Summary
Se presenta un método para el uso de espectrometría de masas MALDI y la química de la metilación reductiva para cuantificar los cambios en la metilación de la lisina.
Abstract
Recientemente, los reguladores epigenéticos se han descubierto como actores clave en muchas enfermedades diferentes 1-3. Como resultado, estas enzimas son los principales objetivos para los estudios de moléculas pequeñas y 4 desarrollo de fármacos. Muchos reguladores epigenéticos sólo recientemente se han descubierto y todavía están en proceso de ser clasificados. Entre estas enzimas son desmetilasas lisina que eliminan los grupos metilo de lisinas de las histonas y otras proteínas. Debido a la naturaleza novedosa de esta clase de enzimas, ensayos de pocos se han desarrollado para estudiar su actividad. Este ha sido un obstáculo en el camino tanto para la clasificación y el estudio de alto rendimiento de desmetilasas histonas. Actualmente, los ensayos desmetilasa existen muy pocos. Las que existen tienden a ser de naturaleza cualitativa y no se puede al mismo tiempo discernir entre los estados de metilación de lisina diferentes (un-, mono-, di-y tri-). La espectrometría de masas se utiliza comúnmente para determinar la actividad desmetilasa pero los ensayos actuales de espectrometría de masasno abordar si péptidos diferencialmente metilado ionizar diferente. Ionización diferencial de péptidos metilado hace comparando los estados de metilación difícil y ciertamente no cuantitativa (Figura 1A). Así, los ensayos disponibles no están optimizados para el análisis integral de la actividad desmetilasa.
Aquí se describe un método llamado MassSQUIRM (cuantificación de espectrometría de masas utilizando metilación reductiva isotópica) que se basa en la metilación reductiva de grupos amina con formaldehído deuterado para forzar a todos lisinas ser di-metilado, lo que les hace esencialmente las mismas especies químicas y por lo tanto ionizar el misma (Figura 1B). La única diferencia química después de la metilación reductiva es hidrógeno y deuterio, que no afecta a la eficiencia de ionización MALDI. El ensayo MassSQUIRM es específico para los productos de reacción con desmetilasa lisinas un-, mono-o di-metilados. El ensayo es también aplicable a metiltransferasas lisina dando el saMe productos de reacción. Aquí, se utiliza una combinación de la química metilación reductiva y espectrometría de masa MALDI para medir la actividad de LSD1, un desmetilasa lisina capaz de eliminar di y mono-metil grupos, en un sustrato peptídico sintético 5. Este ensayo es simple y fácilmente susceptibles a cualquier laboratorio con el acceso a un espectrómetro de masas MALDI en el laboratorio oa través de una instalación de la proteómica. El ensayo tiene ~ 8 veces el rango dinámico y es fácilmente escalable para formato de placa 5.
Protocol
Este protocolo se ha modificado de Blair et al. 6.
1. LSD1 desmetilación Ensayo
- En un volumen final de 20 l, se combinan 125 LSD1 recombinante ng con 0,25 g de di-metilo histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) en tampón desmetilasa (50 mM Tris-Cl, pH 8,5, KCl 50 mM, 5 mM de MgCl 2, 5% glicerol). Además, realizar un control de péptido solo sin enzima. El control es de la sección 3 y no necesita la metilación reductiva.
- Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
- Para recoger los péptidos, añadir 8 POROS l R2 20 micras perlas a cada muestra y agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Preparar perlas POROS suspendiendo 1 volumen de perlas con un volumen de metanol, y luego añadir 10 volúmenes de 5% de ácido fórmico / 0,2% de TFA.
- Condición dos C 18 ZipTips de aspiración 20 l de TFA al 0,1% en la punta y empujando hacia atrás con una pipeta. Hacer esto dos veces con 0,1% TFA, cuatro veces con 70% acetonitrilo / 0,1% TFA, y cuatro veces de nuevo con 0,1% de TFA.
- Coloque las dos muestras (control y la reacción desmetilasa) en los condicionados C 18 ZipTips pipeteando la suspensión cordón detrás de la resina de C 18 en los ZipTips y empujando el volumen a través de una pipeta.
- Lavar ZipTips dos veces con 20 l de TFA al 0,1%.
- Eluir en 40 l de 70% acetonitrilo / 0,1% de TFA.
- Liofilizar cada eluyente por completo con un concentrador SpeedVac.
2. La metilación reductiva
Esta porción del protocolo es una modificación de Blair y cols. Y Rayment et al. 6,7.
- Vuelva a suspender la reacción desmetilasa en 100 l de tampón fosfato 50 mM, pH 7,4.
- Para la reacción desmetilasa, añadir 8 l de 15 mg / ml de borano de dimetilamina. Borano dimetilamina se disolvió en tampón fosfato 50 mM, pH 7,4, para dar el 15 mg / ml de solución madre.Esto debe hacerse fresco.
- Para la reacción desmetilasa, añadir 16 l de formaldehído 250 mM deuterado. El formaldehído 250 mM deuterado se prepara diluyendo el stock en H 2 0. Esto debe hacerse fresco.
- Incubar a 4 ° C durante 2 horas.
- Repita los pasos 2.2, 2.3 y 2.4.
- Repita el paso 2.2.
- Incubar a 4 ° C durante ~ 15 horas.
- Para la muestra desmetilasa, añadir 12,5 l de Tris 1M, pH 7,4 para sofocar la reacción de metilación reductiva.
3. Espectrometría de masas MALDI
- Añadir POROS R2 20 micras cuentas a la reacción desmetilasa, y se acumulan en ZipTips como se describe en los pasos 1.3-1.6.
Nota: Re-suspender el control en 100 l de tampón fosfato 50 mM, pH 7,4 y tratar como la otra muestra de partida en la etapa 3.1.
- Eluir el control y muestras desmetilasa de reacción de los ZipTips sobre una placa de muestra MALDI usando 2 l de 33% saturard ácido 2,5-dihidroxibenzoico. Para preparar el 33% de ácido 2,5-dihidroxibenzoico, hacer una solución saturada de ácido 2,5-dihidroxibenzoico en 70% de acetonitrilo / TFA al 0,1% y luego se diluye hasta 33% saturado en 70% de acetonitrilo / TFA al 0,1%. Permitir que las muestras eluidas a secar y cristalizar.
- Recoge los espectros de masas con un PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF espectrómetro de masas de alta resolución o disposición de espectrometría de masas MALDI 8,9,10.
- Ver espectros y extraer áreas de los picos que utilizan el software PerkinElmerSciex TOFworks o software proporcionado por el fabricante del espectrómetro de masas.
- Verifique que los productos de reacción por MS 2 con un sistema de espectrometría de masa disponible que proporciona capacidades de espectrometría de masas en tándem.
4. Análisis de Datos
- Con el fin de compensar el solapamiento isotópicos creados mediante el uso de formaldehído pesada (Figura 1B), determinar el área del pico (A) de 13 C 2 y 13 C relativ 4 isótopose para el pico monoisotópico para la muestra de control, que no ha sufrido metilación reductiva (Fig. 2A).
La ecuación 1: 13C2 / A 12C = r 1
La ecuación 2: 13C4 / A 12C = r 2
Esto le dará la relación de péptido que existe en estos estados isotópica (r 1 y r 2) específica para su experimento y espectrómetro de masas. - Utilice la r 1 y los valores de r 2 en las siguientes fórmulas para cuantificar la cantidad relativa de péptido existente en cada estado modificación en la muestra de reacción desmetilasa (Fig. 2B):
La ecuación 3: H3K4me2 = A-1
La ecuación 4: H3K4me = A 2 - R 1 (A 1)
La ecuación 5: H3K4 = A 3 - r 2 (A 1) - [r 1 (A 2 - R 1 (A 1))]
5. Los resultados representativos
Usando LSD1, se muestra la eficacia de MassSQUIRM para cuantificardesmetilación lisina. Como se describe en la sección de texto del protocolo, se realizó un ensayo desmetilasa con 125 ng de LSD1 y 0,25 g de di-metilo histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina). El control y las muestras de desmetilasa reacción fueron sometidos a la metilación reductiva y espectrometría de masa MALDI. La reacción de control que no se sometieron a la metilación reductiva mostró la envoltura típica isotópica para este péptido y proporcionan áreas de los picos de las ecuaciones 1 y 2 (Figura 2A). El espectro de masas para la reacción desmetilasa proporcionan áreas de los picos de las ecuaciones 3-5 (Figura 2B). Uso de las áreas de los picos del control y la reacción desmetilasa, se determinó que el péptido LSD1 desmetilado para dar a los productos de reacción siguientes: el 33,7% di-metil Lys4, el 42,3% de mono-metil Lys4, y el 24% de la ONU-metilado Lys 4. Consulte a Blair et al. Para el análisis completo de la actividad LSD1 desmetilasa, así como inhibidores de 6 estudios. Nótese que las variables cambiantes, tales como, el tiempo de reacción de la enzimala concentración de la concentración y el sustrato que permitirá un análisis en profundidad de la actividad.
Figura 1. Visión MassSQUIRM. (A) Un péptido N-terminal de la histona H3 se muestra como siendo sin-(verde), mono-(rojo), o di-(azul) metilado en lisina 4. La variación en la composición química de cada péptido conduce a la ionización diferencial haciendo complejo cuantificación. (B) metilación reductiva convierte todos los residuos de lisina en el estado de di-metilo que provoca que todos los péptidos para ionizar de manera similar. El uso de formaldehído pesado en la reacción de metilación reductiva permite la retención de la identidad de la metilación original. Los círculos vacíos indican metilación luz, mientras que los círculos cerrados indican metilación pesado. Modificado de Blair y cols. 2011 6.
Figure 2. MassSQUIRM puede utilizarse para cuantificar péptidos diferencialmente metilado. (A) Un di-metilado sintético histona H3 péptido (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) se analizó mediante espectrometría de masas y los coeficientes máximos relativos al pico monoisotópico se observó como r 1 y r 2 en las ecuaciones 1 y 2. (B) El péptido sintético mismo se incubó con 125 ng LSD1 en tampón desmetilasa de dos horas a 37 ° C. Las muestras se sometieron entonces a MassSQUIRM análisis. Una población mixta de superposición de picos representa los tres estados diferentes de metilación como se ve en la Figura 1B. Las áreas bajo los picos monoisotopic se observa como A 1, A 2 y A 3. Áreas de los picos se utiliza en las ecuaciones 3-5. Los círculos vacíos indican metilación luz, mientras que los círculos cerrados indican metilación pesado. Modificado de Blair y cols. 2011 6.
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Discussion
MassSQUIRM es un método económico y cuantitativo para el análisis integral de la actividad de la lisina desmetilasas involucrados en mono-y di-metilación. MassSQUIRM ofrece cuantificación no sólo del producto de la reacción, sino también para los productos intermedios. Este ensayo se puede utilizar como una poderosa herramienta en el estudio del mecanismo de desmetilasas histonas LSD1 y otros. También será útil para la clasificación de muchos recién descubiertos enzimas desmetilasa lisina como PHF8 y podrían ser utilizados para ciertas enzimas metiltransferasa.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias al Fondo para UAMS Proteómica para el apoyo de espectrometría de masas. Los fondos para este proyecto fue proporcionado por el NIH subvenciones P20RR015569, P20RR016460 y R01DA025755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 | |
| H3K4me2-biotin peptide | Prepared in Lab | none | |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 | |
| C18 ZipTip | EMD Millipore | ZTC18M | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28904 | |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A996 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 85707 | |
| Borane dimethylamine | Sigma-Aldrich | 180238 | |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP154 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Formic acid | Fluka | 06440 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| Na-phosphate | Fisher Scientific | BP329 | |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 | |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmer, Inc. | none |
References
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T.
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
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- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
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