Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell

Summary

Wir zeigen, wie die Einrichtung eines

Abstract

Stammzelltransplantation Protokolle finden ihren Weg in die klinische Praxis ^1,2,3. Getting bessere Ergebnisse, so dass die Protokolle mehr robust, und die Suche nach neuen Quellen für implantierbare Zellen stehen im Mittelpunkt der jüngsten Forschung ^4,5. Untersuchung der Wirksamkeit von Zelltherapien ist keine leichte Aufgabe, und neue Werkzeuge sind nötig, um die Mechanismen in der Behandlung Verfahren ⁶ zu erforschen. Wir haben ein experimentelles Protokoll der Ischämie / Reperfusion, um die Beobachtung von zellulären Verbindungen und sogar subzelluläre Mechanismen während der Ischämie / Reperfusion und nach Stammzelltransplantation zu ermöglichen und die Wirksamkeit der Zelltherapie zu bewerten. H9c2 cardiomyoblast Zellen wurden auf Zellkulturplatten ^7,8 platziert. Ischämie simuliert wurde mit 150 Minuten in einer Glucose-freiem Medium mit Sauerstoff unter 0,5%. Dann wurden normale Medien-und Sauerstoff wieder zu Reperfusion zu simulieren. Nach Sauerstoff Glukose Deprivation,die geschädigten Zellen wurden mit der Transplantation von markiertem menschlichem Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen, indem sie in die Kultur behandelt. Mesenchymale Stammzellen sind in klinischen Studien bevorzugt, weil sie leicht zu erreichen mit minimal-invasiven Chirurgie, leicht erweiterbar und autologe sind. Nach 24-stündiger Kokultivierung wurden die Zellen mit Calcein und Ethidium-Homodimer gefärbt, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Dieses Setup erlaubt uns, die interzellulären Verbindungen mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen und die Überlebensrate von postischämischen Zellen mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Die konfokale Mikroskopie zeigte die Wechselwirkungen der beiden Zellpopulationen wie Zellfusion und die Bildung von interzellulären Nanoröhren. Durchflusszytometrie-Analyse ergab 3 Cluster von beschädigten Zellen, die in einem Diagramm dargestellt und können statistisch ausgewertet werden. Diese Populationen können separat untersucht werden und Rückschlüsse auf diese Daten über die Wirksamkeit der simulierten gezogen werdenTherapieansatz.

Protocol

1. Vorbereitung H9c2 cardiomyoblast Zellen

H9c2 Ratte cardiomyoblasts wurden von ATCC (Wesel, Deutschland) erhalten und ausgebaut in hoher Glukose (4,5 g / L) DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 4 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. Die H9c2 Myoblasten-Zelllinie aus embryonalen Ratte Herzen abgeleitet wird, wird es als ein in vitro Modell für Skelett-und Herzmuskeln ^8,9 verwendet.

Bereiten Sie 12 gut Platte H9c2 Zellen:

1. Entfernen Kulturmedium aus Petrischale H9c2 Zellen.
2. Wash Zellen zweimal mit 5 ml PBS und verdauen mit 2-3 ml 0,05% Trypsin / EDTA.
3. Legen Sie Petrischale für 5 Minuten in die 37 ° C Inkubator.
4. Inhibit Trypsin mit 10 ml DMEM Kulturmedium.
5. Spin down die Zellen bei 1200 RPM für 8 Minuten.
6. Nach Entfernen des Überstands, die Zellen in 1 ml DMEM Kulturmedium und Zählen von Zellen mit Zählkammer mit Trypan-Blau-Färbung.
7. Seed 30.000 H9c2 Zellen in 2 ml DMEM pro Well in einer 12-Well-Platte.
8. Legen Sie die Platte in die 37 ° C CO _2-Inkubator für 24 Stunden.

2. Simulierte Ischämie / Reperfusion

Ischämie / Reperfusion simuliert wurde in vitro, indem Sauerstoff Glukose Deprivation (OGD) auf H9c2 Zellkulturen. Dieses Verfahren wurde auf der Bühne des Zeiss konfokalen Mikroskop mit dem Pecon Zellinkubation System (Erbach, Deutschland) erlaubt die Beobachtung der Zellen während der OGD durchgeführt.

1. Entfernen Medium durch Absaugen von 12-Well-Platte des H9c2 Zellen.
2. Wash Zellen zweimal mit PBS.
3. Add 3 ml Glucose-freiem Medium pro Vertiefung.
4. Legen Sie die Platte in die Zelle Inkubation System.
5. Starten Stickstoff, um den Sauerstoff aus der Inkubation System zu spülen.
6. Warten Sie, bis der Sauerstoffgehalt erreicht 0,5% dann den Timer zu starten. 0,5% Sauerstoff bedeutet ca. 3 mmHg teilweisen Spannung. Subject Zellen bis 150 Minuten von simulierten Ischämie.
7. Am Ende der simulierten Ischämie, entfernen Sie die Glukose-freiem Medium von den Zellen.
8. 2 ml normalen Kulturmedium in die Vertiefungen.
9. Legen Sie die 12-Well-Platte für 30 Minuten in die 37 ° C CO _2-Inkubator, das ist der "Reperfusion Zeit".

3. Vorbereitung Rettung mesenchymalen Stammzellen

Knochenmark menschlichen Ursprungs wurde in T75 Flaschen genommen und verdünnt mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) Kultur-Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, 4 mM L-Glutamin und 1 g / l Glukose. Die Kolben wurden bei 37 ° C in einem vollständig befeuchteten Atmosphäre von 5% CO ₂ für 3 Tage inkubiert. Nach der Inkubationszeit der BMSCs haftete an der Oberfläche des Flakons und die übrigen Komponenten des Knochenmarks wurden durch Waschen mit PBS entfernt. Die verwendeten BMSCs wurden zwischen 1 und 5 Passagen in den Experimenten. Die IdenTity der Zellen wurde durch die Anwesenheit von Lineage-spezifische Zelloberflächenmarker mit Durchflusszytometrie bestätigt. Hämatopoetische Lineage-spezifische Oberflächenmarker (CD34, CD45) und mesenchymalen Oberflächenmarker (CD73, CD90, CD105 und CD166) wurden untersucht.

Während simulierten Ischämie, bereiten Rettung mesenchymale Stammzellen für die Transplantation.

1. Verdünnen Sie die fluoreszierenden Farbstoff Vybrant in 1:200-Verhältnis in DMEM Kulturmedium DiD.
2. Absaugen Medium aus dem Rettungs-Zellen und 300 ul DMEM mit Vybrant DiD.
3. Legen Sie Petrischale für 30 Minuten in die 37 ° C CO _2-Inkubator.
4. Entfernen Kulturmedium aus Petrischale von mesenchymalen Stammzellen.
5. Wash Zellen zweimal mit 5 ml PBS und verdauen mit 2-3 ml 0,05% Trypsin / EDTA.
6. Legen Sie Petrischale für 5 Minuten in die 37 ° C Inkubator.
7. Inhibit Trypsin mit 10 ml DMEM Kulturmedium.
8. Spin down die Zellen bei 1200 RPM für 8 Minuten.
9. Nach dem Entfernen der Supernatant, die Zellen in 1 ml DMEM Kulturmedium und Zählen von Zellen mit Zählkammer mit Trypan-Blau-Färbung.
10. Nach 30 Minuten am Ende der Reperfusion add 20.000 mesenchymalen Stammzellen pro Vertiefung der postischämischen H9c2 kardiale Myoblasten.
11. Ort Co-Kultur von Zellen in die 37 ° C CO _2-Inkubator für 24 Stunden.

4. Die Analyse mit der konfokalen Mikroskopie

Nach der simulierten Ischämie / Reperfusion, werden die Zellen in normalen Nährmedium für 24 Stunden inkubiert.

1. Nach 24 Stunden waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
2. Stain die Zellen in 500 ul Live / Dead-Farbstoff-Lösung für 30 Minuten (5 nM Calcein und 400 Nm Ethidium-Homodimer-2 in PBS) (5x10 ⁴ Zellen / ml).

Die Auswertung der konfokalen Bilder für lebende und tote Zellen durch Morphologie und Fluoreszenz ausgewählt werden können mit dem ImageJ Software (National Institutes of Health, USA) durchgeführt werden. Im Falle von co-Kulturen können MSCs aus H9c2 Zellen aufgrund ihrer Vybrant DiD Zelle gekennzeichnet werden. Das Verhältnis von abgestorbenen Zellen kann in 4 unabhängigen Sehfelder (Objektiv 10x) für jede Kultur in einem blinden fashion ¹⁰ ausgewertet werden.

H9c2 cardiomyoblasts auf 42 mm Deckgläschen kultiviert kann auch mit Zeitraffer-Video-Mikroskopie, während und nach Ischämie / Reperfusion mithilfe der Zell-Inkubation System der konfokalen Mikroskop untersucht werden. Zell-Zell-Interaktionen wie Zell-Fusion und die Bildung von interzellulären Nanoröhrchen können im Laufe der Zeit untersucht werden.

5. Die Analyse mit Durchflusszytometrie

Nach der simulierten Ischämie / Reperfusion, werden die Zellen in normalen Nährmedium für 24 Stunden inkubiert.

1. Nach 24 Stunden ernten die Kulturmedien. Es ist sehr wichtig, um das Kulturmedium sammeln auch, weil einige tote Zellen könnten von der Kulturschale Oberfläche während der 24 Stunden Inkubation abgelöst habenTION.
2. Wash Zellen zweimal mit PBS und verdauen mit 0,05% Trypsin-EDTA.
3. Inhibit Trypsin mit DMEM Kulturmedium.
4. Spin down der Zellen und die geernteten Kulturmedium bei 1200 RPM (ca. 150-200g) für 8 Minuten.
5. Überstand verwerfen.
6. Suspend die Zellen in 500 ul Live / Dead-Farbstoff-Lösung für 30 Minuten (5 nM Calcein und 400 Nm Ethidium-Homodimer-2 in PBS) (5x10 ⁴ Zellen / ml).
7. Transfer-Zellen-Zytometrie Rohre fließen.
8. Starten Sie den CellQuest Pro Software.
9. So richten Sie das Durchflusszytometer für die Messung, bereiten Kontrollproben von lebenden und toten Zellen.
   1. Platte H9c2 Zellen bei einer Dichte von 3x10 ⁴ in 12-Well-Platten, wie in Punkt 1 beschrieben.
   2. Bereiten Sie leben Zelle steuert mit einzelnen Trypsinierung wie in Punkt 1 beschrieben.
   3. Bereiten tote Zelle steuert durch die Behandlung mit 10 uM H ₂ O ₂ für 1 Stunde.
   4. Nach Trypsinierung, resuspend lebenden und toten Zellen steuert in 500 ul Live / Dead-Farbstofflösung (5 nM Calcein-AM und 400 Nm Ethidium-Homodimer-2 in PBS).
10. Das Instrument Einstellungen sollten so eingestellt, die lebenden Zellen Calcein positiven und Ethidium Homodimer negativ sind, während die toten Zellen Calcein negativen und Ethidium Homodimer positive sind.
11. Der Anteil dieser Bevölkerungsgruppen ausgedrückt als Balken in einem Diagramm und die statistische Analyse auf diesen Werten durchgeführt werden kann.
12. Messen Sie die verschiedenen experimentellen Gruppen.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Unsere Ergebnisse zeigten, dass hinzugefügt mesenchymalen Stammzellen könnte das Überleben der postischämischen kardialen Zellen zu verbessern. Die konfokale Mikroskopie-Bilder zeigten direkte Zell-Zell-Interaktionen, wie teilweise Membran-Verbindung oder interzelluläre-Nanoröhren, die wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielen in den beobachteten Schutz ^10. Diese Nanoröhren span über Entfernungen von mehreren Zell-diameters, und ihre Durchmesser wurden zwischen 200 und 500 nm (weiße Pfeile).

Abbildung 1. Nanotube-Bildung zwischen den Zellen. Nanotube-Bildung (weißer Pfeil) wurde zwischen Vybrant DiO gekennzeichnet cardiomyoblasts und Vybrant DiD gekennzeichnet mesenchymalen Stammzellen beobachtet.

Durchflusszytometrie-Analyse zeigte die Bevölkerung zu überleben und nekrotische cardiomyoblasts und mesenchymalen Stammzellen. Interessanterweise haben wir auch beobachtet, eine dritte, 'verletzt' cardiomyoblast Zellpopulation, die Calcein enthalten, sondern enthielt auch die Anzeige der toten Zellen, Ethidium Homodimer (Abbildung 2).

Abbildung 2. Vertreter dot-plot der verschiedenen Zellpopulationen nach simulierten Ischämie.

Die Auswertung mehrerer Versuche showed, dass die Zugabe von mesenchymalen Stammzellen zu postischämischen H9c2 cardiomyoblast signifikant erhöht den Anteil der lebenden Zellen im Vergleich zu den kardialen Myoblasten allein nach Ischämie kultiviert (Abbildung 3).

Abbildung 3. ., Die nach Zugabe erhöht: Einfluss der Stammzell-Therapie am postischämischen cardiomyoblasts Prozentsatz der lebenden Zellen war signifikant nach simulierten Ischämie im Vergleich zur Kontrollgruppe (90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p> 0,001 Kontrolle vs IR-Modell) reduziert von mesenchymalen Stammzellen (IR-Modell vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p> 0,001). Die Daten repräsentieren Mittelwert ± SEM. Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit one-way Varianzanalyse mit mehreren Vergleich Tukey post hoc Test durchgeführt.

Discussion

Der Beweis-Protokoll ist ein in vitro Ansatz für die viel mehr komplexe Thema der Stammzellentherapie bei Herzinfarkt, mit allen Vor-und Nachteile eines solchen Modells. Natürlich kann es nicht spiegeln die komplexe (zB immunologische) stattfindenden Veranstaltungen während und nach Myokard-Infarkt, kann aber auf die direkten Auswirkungen der zusätzlichen Zellen auf der postischämischen Zellen konzentrieren. Die Auswirkungen der simulierten Ischämie auf H9c2 cardiomyoblasts in hohem Maße abhängig von der Zeit des OGD, auf dem Durchgang Anzahl der verwendeten Zellen und auf den O _{2-Konzentration.} Man muss diese Parameter exakt einzustellen und finden Sie die optimalen Bedingungen für einen bestimmten Zelltyp, um ein standardisiertes Protokoll. Danach kann das Protokoll in vielerlei Hinsicht verwendet werden (Nieren-, Leber-oder zerebraler Ischämie / Reperfusion ^{11,12,13,14),} um die Auswirkungen verschiedener hinzugefügt Zelltypen wie embryonale Stammzellen, induzierte pluripotente Stammzellen oder adulte Stammzellen zu untersuchen ^15, eIRKSAMKEIT von konditioniertem Medium ¹⁶ oder verschiedene Vorbehandlungen ^17,18 oder alle Parameter in den Mittelpunkt des Interesses.