مل).

يمكن إجراء تقييم الصور مبائر للخلايا الحية والميتة التي اختارها التشكل ومضان مع برنامج ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة). في حالة جس الثقافات ، يمكن التمييز بين اللجان الدائمة من خلايا H9c2 بسبب وضع العلامات الخاصة Vybrant هل ​​الخلية. ويمكن تقييم نسبة الخلايا الميتة في 4 مجالات مستقلة عن عرض (الهدف 10X) لكل ثقافة بطريقة عمياء 10.

ويمكن أيضا H9c2 cardiomyoblasts مثقف على 42 ملم coverslips الزجاج يتم التحقيق مع مرور الوقت المجهري الفيديو أثناء وبعد نقص التروية / ضخه الاصابة باستخدام نظام حضانة الخلية المجهر متحد البؤر. ويمكن دراسة الخلية الى خلية التفاعلات مثل انصهار الخلية وتشكيل الأنابيب النانوية بين الخلايا مع مرور الوقت.

5. التحليل مع التدفق الخلوي

بعد الإصابة نقص التروية / ضخه المحاكاة ، يتم تحضين الخلايا في مستنبت العادي لمدة 24 ساعة.

  1. بعد 24 ساعة ، والحصاد وسائل الإعلام الثقافة. من المهم جدا لجمع مستنبت أيضا لأن بعض الخلايا الميتة يمكن أن يكون بمعزل عن الثقافة السطحية طبق خلال 24 ساعة incubaنشوئها.
  2. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وهضم مع 0.05 ٪ التربسين - EDTA.
  3. تمنع التربسين مع مستنبت DMEM.
  4. تدور باستمرار الخلايا والمتوسطة الثقافة في 1200 دورة في الدقيقة المقطوع (حوالي 150 200G) لمدة 8 دقائق.
  5. تجاهل طاف.
  6. تعليق على الخلايا الحية في حل 500 / قتيلا ميكرولتر الصبغة لمدة 30 دقيقة (5 calcein نانومتر و 400 نانومتر إيثيديوم homodimer - 2 - في برنامج تلفزيوني) (5x10 4 خلية / مل).
  7. نقل الخلايا إلى أنابيب التدفق الخلوي.
  8. بدء CellQuest Pro البرمجيات.
  9. لإعداد لقياس تدفق عداد الكريات ، وإعداد عينات من السيطرة الخلايا الحية والميتة.
    1. لوحة H9c2 الخلايا في كثافة 3x10 4 في 12 لوحات جيدا كما هو موضح في النقطة 1.
    2. إعداد الضوابط خلية حية واحدة مع trypsinisation كما هو موضح في النقطة 1.
    3. إعداد الضوابط الخلية برصاص العلاج مع 10 ميكرومتر H 2 O 2 لمدة 1 ساعة.
    4. بعد trypsinisation ، resuspenد يعيش والضوابط خلية ميتة في 500 ميكروليتر محلول الصبغة العيش / قتلى (5 نانومتر calcein - AM و 400 نانومتر إيثيديوم homodimer - 2 - في برنامج تلفزيوني).
  10. ينبغي تعديل الصك بغية ضبط الخلايا الحية هي ايجابية وcalcein إيثيديوم homodimer سلبية ، في حين أن الخلايا الميتة هي سلبية وcalcein إيثيديوم homodimer إيجابية.
  11. ويمكن التعبير عن النسبة المئوية لسكان تلك المناطق كما لا يمكن أن يؤديها الحانات في الرسم البياني والتحليل الإحصائي على هذه القيم.
  12. قياس مختلف المجموعات التجريبية.

6. ممثل النتائج :

وأظهرت النتائج أن لدينا وأضاف الخلايا الجذعية الوسيطة يمكن أن يحسن البقاء على قيد الحياة من خلايا القلب تال للإقفار. وكشفت الصور المجهري مبائر مباشرة من خلية إلى خلية التفاعل ، مثل اتصال الغشاء الجزئي أو نانوتيوب بين الخلايا ، التي تلعب على الارجح دورا هاما في حماية احظ 10. هذه الألياف تمتد عبر مسافات د الخلية عدةوكانت iameters ، وبأقطار ما بين 200 و 500 نانومتر (السهام البيضاء).

الشكل 1
الشكل 1. تشكيل أنابيب بين الخلايا. وحظ تشكيل الأنابيب الجزيئية (أبيض السهم) بين cardiomyoblasts ديو Vybrant وصفت وصفت Vybrant هل الخلايا الجذعية الوسيطة.

وأظهر تحليل التدفق الخلوي للسكان بالبقاء على قيد الحياة وcardiomyoblasts نخرية والخلايا الجذعية الوسيطة. ومن المثير للاهتمام ، لاحظنا أيضا خلية cardiomyoblast الثالثة ، 'جرح' السكان الذي يتضمن calcein لكن الوارد أيضا مؤشر على الخلايا الميتة ، إيثيديوم homodimer (الشكل 2).

الشكل 2
الشكل 2. ممثل الدوت مؤامرة من السكان مختلفة من الخلايا بعد إقفار المحاكاة.

تقييم تجارب عدة شوالأربعاء أنه إضافة إلى الخلايا الجذعية الوسيطة cardiomyoblast H9c2 تال للإقفار زيادة كبيرة في نسبة الخلايا الحية مقارنة myoblasts القلب المثقف وحده ، بعد نقص التروية (الشكل 3).

الشكل 3
الشكل 3. وخفضت بشكل كبير من تأثير العلاج على الخلايا الجذعية cardiomyoblasts تال للإقفار النسبة المئوية للنقص تروية الخلايا الحية بعد مقارنة محاكاة للتحكم (عنصر تحكم نموذج مقابل IR : 90.36 ± 2.60 مقابل 10.52 ± 0.48 *** P> 0.001). والتي زادت بعد إضافة الخلايا الجذعية الوسيطة (IR الأشعة تحت الحمراء + نموذج مقابل BMSC : 10.52 ± 0.48 مقابل 25.21 ± 2.13 ، *** P> 0.001). تمثل البيانات يعني ± SEM. وأجري التحليل الإحصائي للبيانات باستخدام الخروج في اتجاه واحد تحليل التباين مع آخر توكي في المقارنة متعددة مخصصة اختبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول هو أظهر في النهج المختبر لقضية أكثر تعقيدا بكثير من العلاج بالخلايا الجذعية في عضلة القلب احتشاء ، مع مزايا وعيوب كل نموذج من هذا القبيل. من الواضح أنه لا يمكن تعكس المعقدة (المناعية مثلا) الأحداث التي تجري خلال احتشاء عضلة القلب ، وبعد ولكن يمكن التركيز على الآثار المباشرة للخلايا واضاف تال للإقفار على الخلايا. آثار نقص التروية في محاكاة H9c2 cardiomyoblasts تعتمد بشكل كبير على وقت OGD ، على عدد من الخلايا مرور المستخدمة وعلى تركيز 2 O. لا بد من ضبط هذه المعايير بدقة وايجاد الظروف المثلى للحصول على نوع من الخلايا معينة من أجل الحصول على بروتوكول موحد. بعد ذلك ، يمكن استخدام البروتوكول في العديد من الطرق (الكلى ، الكبد أو نقص تروية الدماغ / ضخه 11،12،13،14) للتحقيق في الآثار المترتبة على مختلف أنواع الخلايا المضافة مثل الخلايا الجذعية الجنينية ، الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة أو خلايا جذعية للبالغين 15 ، هffectiveness المتوسطة مكيفة 16 أو المعالجة المسبقة مختلف 17،18 أو أي معلمة في بؤرة الاهتمام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل OTKA (المجرية صندوق البحث العلمي) D45933 ، T049621 ، تيت (المجرية للعلوم والتكنولوجيا) A4/04 ، Arg-17/2006 والخطيئة ، بولياي ، والزمالات Öveges TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR - 2008 - 0004 و4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. نود أن نشكر Gesztes وليام لتوفير الصوت عبر.

References

  1. Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).
  2. Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review. Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).
  3. Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).
  4. Gaipa, G. GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).
  5. Trounson, A. New perspectives in human stem cell therapeutic research. BMC medicine. 7, 29-29 (2009).
  6. Mazhari, R., Hare, J. M. Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, Suppl 1. S21-S21 (2007).
  7. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).
  8. Sardao, V. A. Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death. BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).
  9. Hescheler, J. Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart. Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).
  10. Cselenyak, A. Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections. BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).
  11. Sauvant, C. Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia. Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).
  12. Namas, R. A. Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes. Shock. 36, 196-196 (2011).
  13. Cao, L. Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line. Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).
  14. Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models. Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).
  15. Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 82, 252-252 (2007).
  16. Angoulvant, D. Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury. J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).
  17. Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions. Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).
  18. Guo, J. Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).

Tags

الطب ، العدد 57 ، نقص التروية / نموذج ضخه ، زرع الخلايا الجذعية ، الفحص المجهري متحد البؤر ، التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cselenyák, A., Benko, Z.,… More

Cselenyák, A., Benko, Z., Szepes, M., Kiss, L., Lacza, Z. Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model. J. Vis. Exp. (57), e3575, doi:10.3791/3575 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter