Summary
我们已经优化了微胶囊技术作为一种有效的繁殖和胚胎干细胞分化为内胚层和多巴胺（DA）神经元的3D平台1。它还提供了一个机会，从宿主细胞移植过程中的免疫隔离。这个平台可以适应其他类型的细胞。
Abstract
人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）正在成为一个有吸引力的替代细胞替代治疗源，扩大在文化，因为它们可以无限期地在身体的任何类型的细胞分化。不同类型的生物材料也被用于干细胞培养提供了一个微环境，模仿的干细胞小生境1-3。后者是重要的促进提供一个三维（3D）环境中，如封装4细胞与细胞间的相互作用，细胞增殖，分化成特定的谱系，以及组织机构。 2三维文化的半渗透膜的范围内对细胞封装的原则，涉及诱捕的活细胞。这些膜允许交换横跨膜的营养物质，氧气和刺激，而从主机比胶囊孔径大的抗体和免疫细胞被排除。在这里，我们预文化派的做法和三维使用海藻酸钠微囊微环境中的人类胚胎干细胞多巴胺神经元分化。我们已经修改了培养条件，以加强封装的人类胚胎干细胞的可行性。我们先前已经表明，除了显着增强的3D平台盘绕线圈P160-Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Y-27632和人类的胎儿成纤维细胞调节血清更换介质（HFF-CM）封装的人类胚胎干细胞的可行性在细胞中表达明确的内胚层标记基因1。我们现在已经传播到人类胚胎干细胞高效分化的多巴胺神经元用于这个3D平台。多巴胺神经细胞分化的最后阶段后，蛋白和基因表达分析表明酪氨酸羟化酶（TH）的表达增加，多巴胺神经元的标志，> 2周后的100倍。我们假设，我们的3D平台，使用海藻酸钠微囊可能是有用的，以研究细胞增殖和定向分化人类胚胎干细胞，以不同的谱系。这个3D系统还允许从人类胚胎干细胞饲养层细胞的分离，并在分化过程中，也有可能在将来移植免疫隔离。
Protocol
下面所有的程序进行了II级生物安全柜内部使用无菌技术。在下表中列出所用的试剂和设备。
1。 1.1％的海藻酸钠的制备（W / V）
- 加入纯化的海藻酸钠0.275克（高葡萄糖醛酸含量≥60％，粘度> 200 MPa级小号，内毒素≤100 EU / G）在无菌的50毫升管，并添加25毫升无菌0.1％的明胶溶液，提前准备（0.5 gelatin/500毫升的Milli-Q H 2 O和由蒸压溶解）。
- 涡管约30秒，部分溶于海藻酸钠粉，然后将其放置在10 XG过夜轨道混频器管（室温）。
- 新增的9％无菌氯化钠（4.5克）NaCl/50毫升的Milli-Q H 2 O 2.778毫升至25毫升海藻酸钠溶液。涡管约30秒，随后5分钟离心95 XG。
- 存储海藻酸钠溶液在4°，C为短期存储（1-2月），或在-20°C长期存放（约一年）。
2。制备氯化钙沉淀浴
- 在1公升的Milli-Q H 2 O溶解14.7克氯化钙2·2H 2 O和2.38肝素钠Ğ
- 调整pH值至7.4。
- 使用0.22微米的过滤消毒的解决方案。
- 可存放在室温（6-12个月）降水浴。
3。解压缩解决方案的准备
- 在500毫升杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D - PBS），0.5M EDTA的添加50毫升和5毫升1M肝素钠。
- 消毒用0.22微米的过滤器或釜，在121°C间为20分钟。
- 储存在室温（6-12个月）的解压缩解决方案。
4。制备血浆置换（SR）中等
- 封装之前，提前准备为德SR介质scribed表在特定的试剂和设备。
5。 ROCK抑制剂的制备（Y 27632）
- Y型27632粉稀释在0.1％的人血清白蛋白（HAS）的D-PBS使一个5毫米的解决方案。
6。人类胚胎干细胞制备的封装
- 治疗前与补充两个小时，在37℃（避光）岩石抑制剂（RI）与10微米的培养媒体的细胞。
- 国际扶轮治疗后，的D-PBS洗细胞两次，并打跑的细胞培养板，10分钟accutase酶在37°C
- 用吸管或细胞刮刀轻轻刮去细胞，并收集了15毫升管。抵消accutase SR 1:1的比例中等。
- 要准备一个单细胞悬液，使用40微米过滤器过滤瓦解细胞和收集在一个新的50 mL离心管。
- 计算解决方案在使用血球细胞的总数。 细胞悬液，离心95 XG为5分钟和精心弃上清事后。预热的0.9％氯化钠冲洗细胞。 95 XG和离心5分钟，弃上清。
7。单元封装
- 准备1毫升注射器连接到14G×2“静脉导管软塑料管，这是用来吸装上注射泵，如在图1所示的细胞悬液。
- 悬浮预热的海藻酸钠溶液的细胞密度在125万细胞/毫升海藻酸钠。用注射器轻轻混匀，避免产生气泡。
- 成立珠发生器，注射泵和空气流量计，如在图1所示。特定的试剂和设备表中列出了这些设备的更多细节。
- 到注射器抽吸细胞，静脉导管丢弃的塑料管和注射器连接到封装机。确保有10厘米的缝隙之间最终的封装机和集合点，如在图1所示。
- 细胞封装，通过设置在20毫升/小时，8 L / min的空气流速和压力为100 kPa（胶囊的大小可以通过改变空气流量变化）注射泵。
- 收集到包裹细胞培养皿充满20毫升预热的7分，以稳定胶囊降水浴（100×15毫米）。
- 包裹细胞转移到50 mL离心管填充20毫升0.9％氯化钠温柔的愿望。
- 允许胶囊定居到试管底部，然后轻轻地弃上清。重复洗涤过程中，用0.9％氯化钠。
- 包裹细胞悬浮预热的培养辅以RI（10μM），转移到培养瓶中，并在37°C / 5％CO 2孵育介质。
8。封装的人类胚胎干细胞分化为多巴胺神经元
ve_content“>封装的人类胚胎干细胞分化前3天的国际扶轮治疗。- 鼠标种子的基质细胞系，PA6的细胞密度1.0×10 4每平方厘米 0.1％明胶涂层的T75瓶，条件尼龙细胞中多巴胺神经分化培养基的分化前24小时（材料表）。
- 胶囊转移至50 mL离心管中，并允许他们定居到试管底部。
- 弃上清，PA6的细胞调节DA神经分化培养基中悬浮粒。
- 文化与PA6的28天与第4天的媒体的变化和隔日（9×10 6每7.5×10 5 PA6的细胞的人类胚胎干细胞）细胞单层封装后人类胚胎干细胞（中等每次只改变的一半）。
- 经过3周的文化与PA6细胞，补充的DA神经分化培养基100毫微克/毫升SHH和100毫微克/毫升FGF8a余下的一周。
9。解封的封装人类胚胎干细胞
- 到15 mL离心管吸胶囊，并允许他们定居在试管底部。然后小心弃上清。
- 胶囊的D-PBS洗两次。让胶囊收于试管底部，然后取出上清液。
- 添加5毫升胶囊解封的解决方案。彻底混合暂停之前，通过吸入孵化室温度为4-5分钟。
- 离心3分钟95 XG的解封细胞，弃上清。
- 洗颗粒细胞的D-PBS离心3分钟，95 XG。重复。
- 解封的细胞可以进一步培养的单层或用于下游分析。
10。代表结果
海藻酸钠微胶囊的直径为400-500微米。胶囊内的细胞数量是估算通过计算细胞总数除以每运行胶囊总数。因此，估计约5.0×10 4个细胞胶囊。由此，我们推测细胞胶囊可以包含的最大数量为约1.0×10 5。封装的人类胚胎干细胞的生存能力是> 80％（图2）使用羧基双乙酸钠succinimidly酯（CFDA）/碘化丙啶（PI）的检测来确定。我们已经优化了人类胚胎干细胞封装的条件下，通过减少海藻酸钠的浓度从2.2％下调至1.1％，并通过改变降水浴氯化钡氯化钙。从这些条件，我们发现，只有1.1％海藻酸钙包裹细胞可以存活，增殖并形成胚在体外 1。进一步优化的条件下，培养媒体和RI的影响，Y 27632进行了调查。图2和3的数据表明，国际扶轮preventeð分离，诱导细胞凋亡，并保持细胞活力，促进集群形成1,6。此外，封装的人类胚胎干细胞培养HFF - CM +注册机的存活率显着高于没有注册机补充的其他组高，但是这是没有显着不同封装的人类胚胎干细胞培养的SR +注册机。同样，细胞增殖的BrdU检测单细胞发展成集群（图3）从25％提高到75％。凋亡TUNEL检测显示，在SR培养基培养的微囊单细胞凋亡（数据未显示），而HFF-CM检索集群大多TUNEL法负。在一定程度上，与碱性成纤维细胞生长因子补充HFF - CM也促进了中的Y-27632的情况下生存和封装的胚胎干细胞的增殖。然而，与Y-27632（2小时）治疗前和后封装（额外4天）明显增强活力，增殖和集群封装的人类胚胎干细胞的形成1.1％海藻酸钙微胶囊。
以前，我们表明，封装人类胚胎干细胞可以成功地分化明确的内胚层1。在这里，我们研究应用细胞封装，三维封装的人类胚胎干细胞分化成多巴胺神经元的平台。人类胚胎干细胞，形成胚体（EB），胶囊直接分化后2-3天的文化所描述的条件下解封表明一个渐进的神经元的形态（图4）超过90％的存活率。基因表达分析表明下调的多能干细胞的标记，OCT4标记neuroprogenitor，PAX6的多巴胺神经元标记，TH，而分化后7天（图5A）上调。免疫荧光染色显示分化的人类胚胎干细胞是在7天的PAX6的阳性（> 80％），但的OCT4负。进一步分化的人类胚胎干细胞显示，经过21天的TH阳性（> 90％）神经元（图5B）。 Western blot分析也表明上调TH的表达（图5C）从第14天，而PAX6的表达下调后21天。相比之下，细胞培养的二维（2D）的环境下，类似的条件下（如RI为2小时和RI治疗后治疗前3天前分化）保持了PAX6的阳性细胞的比例很高（> 80 ％），整个分化时期不区分封装（图5A和C）提供的3D环境中的TH阳性细胞（<60％）的有效。
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Discussion
利用小鼠胚胎干细胞和胚胎干细胞的一些研究已经证明，生物材料和组织工程2,3三维培养系统的好处。我们作为一个合适的3D平台研究钡海藻酸钠相比，人类胚胎干细胞的增殖和分化，自人类胚胎干细胞表现出显着高于可行性封装比钡海藻酸钠海藻酸钙海藻酸钙微胶囊。这种文化系统还允许一个高密度细胞培养和交流的营养和氧气穿过细胞膜7。胶囊内自发分化先前已观察到的，它被假定为未分化的胚胎干细胞继续增生胶囊内，细胞最终会突破胶囊和形式畸胎瘤1。另一个封装的临床应用，提供从主机收件人的移植细胞的免疫保护。据预计，移植胚胎干细胞和ThEIR衍生工具可能会导致免疫排斥反应，我以来的低水平表达MHCⅠ类抗原的未分化的胚胎干细胞分化后8增加。它也被记录在案移植通常采用高浓度的海藻酸钠为了规避免疫排斥反应的过程中，2,9。我们的研究使用低浓度的海藻酸钠（1.1％），这是更适合在体外培养和胚胎干细胞分化。它是尚未确定是否海藻酸钠的浓度较低，我们已经使用非法类似以前的报告，以及维持细胞活力，这些封装的人类胚胎干细胞移植免疫主机的免疫反应。
我们的用于封装人类胚胎干细胞的优化封装协议胶囊生产400-500微米直径的大小。这是小于400微米的胶囊往往有较少的细胞，而较大的胶囊（> 500微米）resul性T细胞人口过剩。人类胚胎干细胞封装，需要一个单细胞的形成，也促进细胞凋亡6。我们已经表明这里封装的人类胚胎干细胞可以继续生存，增殖和形成的EB。这是加强与国际扶轮前处理前的人类胚胎干细胞封装，造成> 80％的人类胚胎干细胞是可行的。因此，我们已经建立了一个模型来培养人类胚胎干细胞在三维培养条件，并已延长到DA能神经元定向分化的研究。虽然细胞封装技术已广泛用于细胞培养和内胚层分化，神经细胞分化，在这些条件下，已知尚未深入研究10,11。我们已经表明这里有PAX6的增加表达和TH基因和蛋白表达的分析，使用后7天在比较2D分化系统的3D环境，促进多能状态更好的多巴胺神经元系。然而，进一步分析SUC多巴胺分泌的测试和移植实验H的要求，充分体现了分化的细胞。有效地生成功能强大的多巴胺神经元细胞治疗帕金森氏病是一项基本要求，如果成为现实。我们如约与多巴胺神经细胞诱导，PA6的细胞多巴胺神经元分化的人类胚胎干细胞通过封装和高密度细胞培养系统共培养提出的3D平台是朝这个方向努力。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由NHMRC项目资助＃568969（PSS）和医学院，新南威尔士大学，干细胞的倡议。（KSS）支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
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