Summary
C - 13同位素标记是一个有用的技术，确定各类微生物细胞中央代谢。后已与一个特定的标记底物培养的细胞，气相色谱 - 质谱测量，可以揭示proteinogenic氨基酸的独特标签模式为基础的功能代谢途径。
Abstract
微生物可以利用生物化学和功能基因组学方法研究复杂的代谢途径。一个重要的技术，来研究细胞中央的新陈代谢，并发现新的酶是13的C -辅助代谢分析1。这种技术是基于同位素标记，用13 C标记底物的微生物美联储。通过跟踪在生化网络代谢物之间的原子过渡路径，我们可以判断功能的途径，并发现新的酶。
作为辅助方法，转录和蛋白质组学，isotopomer辅助代谢途径分析方法包含三个主要步骤： 首先 ，我们的成长与13 C标记底物的细胞。在这一步，中期和标记底物的选择组成的两个关键因素。为了避免从非标在营养补充剂的碳测量噪音与一个唯一碳源的培养基是必需的。此外，选择一个标记底物的基础上，如何有效地将澄清所分析的途径。由于新的酶往往涉及不同的反应的立体化学或中间产品，在一般情况下，单独标记的碳基板更新颖的途径检测信息统一标记的检测新颖的途径 3，4，第二，我们分析氨基酸的标签模式，采用GC - MS。氨基酸丰富的蛋白质，并，从而可以从生物质水解获得。氨基酸可GC分离之前的N -（叔丁基二甲基）- N - methyltrifluoroacetamide（TBDMS）衍生。 TBDMS衍生的氨基酸可分散MS和在不同的片段阵列。费（M / Z）零散和不分段氨基酸的比例群众的基础上，我们可以推断可能是中央的代谢产物的标记模式氨基酸的前体。第三，我们在建议的途径跟踪13C碳过渡，isotopomer数据的基础上，确认这些途径是否活跃2。氨基酸的测量提供了约8个中央代谢的关键前体代谢产物的同位素标记信息。这些代谢的关键节点，能反映相关中央通路的功能。
13的C协助通过proteinogenic氨基酸的代谢分析，可广泛用于低的特点微生物代谢功能特性。在这个协议中，我们将使用模型应变Cyanothece 51142证明标记的碳基板发现新酶功能的使用。
Protocol
1。细胞培养（图1）
- 生长在培养基细胞与微量元素，无机盐，维生素，并特别标明的碳基板是最佳途径调查。要么摇瓶或生物反应器细胞培养使用。有机营养物质，如酵母提取物，可能会干扰测量氨基酸的标签，因此不能在培养基中。
- 文化在一个最佳的波长（例如，外径730 Cyanothece 51142）的光密度与紫外/可见分光光度计监测细胞的生长。
- 可以先进行细胞生长在一个非标记的媒介。中间日志生长期细胞接种量接种率（3％（V / V））的标记介质的首选。标记的文化应该是在同一标记的介质，从最初的接种，以避免非标记的碳子培养（3％V / V接种比例）。
- 收获子培养的细胞液（10ml）在中间通过离心（10分钟，8000 ×克）日志增长阶段。
- 6M盐酸1.5ml的悬浮颗粒，并转移到一个透明的玻璃，螺丝顶GC小瓶。第小瓶，放置24小时，他们在100 ° C烘箱生物量的蛋白质水解成氨基酸。生物质颗粒的水解可以产生20种常见氨基酸（图2）5 16 。半胱氨酸和色氨酸被降解，谷氨酰胺和天门冬酰胺，谷氨酸和天门冬氨酸，分别被转换。
- 氨基酸溶液在20000 × g下离心5分钟用2毫升Eppendorf管，上清转移到新的GC小瓶。这一步水解液中删除的固体颗粒。
- 卸下GC小瓶盖子和样品完全干下的空气流使用一个的Thermo Scientific Reacti - VAP蒸发器（注：冷冻干燥机，也可以采用tO）干样。这一步可以一蹴而就。
3。氨基酸衍生GC - MS条件
氨基酸或充电/高度极性的代谢产物通过气相色谱分析要求，这些代谢物的衍生物，使氨基酸波动，并可以由气相色谱 2分离。
- 溶于四氢呋喃（THF）与150μL和150μL的N -（叔丁基二甲基）N - methyltrifluoroacetamide衍生化试剂的干燥样品。
- 所有样品° C为1小时65和80之间的烤箱或水浴孵育。涡偶尔确保样品瓶中的代谢产物被溶解。
- 样品在20000 × g离心10分钟，然后将上清转移到新的GC小瓶。上清应该是一个明确的和黄的解决方案。由于探测器的饱和度，气相色谱 - 质谱测量精度可能会受到高concentration注入TBDMS衍生氨基酸（这些样品往往显示深褐色），因此，我们应该淡化这些样品使用四氢呋喃前的GC - MS测量6。
- 分析样品的GC - MS（1:5或1:10的分光比，注射量= 1μL，载气为氦气= 1.2毫升/分钟）。使用下面的GC程序升温：保持在150 ° C 2分钟，增加3 ° C每分钟到280 ° C，增加在20 ° C每分钟300 ° C，然后按住5分钟。溶剂延迟可以设置为〜5分钟（30米GC柱）。质量电荷比（M / Z）在MS范围可设置在60和500之间。
4。 GC - MS数据分析
- TBDMS衍生氨基酸的测量，也可以受GC分离同位素歧视。轻同位素移动速度稍快比GC柱升沉同位素。为了减少潜在的测量偏差，我们可能平均整个质谱氨基酸峰值范围6
- 气相色谱和质谱TBDMS衍生代谢物已报告7日前。 GC保留时间，并为每个氨基酸独特的M / Z峰，如图3所示。
- 氨基酸或中央代谢产物的衍生引入了大量包括自然标记同位素13℃（1.13％），18 O（0.20％），29 SI（4.70％），和30的Si（3.09 ％）。从原料质量isotopomer频谱的天然同位素的测量噪声可以修正通过发布的软件5， 8。最后的同位素标记数据报告质量分数，例如，M 0，M 1，M 2，M 3 和 M 4（代表包含零4个 13 C标记的碳的片段）。
- 氨基酸的测定，可提供约8个关键的前体代谢物同位素标记信息：2 - 羰基- glutar吃了，3 - P -甘油，乙酰辅酶A，erythrose - 4 - P，草酰乙酸，磷酸，丙酮酸，和核糖- 5 - P。这些代谢产物的标签模式可以被用来确定几个中央代谢途径（图2）9。标记实验的结果可以得到进一步证实，用生物化学方法（如RT - PCR）。
5。使用标记的氨基酸数据的途径分析
通过调查只有少数关键从精心设计的13 C示踪实验制作的氨基酸，我们可以发现几个独特的途径或酶的活动，而无需执行复杂13的C代谢通量分析整个中央代谢。
- 恩特纳Doudoroff途径：[1 - 13 C]葡萄糖作为碳源。如果通路被激活，丝氨酸标签将明显比10丙氨酸标签。
- 支TCA循环：[1 - 13 C]丙酮酸，可作为碳源。如果TCA循环被打破，天门冬氨酸，可以由两个碳原子标记，而谷氨酸是只有一个碳11，12标记。
- CO 2固定在混合营养代谢卡尔文-本森Bassham周期：非标记的CO 2和标有碳基板都被用作碳源。如果卡尔文循环功能，丝氨酸和组氨酸标签将被显著稀释，比其他氨基酸。这种方法可以相对确定的CO 2固定时，有机碳的来源，目前在中13。
- 氧化磷酸戊糖途径：[1 - 13 C]葡萄糖作为碳源。如果通路被激活，非标丙氨酸将大于50％，12。
- Anaplerotic途径（例如，人教版+ CO 2 A草酰乙酸）：13 CO 2和非标记的碳基板（例如，甘油或PYRuvate）可以用来作为碳源。如果途径是积 极的，天门冬氨酸标签将显著丰富，比较丙氨酸，丝氨酸13。
- 重新柠檬酸合酶：[1 - 13 C]丙酮酸，可作为碳源使用。如果激活酶，谷氨酸标记β-羧基3，4。
- Citramalate途径：[1 - 13 C]丙酮酸，[2 - 13 C]甘油，或[1 - 13彗星]醋酸可作为碳源。如果通路被激活，亮氨酸和异亮氨酸标签的金额是相同的 14 。
- 丝氨酸-异柠檬酸裂合酶循环：[1 - 13 C]丙酮酸或[1 - 13彗星]乳酸可以作为碳源。如果通路被激活，在第三的位置碳丝氨酸将被标记为15。
- 利用营养素（即外源性氨基酸）：一个完全标记的碳基板和非标记的氨基酸的培养基可以使用。如果细胞选择性地利用这些非标补充养分，我们将看到这些氨基酸在生物量的显著标签稀释。这种方法可以用来研究细胞16首选营养补充剂。
6。代表性的成果
最近生物能源的研究，在使用新的光合微生物的生物能源生产恢复的利益和CO 2捕获。在过去的几年中，不少13C -代谢分析，包括先进的13C代谢通量分析（13C - MFA），已被应用于调查中央光合细菌的代谢，因为中央的代谢途径的生化知识是没有依据在这些非模型生物体10，11，17-20。在这里，我们目前的一个备用异亮氨酸途径Cyanothece发现51142 21的例子。青色othece 51142不含有酶（EC 4.3.1.19，苏氨酸氨酶），苏氨酸转化为2 - ketobutyrate催化典型的异亮氨酸合成途径。要解决的异亮氨酸的途径，我们成长在ASP2 中等 22 Cyanothece 51142（20毫升）与甘油（2 - 13C，> 98％）54毫米。Cyanothece 51142 采用了第二的位置标示为主要碳源的甘油。我们观察到，苏氨酸和丙氨酸有一个标记的碳，而异亮氨酸是与三个碳原子标记。因此，在Cyanothece 51142合成不能被来自受聘于大多数生物体（图4）中苏氨酸路线。另一方面，亮氨酸和异亮氨酸具有相同标签的基础上的片段模式（M - 15）+片段（M - 159）+ 。例如，从isotopomer数据[M - 15] +（含不分段氨基酸）相同的标签显示为亮氨酸（M0 = 0.01，货币供应量M1 = 0.03，M2 = 0.21，M3 = 00.69）和异亮氨酸（M0 = 0.01，M1 = 0.03，M2 = 0.24，M3 = 0.67）。因此，必须从相同的前体（即丙酮酸和乙酰辅酶A）合成亮氨酸和异亮氨酸。这个观察citramalate异亮氨酸合成途径中的标有“低碳转型是一致的。为了证实这一途径，我们搜索的联合基因组研究所数据库，并找到一个citramalate 合酶 CIMA（cce_0248） 在 Cyanothece存在。
图1 13 C辅助途径分析步骤。
图2用于收购其代谢的前体的标签模式的氨基酸。 ACOA，乙酰辅酶A; AKG，α-酮戊二酸; C5P，核糖-5 - 磷酸;企业所得税，柠檬酸; E4P，erythrose 4 - 磷酸; G6P，葡萄糖-6 - 磷酸;高龄津贴，草酰乙酸;人教版，磷酸;美巡赛，3 - 磷酸; PYR，丙酮酸。
图3。气相色谱峰为16个氨基酸。 TBDMS衍生氨基酸破获两个片段：由MS（M - 57），包含整个氨基酸，和（M - 159）+，缺乏α氨基酸的羧基。亮氨酸和异亮氨酸，（M - 57）+其他的质谱峰重叠。我们建议使用片段（M - 15）+分析整个氨基酸标签。 （F302）+组进行检测，大多数氨基酸，其中包含仅在第（α-羧基组）和氨基酸骨干的第二个碳原子。因为这ms峰值往往具有较高的噪声信号的比值，（F302）+不建议 7代谢通量定量分析。
igure 4“/>
图4。异亮氨酸途径Cyanothece 51142（从我们以前的文件修改）21标签转换。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议包括一个标记底物喂养的细胞，并测量通过GC - MS的氨基酸造成的同位素标记模式。由于MS数据（M / Z的比率），只是标签的MS离子的总金额，我们必须评估检查不分段（M - 57）+的m / z比值和零散的氨基酸的氨基酸isotopomer分布（即（M - 159）+（F302））。此外，我们可以执行几个细胞培养与化学相同的媒介，但有不同的标签模式（1 ST标记的位置，第二位置标示等）的基板。关于这些实验的代谢产物的标签信息可以集成解码实际的低碳转型路线，通过中央代谢途径。
通路分析，选择一个标记底物是重要的。在一般情况下，单独标记的碳基板是EASIER使用跟踪标记的碳的命运时，通过中央通路13彗星浸透，而多碳标记基板可能混淆碳跟踪。此外，单标记基板更多的信息，统一标记基板澄清独特的分子结构中的代谢产物。，例如，柠檬酸合酶（重）型显示正常的柠檬酸合成酶的不同反应的立体化学，从而使柠檬酸有不同的分子手性。另一方面，基板，在不同的适用性检测及其相关的途径。葡萄糖是最好的检测之间的糖酵解和磷酸戊糖途径的分裂比例，而丙酮酸或醋酸分析TCA循环和一些氨基酸途径。因此，有必要使用不同的基板，以探讨细胞代谢的大局。
碳同位素13日标签是一个有用的技术，确定在微生物功能的途径。然而，这项技术有几个限制： 第一 ， 只适合使用有机基质的碳代谢的分析，因为它不能直接解决自养代谢的代谢，如果CO 2作为唯一碳源。自养文化，用CO 2标签作为输入 12的CO 2 / 13 CO 2 混合 23所有氨基酸相同的程度。这使得通路分析困难的，因为代谢分析，推断出不同的代谢途径，代谢产物中的碳13 重排，第二，本文提出了完全定性结果之间“积极”和“非活跃”的途径歧视。精确量化的代谢需要一个复杂的建模方法（即，
最后，越来越多的非模型的微生物物种的基因组序列正在每年出版。然而，这些物种的功能特性的基因组测序的步伐远远落后于 13 C标记方法可以发挥重要的作用，在许多非模式生物的代谢途径的确认和发现。此外，标签信息可集成与代谢模型（13 C - MFA）在微生物25破译的绝对碳通量。因此，这种技术可广泛用于分析有关生物燃料的生物系统，ecologiCal和医疗应用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由美国国家科学基金会职业格兰特（MCB0954016）和能源部生物能源研究资助（DEFG0208ER64694）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | - |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | - |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | - |
| GC Columns | J&W Scientific | DB5 (30m) | - |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | - |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TS-18825 | For drying amino acid samples |
References
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
- Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
- Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
- Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
- Wittmann, C.
- Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
- Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
- Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
- Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
- Tang, K. -H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
- Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
- Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
- Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
- Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , Forthcoming (2011).
- Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
- Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
- Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
- Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
- Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
- Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
- Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U.
